CN112268976B - 一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的hplc指纹图谱的建立方法及指纹图谱 - Google Patents
一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的hplc指纹图谱的建立方法及指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法及指纹图谱，通过该方法能够将果实外形一致的同科同属的近缘物质区分开。指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：步骤一，采收掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子；步骤二，预处理：分别称取掌叶覆盆子果实和甜叶悬钩子果实各100~300 g，进行烘干10h处理，使其完全干燥，将烘干后的果实进行粉碎，并全部过四号筛，即得均一的两种样品粉末；步骤三，有效成分的提取；步骤四，HPLC指纹图谱的确定；步骤五，图谱的处理。该方法可以准确的区分掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子两个品种，具有方法简便、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于药材指纹图谱技术领域，具体涉及一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法及指纹图谱，通过该方法能够将果实外形一致的同科同属的近缘物质区分开。
背景技术
华东掌叶覆盆子Rubus chingii Hu为蔷薇科悬钩子属植物，果实和叶中含有丰富的营养物质，未成熟果实和根均可入药，主要分布于浙江、江苏、安徽、江西和福建等华东地区。华东掌叶覆盆子未成熟果实为常用中药覆盆子，被2015、2020版中国药典收入，具有益肾固精缩尿、养肝明目的功效，主要适用于遗精滑精，遗尿尿频阳痿早泄，目昏眼花等。
甜叶悬钩子Rubus suavissimus S.Lee是蔷薇科悬钩子属的一个新种，主要利用其叶制备成甜叶凉茶。2015、2020版中国药典均未对其进行收入，本品和掌叶覆盆子近缘，花较大，直径3-5厘米，花萼裂片较长，长7-10毫米，花瓣较大，长1.5-2.5厘米；叶5或7深裂，少见6裂或8裂，裂片披针形或椭圆形。甜茶提取物具有抗过敏、预防高脂性血症、降血糖等作用。
两者虽然使用部位不同，但甜叶悬钩子果实与华东掌叶覆盆子果实均属于聚合果类型，外形大小颜色一致，肉眼、显微等均难易区分，且从有效成分来说，甜叶悬钩子中同样能够检测到中国药典规定的掌叶覆盆子鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷两个指标成分，而甜叶悬钩子除叶子以外，果实的产量甚至比掌叶覆盆子高，其杆无刺，易于采收；甜叶悬钩子中鞣花酸与山柰酚-3-O-芸香糖苷含量低，不能达到中国药典标准，两者在原植株的性状差异较大，而新鲜及干燥后的果实难以区分，许多农户将甜叶悬钩子果实混杂于优质掌叶覆盆子中，将其作为中药材出售，这对于中药材优质种源的发展势必会带来影响，也会给纯种覆盆子中药材品种的延续带来冲击。
发明内容
本发明主要针对上述技术问题，发明了一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法及指纹图谱，该方法可以准确的区分掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子两个品种，具有方法简便、精密度高、重现性好等优点；该方法能直观的区分掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子多种成分的差异，有助于阐明掌叶覆盆子作为药用的机理及优势，且本发明的方法检测到的指纹图谱化学成分相对较多、峰形、柱效等均较优。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，采收掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子；
步骤二，预处理：分别称取掌叶覆盆子果实和甜叶悬钩子果实各100g，进行烘干10h处理，使其完全干燥，将烘干后的果实进行粉碎，并全部过四号筛，即得均一的两种样品粉末；
步骤三，有效成分的提取：
鞣化酸对照品溶液的配制：根据中国药典2015版一部，取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含5μg鞣化酸的溶液，即得；
分别准确称取两种果实粉末各2.0-4.0g置于两个三角烧瓶中，按料液比1:35加入70-80％甲醇，称定重量，超声处理20-40min，80-95℃回流1.5h，冷却至室温，用70-80％甲醇补重后，过滤，精密量取10mL液体至蒸发皿中，蒸干后，用甲醇转移至5mL容量瓶中；超声和回流都是为了将覆盆子中的生物碱等有效成分充分提取，超声可使细胞壁破裂，便于有效成分的溶出，回流是将有效成分完全提取出来；
步骤四，HPLC指纹图谱的确定：
将步骤三获得的两种果实的提取物，分别用0.45μm微孔滤膜过滤后，制得待测溶液，得到两种果实的HPLC指纹图谱；
步骤五，图谱的处理：
用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理所得图谱。
作为优选，所述步骤一，掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子的鲜品采收时期在4月下旬至5月上旬；采集多个不同产地的掌叶覆盆子与甜叶悬钩子未成熟果实，果实为青绿色。
作为优选，选取6个不同产地的6批掌叶覆盆子分别进行实验，6批掌叶覆盆子分别为掌叶—1、掌叶—2、掌叶—3、掌叶—4、掌叶—5、掌叶—6；选取6个不同产地的6批甜叶悬钩子分别进行实验，6批甜叶悬钩子分别为甜叶—1、甜叶—2、甜叶—3、甜叶—4、甜叶—5、甜叶—6。6个地区果实均进行分别提取，覆盆子与悬钩子分别实验，先各自进行对比，然后合在一起，用掌叶覆盆子作为对照。
