CN115403679A - 一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法及其应用 - Google Patents

一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法及其应用。所述方法为矮生栒子中加入水浸提，收集滤液并抽滤，浓缩，随后加入乙醇混匀，离心；取上层乙醇部分，浓缩，获得矮生栒子黄酮提取物；沉降物干燥后获得矮生栒子多糖提取物；所述浸提的温度为75～95℃；所述浸提的时间为40～60min。本发明采用水提醇沉法提取出了矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物并通过优化方法，获得最佳提取工艺，本方法操作简单，且不会对植物多糖的性质造成影响，能最大限度地保留其活性；获得的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物也具有良好的总抗氧化力、羟基自由基清除能力、DPPH清除能力。

Description

一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物提取物的技术领域，更具体地，涉及一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法及其应用。
背景技术
矮生栒子(学名：Cotoneaster dammerii Schneid.)是蔷薇科栒子属植物，属常绿灌木，常生不定根；小枝呈暗灰褐色。叶片质地坚韧、厚实，形状为椭圆形或椭圆长圆形；花药颜色为紫色。果实形似球体，颜色为鲜红色，通常具有4-5个小核。开花的时间为每年5～6月，结果时期长约10月。主要生长分布于四川、云南、贵州，海拔为1300～2600米的稀疏杂木林或多石山地。
现如今植物多糖的研究逐渐受到重视。科学实验研究表明，很多植物多糖具有生物活性，具有免疫调节、抗辐射、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗菌抗病毒、保护肝脏等保健作用。许多植物多糖可显著提高机体巨噬细胞的吞噬指数，并可刺激抗体的产生，从而增强人体的免疫功能；一些植物多糖对癌细胞具有很强的抑制作用，具有抗肿瘤活性；而某些植物多糖，如金针菇多糖、银耳多糖等可显著降低机体心肌组织的脂褐素的含量，增加脑和肝脏组织的SOD酶活力，从而起到延缓机体衰老的作用；某些多糖具有降低机体乳酸脱氢酶活性的作用，可使肝糖原含量显著增加而提高机体的运动能力，并使机体在运动后各项指标迅速恢复正常，因而具有抗疲劳作用等。
植物黄酮的功能作用也是多方面的，黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，是许多中草药的有效成分。适量摄入黄酮类化合物能减少癌症、肿瘤、心血管疾病、脂质过氧化以及骨质疏松等疾病的发病率。
“矮生栒子的分类学研究，周丽华，中国科学院昆明植物研究所”公开了在有关模式和产地标本研究的基础上结合叶表皮微形态和细胞学资料对矮生栒子进行了分类学修订。结果将C.dammeri Schneid.var.radicans Schneid.(即C.r adicans(Schneider)Klotz)归并作该种的同物异名；并描述了矮生栒子的1个新亚种C.dammerissp.songmingensis C.Y.Wu&Lihua Zhou。但是并未有现有报道或研究对矮生栒子中具有何种成分进行研究和分离，也并未公开矮生栒子提取物具有何种应用功效。
此外，现阶段常用的植物多糖方法有酸碱浸提、离子交换等方法，这些方法各有优劣，如酶辅助法提取条件温和，可明显提高植物成分的提取效率，但成本较高，微波辅助法能够提升释放多糖的速度，但超声作用时间过长会导致多糖的降分解，影响提取效率，如何对矮生栒子中的多糖进行提取，还能最大限度的保留其活性成为了现需解决的重要问题。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法，采用水提醇沉法提取出了矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物并通过优化方法，获得最佳提取工艺，本方法操作简单，且不会对植物多糖的性质造成影响，能最大限度地保留其活性；获得的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物也具有良好的总抗氧化力、羟基自由基清除率、DPPH清除率。