作为优选，所述步骤二，掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子的鲜品干燥温度为50-60℃，控制烘干温度，保证样品中有效成分损失最小。
作为优选，所述步骤三，超声处理时间为30min。
作为优选，所述步骤三，回流提取温度控制在90℃，保证提取物不被高温破坏且提取完全。
作为优选，所述步骤五，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理所得图谱时，HPLC的色谱条件为：仪器：Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪；色谱柱：inertsil ODS-3 5μm,4.6×250mm；检测器：Agilent G7115A DAD检测器；流动相：0.4％甲酸:乙腈；柱温：25-35℃；流速：1.0mL/min；进样体积：10-20μL。
根据上述指纹图谱的建立方法建立的甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱，其特征在于，包括35个共有特征峰，从左到右编号为1至35，以甜叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.781～7.789min；8.155～8.274min；8.593～8.633min；10.054～10.157min；
11.435～11.551min；13.204～13.228min；15.389～15.408min；17.335～17.621min；
20.100～20.234min；20.799～20.874min；21.863～21.978min；25.165～25.190min；
26.877～27.051min；27.496～27.573min；32.366～32.631min；35.104～35.352min；
38.401～38.509min；40.862～40.983min；42.370～42.482min；53.221～53.355min；
56.867～56.971min；60.003～60.020min；62.457～62.531min；64.001～64.137min；
67.095～67.142min；69.735～69.907min；70.663～70.819min；72.286～72.433min；
77.856～77.940min；79.008～79.338min；83.876～84.111min；86.496～86.657min；
133.017～134.149min；135.654～136.008min；
其中，31号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
根据上述指纹图谱的建立方法建立的掌叶覆盆子的HPLC指纹图谱，其特征在于，包括35个共有特征峰，从左到右编号为1至35，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.704～7.780min；8.798～8.88min；12.783～12.801min；14.351～14.508min；
15.706～15.821min；17.737～17.812min；18.265～18.292min；19.255～19.407min；
21.877～21.938min；24.292～24.367min；26.541～26.875min；27.246～27.338min；
29.650～29.937min；30.322～30.678min；31.494～31.753min；32.582～33.010min；
35.377～35.804min；36.572～36.868min；37.234～37.708min；38.215～38.858min；
40.329～40.911min；41.746～42.070min；43.375～43.778min；44.101～44.675min；
44.996～45.057min；45.693～45.873min；47.072～47.566min；49.525～49.967min；
50.33～50.509min；53.466～53.893min；56.012～56.274min；60.003～60.032min；
69.317～69.328min；73.691～73.727min；
其中，32号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
根据上述指纹图谱的建立方法建立的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱，其特征在于，包括25个共有特征峰，从左到右编号为1至35，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
8.555～8.96min；12.614～12.875min；14.336～14.54min；17.252～17.718min；
18.095～18.397min；19.001～19.336min；21.509～21.992min；24.095～24.337min；
26.554～26.839min；27.010～27.358min；29.776～29.911min；31.336～31.674min；
32.342～32.798min；36.279～36.781min；37.556～37.864min；38.576～38.742min；
40.406～40.883min；341.359～41.945min；43.995～44.276min；44.618～44.979min；
49.534～49.808min；50.177～50.414min；53.272～53.736min；55.765～56.331min；
其中，25号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸；
还包括7个甜叶悬钩子特征峰、3个掌叶覆盆子特征峰，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他特征峰相对保留时间，编号为1至7的甜叶悬钩子特征峰以及编号为8至10的掌叶覆盆子特征峰相对保留时间依次为：
9.823～9.98min；11.122～11.234min；19.894～19.925min；28.792～28.834min；
30.496～30.529min；37.947～37.961min；58.983～59.015min；63.125～63.289min；
69.154～69.28min；73.672～73.691min。
综上所述，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明可以准确的区分掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子两个品种，具有方法简便、精密度高、重现性好等优点；该方法能直观的区分掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子多种成分的差异，有助于阐明掌叶覆盆子作为药用的机理及优势，且本发明的方法检测到的指纹图谱化学成分相对较多、峰形、柱效等均较优。
本发明首次将外观上极易混淆的掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子进行比较，利用指纹图谱的方式将两者区分开。
本发明使用最常规的设备、试剂将掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子进行简单的前处理，分析分离得到不同的有效陈分，通过指纹图谱分析方法，寻找到一系列掌叶覆盆子药材与甜叶悬钩子有差异的特征峰，将两种果实在成分上加以区分。
附图说明
图1是本发明六个主产地甜叶悬钩子及鞣花酸对照品的指纹图谱；
图2是本发明六个主产地掌叶覆盆子及鞣花酸对照品的指纹图谱；
图3是本发明六个主产地掌叶覆盆子及甜叶悬钩子及鞣花酸对照品的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1，甜叶悬钩子指纹图谱建立方法。
1.实验材料
1.1仪器及试剂
ZM200超细粉碎仪(德国RETSCH公司)；XSE104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HSY-16电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)；KH-5200DE数控超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；Agilent 1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；甲醇、甲酸(AR，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(HPLC，Merck KGaA)；鞣花酸对照品，批号：11959-201602(中国食品药品检定研究院)。
1.2样品采收及预处理
果实为青绿色时采集浙江、江苏、安徽、江西、贵州和福建六个主产地的甜叶悬钩子，准确称取两种果实100g，60℃进行烘干10h处理，使其完全干燥，将烘干后的果实进行粉碎，并全部过四号筛，即得均一的样品粉末。
2.有效成分的提取
准确称取粉末4.0g置于三角烧瓶中，按料液比1:35加入80％甲醇，称定重量，超声处理30min，90℃回流1.5h，冷却至室温，用80％甲醇补重后，过滤，精密量取10mL液体至蒸发皿中，蒸干后，用甲醇转移至5mL容量瓶中。
3.HPLC指纹图谱的建立
将步骤2所得的提取物，用0.45μm微孔滤膜过滤后，制得待测溶液，得到两种果实的HPLC指纹图谱，最后用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理所得图谱。HPLC的色谱条件为：仪器：Agilent 1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪；色谱柱：inertsilODS-3 5μm,4.6×250mm；检测器：Agilent G7115A DAD检测器；流动相：0.4％甲酸:乙腈；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。
流动相比例如下表所示：
表1甜叶悬钩子流动相比例
4.指纹图谱特征峰分析
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理图谱，得到浙江、江苏、安徽、江西、贵州和福建六个主产地甜叶悬钩子的指纹图谱(见附图2)，利用相似度评价软件计算甜叶悬钩子之间的相似度，得出：六批甜叶悬钩子之间的相似度0.892～0.98，相似度较高。
甜叶-1悬钩子共有峰详见表2，六批甜叶悬钩子相似度见表3，六批甜叶悬钩子指纹图谱峰详见附图1。
表2甜叶-1悬钩子共有峰及保留时间
表3甜叶悬钩子相似度
根据图1中的结果，计算甜叶悬钩子共有峰相对保留时间，采用甜叶-1为参照峰,分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.781～7.789min；8.155～8.274min；8.593～8.633min；10.054～10.157min；
11.435～11.551min；13.204～13.228min；15.389～15.408min；17.335～17.621min；
20.100～20.234min；20.799～20.874min；21.863～21.978min；25.165～25.190min；