本发明的第二个目的在于提供上述方法制备获得的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物。
本发明的第三个目的在于提供矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物在制备抗氧化产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法，矮生栒子中加入水浸提，收集滤液并抽滤，浓缩，随后加入乙醇混匀，离心；取上层乙醇部分，浓缩，获得矮生栒子黄酮提取物；取下层沉降物干燥后获得矮生栒子多糖提取物；所述浸提的温度为75～95℃；所述浸提的时间为40～60min。
本发明提供了一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法，通过采用水提醇沉法对矮生栒子中的多糖和黄酮组分进行提取，方法操作简单，且不会对植物多糖的性质造成影响，能最大限度地保留其活性。本发明还以苯酚-硫酸法测定矮生栒子多糖提取物中多糖的含量，以芦丁比色法测定矮生栒子黄酮提取物中黄酮的含量，试验结果表明：矮生栒子中多糖和总黄酮的提取率可分别达到2.50％和1.34％。更进一步地，本发明还通过设置不同的梯度浓度测定提取物的总抗氧化力、羟基自由基清除率、DPPH清除率。试验结果表明：当矮生栒子多糖提取物、矮生栒子黄酮提取物的浓度为100mg/mL时，其分别的总抗氧化能力为3.155、0.463；羟基自由基的清除率分别为90.2％、88.5％；DPPH自由基清除率分别为93.8％、91.7％。这表明矮生栒子多糖提取物、矮生栒子黄酮提取物具有良好的抗氧化活性，可作为一种抗氧化剂。本发明可以为矮生栒子的开发和利用提供参考依据，为以后合理开发和利用矮生栒子这一宝贵中药资源提供理论依据和数据资料。
优选地，所述乙醇的浓度为70～90％。
优选地，所述浸提的温度为85～95℃。
优选地，所述浸提的时间为50～60min。
优选地，所述矮生栒子和水的料液比为1：5～10。
优选地，所述浸提的次数1～4次。
进一步优选地，为了获得更高的提取率，本发明提供了一种更优选地提取工艺条件组合：所述浸提的温度为85～95℃，所述浸提的时间为50～60min，所述矮生栒子和水的料液比为1：8～10，所述浸提的次数2～4次。
最优选地，所述提取工艺条件组合：所述浸提的温度为95℃，所述浸提的时间为60min，所述矮生栒子和水的料液比为1：10，所述浸提的次数3次。在该最优工艺条件组合下，提取矮生栒子粗多糖和总黄酮成分的提取率最高，采用苯酚-硫酸法和芦丁比色法测定提取物中矮生栒子粗多糖和总黄酮成分含量最高为38.4mg/g，二者分别为25.0mg/g和13.4mg/g。
进一步地，本发明还提供上述方法制备获得的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物。本发明通过对矮生栒子多糖提取物、黄酮提取物进行抗氧化活性研究，明确了矮生栒子的抗氧化性能随着药物浓度的增加而逐渐增大，呈现出明显的剂量依赖性，但当浓度高到一定值时，其总抗氧化能力、对羟基自由基的清除能力和DPPH自由基的清除能力趋于平稳。当矮生栒子多糖提取物、黄酮提取物的浓度100mg/mL时，其总抗氧化能力分别为3.155、0.463，对羟基自由基清除率分别为90.2％、88.5％，对DPPH自由基清除率分别为93.8％、91.7％。基于上述抗氧化作用，可预期地，本发明提供的矮生栒子多糖提取物或黄酮提取物可应用在食品、医药、保健品、美容等领域，也可为矮生栒子提取物的药理学活性研究提供数据支持。
优选地，所述抗氧化是指清除DPPH自由基和/或羟基自由基。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法，通过采用水提醇沉法对矮生栒子中的多糖和黄酮组分进行提取，方法操作简单，且不会对植物多糖和黄酮的性质造成影响，能最大限度地保留其活性。此外，当矮生栒子多糖提取物、矮生栒子黄酮提取物的浓度为100mg/mL时，其分别的总抗氧化能力分别为3.155、0.463；羟基自由基的清除率分别为90.2％、88.5％；DPPH自由基清除率分别为93.8％、91.7％。这表明矮生栒子多糖提取物、矮生栒子黄酮提取物具有良好的抗氧化活性，可作为一种潜在的天然抗氧化剂。
附图说明
图1为葡萄糖标准曲线。
图2为芦丁标准曲线。
图3为矮生栒子多糖、黄酮提取物的总抗氧化能力曲线。
图4为矮生栒子多糖、黄酮提取物的羟基自由基清除能力曲线。
图5为矮生栒子多糖、黄酮提取物的DPPH清除能力曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1.1试验药材
矮生栒子原料，风干后经过粉碎机粉碎15min成细碎粉末，备用。
1.2试验主要化学试剂
主要试剂见表1。
表1
Figure BDA0003887400630000041
Figure BDA0003887400630000051
1.3仪器设备
主要仪器设备见下表2。
表2
Figure BDA0003887400630000052
Figure BDA0003887400630000061
实施例1矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物的提取
准确称取50g干燥的矮生栒子粉末于250mL烧杯中，按照1：10(g/mL)的液料比加入蒸馏水，95℃下浸提3次，每次1h，合并滤液进行抽滤，用旋转蒸发仪将滤液浓缩后加入400～800ml的乙醇溶液(乙醇溶液的浓度为80％)，静置，待多糖沉降，进行离心；取上层的乙醇部分，浓缩至1mg/mL，获得矮生栒子黄酮提取物；沉降物干燥后得矮生栒子多糖提取物。
实施例2矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物最佳提取条件筛选
(1)矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物的正交试验
以实施例1的制备方法，采用正交设计法考察料液比(1：5，1：8，1：10)、提取温度(75℃、85℃、95℃)、提取次数(2次、3次、4次)和提取时间(40min、50min、60min)等因素对矮生栒子多糖提取物和矮生栒子黄酮提取物成分的影响，正交设计试验因素和水平如下述表3所示，正交设计试验结果如下述表4所示。
表3
Figure BDA0003887400630000062
表4
试验编号 A B C D 多糖和黄酮总含量(mg/g)
1 1 1 1 1 34.63
2 1 2 2 2 17.01
3 1 3 3 3 28.77
4 2 1 2 3 25.18
5 2 2 3 1 14.77
6 2 3 1 2 7.61
7 3 1 3 2 10.4
8 3 2 1 3 34.81
9 3 3 2 1 38.04
k1 26.80 23.40 25.68 29.27
k2 15.85 22.20 26.86 11.67
k3 27.87 24.93 17.98 29.59
R 12.02 2.73 8.88 17.91
由上表试验1～9可以得知，多糖和黄酮总含量为7.61～38.04mg/g；其中，试验9的多糖和黄酮总含量最高，多糖和黄酮总含量为38.04mg/g。从表3和表4的R值大小可以得知，不同因素对矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物成分提取效果的影响依次为提取温度>提取时间>提取次数>料液比。根据K值结果可得最佳提取工艺为A3B3C2D3，即料液比1：10，提取温度95℃，提取次数3次，提取时间60min。在该方法下提取矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物成分的效率最高，采用苯酚-硫酸法和芦丁比色法测定矮生栒子多糖和黄酮成分含量最高为38.4mg/g，二者分别为25.0mg/g和13.4mg/g。
同时，依照正交设计所得最优条件进行三组平行试验，试验结果见表5。得出结论最佳提取工艺为A3B3C2D3试验结果较为稳定，故此组合为最优提取条件。
表5
平行试验编号 1 2 3 平均值(mg/g)
含量(mg/g) 37.25 38.31 36.85 37.47±0.75
实施例3矮生栒子多糖提取物含量的测定
葡萄糖标准溶液的制备：精密称取葡萄糖对照品并配制为1mg/mL的葡萄糖溶液。用倍比稀释法，精密吸取100μL(浓度：1mg/mL、0.50mg/mL、0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL、0.0078125mg/mL、0.00390625mg/mL)的上述溶液于EP管中，分别加入加100μL标准苯酚-硫酸液。混合均匀，85℃水浴30min，结束后取200μL溶液于96孔酶标板，于酶标仪490nm处测定每一孔的吸光度。
将实施例1提取获得的矮生栒子多糖提取物配置为1mg/mL待测液，取适量加入5％苯酚水溶液1mL，浓硫酸5mL，定容摇匀后水浴85℃水浴30min，取200μL于酶标仪490nm处测定吸光度。通过葡萄糖标准曲线计算矮生栒子多糖提取物的含量。