26.877～27.051min；27.496～27.573min；32.366～32.631min；35.104～35.352min；
38.401～38.509min；40.862～40.983min；42.370～42.482min；53.221～53.355min；
56.867～56.971min；60.003～60.020min；62.457～62.531min；64.001～64.137min；
67.095～67.142min；69.735～69.907min；70.663～70.819min；72.286～72.433min；
77.856～77.940min；79.008～79.338min；83.876～84.111min；86.496～86.657min；
133.017～134.149min；135.654～136.008min。
其中，31号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸，说明甜叶悬钩子中也存在药典规定的指标性成分。
实施例2，掌叶覆盆子指纹图谱建立方法。
1.实验材料
1.1仪器、试剂样品、采收及预处理参照实施例1中“1.1”“1.2”；果实为青绿色时采集浙江、江苏、安徽、江西、贵州和福建六个主产地的掌叶覆盆子。
2.有效成分的提取
准确称取粉末2.0g置于三角烧瓶中，按料液比1:35加入70％甲醇，称定重量，超声处理30min，90℃回流1.5h，冷却至室温，用70％甲醇补重后，过滤，精密量取10mL液体至蒸发皿中，蒸干后，用甲醇转移至5mL容量瓶中。
3.HPLC指纹图谱的建立
将步骤2所得的提取物，用0.45μm微孔滤膜过滤后，制得待测溶液，得到两种果实的HPLC指纹图谱，最后用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理所得图谱。HPLC的色谱条件为：仪器：Agilent 1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪；色谱柱：inertsilODS-3 5μm,4.6×250mm；检测器：Agilent G7115A DAD检测器；流动相：0.4％甲酸:乙腈；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。
流动相比例如下表所示：
表4掌叶覆盆子流动相比例
4.指纹图谱特征峰分析
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理图谱，得到浙江、江苏、安徽、江西、贵州和福建六个主产地掌叶覆盆子的指纹图谱(见附图3)，利用相似度评价软件计算掌叶覆盆子之间的相似度，得出；六批掌叶覆盆子之间的相似度0.986～0.999，相似度较高。
掌叶-1覆盆子共有峰详见表5，六批掌叶覆盆子相似度见表6，六批掌叶覆盆子指纹图谱峰详见附图2。
表5掌叶-1覆盆子共有峰及保留时间
表6掌叶覆盆子相似度
根据图2中的结果，计算掌叶覆盆子共有峰相对保留时间，采用掌叶-1为参照峰,分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.704～7.780min；8.798～8.88min；12.783～12.801min；14.351～14.508min；
15.706～15.821min；17.737～17.812min；18.265～18.292min；19.255～19.407min；
21.877～21.938min；24.292～24.367min；26.541～26.875min；27.246～27.338min；
29.650～29.937min；30.322～30.678min；31.494～31.753min；32.582～33.010min；
35.377～35.804min；36.572～36.868min；37.234～37.708min；38.215～38.858min；
40.329～40.911min；41.746～42.070min；43.375～43.778min；44.101～44.675min；
44.996～45.057min；45.693～45.873min；47.072～47.566min；49.525～49.967min；
50.33～50.509min；53.466～53.893min；56.012～56.274min；60.003～60.032min；
69.317～69.328min；73.691～73.727min。
其中，32号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
实施例3，区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的指纹图谱建立方法。
1.实验材料
1.1仪器、试剂样品、采收及预处理参照实施例1中“1.1”“1.2”；采集两种果实。
2.有效成分的提取
准确称取粉末3.0g置于三角烧瓶中，按料液比1:35加入75％甲醇，称定重量，超声处理30min，90℃回流1.5h，冷却至室温，用75％甲醇补重后，过滤，精密量取10mL液体至蒸发皿中，蒸干后，用甲醇转移至5mL容量瓶中。
3.HPLC指纹图谱的建立
将步骤2所得的提取物，用0.45μm微孔滤膜过滤后，制得待测溶液，得到两种果实的HPLC指纹图谱，最后用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理所得图谱。HPLC的色谱条件为：仪器：Agilent 1260Infinity Ⅱ高效液相色谱仪；色谱柱：inertsilODS-3 5μm,4.6×250mm；检测器：Agilent G7115A DAD检测器；流动相：0.4％甲酸:乙腈；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。
流动相比例如下表所示：
表7流动相比例
4.指纹图谱特征峰分析