如图1所示，为葡萄糖标准曲线，以葡萄糖作为对照品制定标准曲线，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，研究葡萄糖质量浓度与吸光度的线性关系，得到葡萄糖标准曲线方程，对应公式为y＝5.6623x+0.1448，R2＝0.9922。葡萄糖质量浓度与吸光度具有良好的线性关系，满足定量分析的要求，可用于矮生栒子多糖提取物含量测定。
根据公式计算出每1g矮生栒子生药材含有多糖25mg。
实施例4矮生栒子黄酮提取物含量的测定
精密称取芦丁对照品并配制为浓度1mg/ml的芦丁标准品溶液，将1mg/ml芦丁标准溶液按倍比稀释法稀释成1mg/mL、0.50mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL、0.0078125mg/mL、0.00390625mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取各浓度的标准溶液500μL，依次加入浓度为5％亚硝酸钠30μL混合均匀后，在室温下静止放置5min，加入浓度为10％硝酸铝30μL混合均匀后，在室温下静止放置5min，加入浓度为10％氢氧化钠400μL和40μL去离子水，混合均匀后，在室温下静止放置15min，分别取200μL于酶标仪502nm波长处测定每一孔的吸光度。
将实施例1提取获得的矮生栒子黄酮提取物取200μL溶液，于酶标仪502nm波长处测定吸光度。通过芦丁标准曲线计算出矮生栒子黄酮提取物中黄酮含量。
图2为以芦丁作为对照品制定标准曲线，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标。研究芦丁质量浓度与吸光度的线性关系。得到芦丁标准曲线方程y＝1.4885x+0.0651，R2＝0.9972，芦丁质量浓度与吸光度具有良好的线性关系，满足定量分析的要求，可用于黄酮含量测定。
根据公式计算出1g矮生栒子生药材含有黄酮13.4mg。
实施例5矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物总抗氧化力测定
实施例1中的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物，加入灭菌水，溶解，配置成100mg/mL的样品溶液，用倍比稀释法设置不同浓度，维生素C浓度为样品浓度的1％。分别取不同梯度浓度的样品10μL，加入pH为6.6的磷酸盐缓冲液20μL和浓度为1％的铁氰化钾溶液20μL，混合均匀后在50℃放置20min,加入浓度为10％的三氯乙酸溶液250μL混合均匀，取混合液25μL，加入25μL蒸馏水和浓度为0.1％氯化铁溶液25μL，混合均匀，在室温下静止放置10min，分别取200μL溶液于酶标仪700nm处测定光密度OD样品，以溶剂代替样品样作为空白对照OD空白。总抗氧化能力可以用ΔOD来表示。据公式计算出不同样品浓度的总抗氧化力。公式如下：ΔOD＝OD样品-OD空白
如图3所示，为矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物的总抗氧化能力曲线，从图3中可以看出，在3.125mg/mL～100mg/mL的浓度范围内，随着提取液浓度的增加，总抗氧化能力也在不断提高。当矮生栒子多糖、黄酮提取液浓度为100mg/mL时，矮生栒子多糖和黄酮的总抗氧能力达到3.155和0.463，此时总抗氧化力达到最大差距。本次试验中，当矮生栒子多糖、黄酮提取液浓度为3.125mg/mL时，最小的总抗氧化能力为0.0385和0.040。本次试验中说明了矮生栒子中的多糖、黄酮提取液都具有一定程度的抗氧化作用。
实施例6矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物羟基自由基清除能力测定
实施例1中的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物，加入灭菌水，溶解，配置成100mg/mL的样品溶液，用倍比稀释法确定样品的不同梯度浓度，维生素C浓度为样品浓度的1％。在试管中依次加入2mmol/L硫酸亚铁0.5mL，6mmol/L过氧化氢0.5mL摇匀后，再加入6mmol/L水杨酸1.5mL于37℃水浴中15min取出，取混合液100μL加入100μL纯水，测其吸光度OD空白。取混合液100μL分别加入不同浓度的样品溶液100μL摇匀，水浴继续加热15min，分别取出200μL溶液于酶标仪510nm测其OD值记为OD样品。根据公式计算出不同样品浓度对羟基自由基的清除能力。公式如下：羟基自由基清除率(％)＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％。
如图4所示为矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物羟基自由基清除能力曲线，从图4中可以看出，在0.39mg/mL～100mg/mL的浓度范围内，随着提取液浓度的增加，对羟基自由基清除能力也逐渐提升。当矮生栒子多糖和黄酮浓度为本次实验最大浓度时，与维生素C的对照相差较大。矮生栒子多糖和黄酮在相同的浓度下，两者对羟基自由基的清除率接近。当达到本次实验设置的最大的浓度时，清除率约达到20％。说明矮生栒子多糖和黄酮具有良好的羟基自由基清除能力。
实施例7矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物DPPH清除能力测定
实施例1中的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物，加入灭菌水，溶解，配置成100mg/mL的样品溶液，用倍比稀释法确定样品的不同的梯度浓度，维生素C浓度为样品浓度的1％。称取4mgDPPH粉末溶于4mL无水乙醇中充分摇匀，将DPPH配制为1mg/mL的溶液，4℃避光保存。取100μL样品加入100μL DPPH溶液。空白对照组和本底组分别以100μL纯水替代药物，无水乙醇替代DPPH溶液。置于37℃黑暗条件下30min后于酶标仪517nm处测定OD值。根据公式计算出不同样品浓度对DPPH的清除能力。公式如下：DPPH清除率(％)＝[OD空白-(OD样品-OD本底)]/OD空白×100％。
从图5中可以看出，在0.39mg/mL～100mg/mL的浓度范围内，随着提取液浓度的增加，对DPPH自由基清除能力也在不断提高。当多糖、黄酮提取液浓度为100mg/mL时，有最大的清除能力为93.8％、91.7％。与当多糖、黄酮粗提取液浓度为0.39mg/mL时，有最小的清除能力为31.3％、30.9％。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例为申请人真实试验结果加以论证。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种从矮生栒子中同时提取多糖和黄酮的方法，其特征在于，矮生栒子中加入水浸提，收集滤液并抽滤，浓缩，随后加入乙醇混匀，离心；取上层乙醇部分，浓缩，获得矮生栒子黄酮提取物；取下层沉降物干燥后获得矮生栒子多糖提取物；所述浸提的温度为75～95℃；所述浸提的时间为40～60min。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述浸提的温度为85～95℃。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述乙醇的浓度为70～90％。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述矮生栒子和水的料液比为1：5～10。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述浸提的次数1～4次。
6.根据权利要求1～5任一所述方法，其特征在于，所述浸提的温度为85～95℃，所述浸提的时间为50～60min，所述矮生栒子和水的料液比为1：8～10，所述浸提的次数2～4次。
7.根据权利要求6任一所述方法，其特征在于，所述浸提的温度为95℃，所述浸提的时间为60min，所述矮生栒子和水的料液比为1：10，所述浸提的次数3次。
8.权利要求1所述方法制备获得的矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物。
9.权利要求8所述矮生栒子多糖提取物和黄酮提取物在制备抗氧化产品中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述抗氧化是指清除DPPH自由基和/或羟基自由基。
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""响应面法优化平枝栒子多糖提取工艺研究"" *

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