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012.130723)处理图谱，得到浙江、江苏、安徽、江西、贵州和福建六个主产地掌叶覆盆子及甜叶悬钩子的指纹图谱(见附图3)，利用相似度评价软件计算掌叶覆盆子和甜叶悬钩子之间的相似度，得出：该方法六批掌叶覆盆子之间的相似度为0.893～0.997，六批甜叶悬钩子之间的相似度为0.917～0.997，相似度均较高，六批掌叶覆盆子和甜叶悬钩子之间的相似度0.213～0.346，相似度低，可作为掌叶覆盆子和甜叶悬钩子区分方法。
掌叶-1覆盆子和甜叶-1悬钩子之间共有峰、各自特有峰分别见表8及表9，六批掌叶覆盆子和甜叶悬钩子相似度比较见表10，掌叶覆盆子和甜叶悬钩子共同的指纹图谱峰详见附图3。
表8甜叶悬钩子与掌叶覆盆子共有峰及保留时间
表9掌叶覆盆子与甜叶悬钩子特有峰比较
表10掌叶覆盆子与甜叶悬钩子相似度比较
| 相似度 | 掌叶-1 | 掌叶-2 | 掌叶-3 | 掌叶-4 | 掌叶-5 | 掌叶-6 | 甜叶-1 | 甜叶-2 | 甜叶-3 | 甜叶-4 | 甜叶-5 | 甜叶-6 |
| 掌叶-1 | 1 | 0.997 | 0.985 | 0.98 | 0.954 | 0.893 | 0.295 | 0.301 | 0.235 | 0.258 | 0.229 | 0.223 |
| 掌叶-2 | 0.997 | 1 | 0.987 | 0.982 | 0.957 | 0.896 | 0.294 | 0.286 | 0.234 | 0.256 | 0.231 | 0.222 |
| 掌叶-3 | 0.985 | 0.987 | 1 | 0.998 | 0.966 | 0.91 | 0.316 | 0.263 | 0.248 | 0.275 | 0.295 | 0.236 |
| 掌叶-4 | 0.98 | 0.982 | 0.998 | 1 | 0.97 | 0.917 | 0.327 | 0.213 | 0.255 | 0.283 | 0.278 | 0.242 |
| 掌叶-5 | 0.954 | 0.957 | 0.966 | 0.97 | 1 | 0.964 | 0.347 | 0.292 | 0.26 | 0.299 | 0.252 | 0.248 |
| 掌叶-6 | 0.893 | 0.896 | 0.91 | 0.917 | 0.964 | 1 | 0.346 | 0.232 | 0.254 | 0.296 | 0.288 | 0.242 |
| 甜叶-1 | 0.295 | 0.294 | 0.316 | 0.327 | 0.347 | 0.346 | 1 | 0.917 | 0.99 | 0.997 | 0.978 | 0.988 |
| 甜叶-2 | 0.301 | 0.286 | 0.263 | 0.213 | 0.292 | 0.232 | 0.917 | 1 | 0.976 | 0.991 | 0.995 | 0.968 |
| 甜叶-3 | 0.235 | 0.234 | 0.248 | 0.255 | 0.26 | 0.254 | 0.99 | 0.976 | 1 | 0.997 | 0.947 | 0.999 |
| 甜叶-4 | 0.258 | 0.256 | 0.275 | 0.283 | 0.299 | 0.296 | 0.997 | 0.991 | 0.997 | 1 | 0.958 | 0.996 |
| 甜叶-5 | 0.229 | 0.231 | 0.295 | 0.278 | 0.252 | 0.288 | 0.978 | 0.995 | 0.947 | 0.958 | 1 | 0.941 |
| 甜叶-6 | 0.223 | 0.222 | 0.236 | 0.242 | 0.248 | 0.242 | 0.988 | 0.968 | 0.999 | 0.996 | 0.941 | 1 |
根据图3中的结果，计算掌叶覆盆子与甜叶悬钩子共有峰的相对保留时间，采用掌叶-1为参照峰,分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至25的共有特征峰相对保留时间依次为：
8.555～8.96min；12.614～12.875min；14.336～14.54min；17.252～17.718min；
18.095～18.397min；19.001～19.336min；21.509～21.992min；24.095～24.337min；
26.554～26.839min；27.010～27.358min；29.776～29.911min；31.336～31.674min；
32.342～32.798min；36.279～36.781min；37.556～37.864min；38.576～38.742min；
40.406～40.883min；341.359～41.945min；43.995～44.276min；44.618～44.979min；
49.534～49.808min；50.177～50.414min；53.272～53.736min；55.765～56.331min。其中，25号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
根据图3中的结果，计算掌叶覆盆子与甜叶悬钩子特有特征峰的相对保留时间，采用掌叶-1为参照峰,分别计算其他特征峰相对保留时间，编号为1至7的甜叶悬钩子特征峰及编号为8至10的掌叶覆盆子特征峰相对保留时间依次为：
9.823～9.98min；11.122～11.234min；19.894～19.925min；28.792～28.834min；
30.496～30.529min；37.947～37.961min；58.983～59.015min；63.125～63.289min；
69.154～69.28min；73.672～73.691min。
以上实验表明，该方法适用于多个产地的掌叶覆盆子及甜叶悬钩子区分，指纹图谱相对稳定，甜叶悬钩子及掌叶覆盆子的相似度低，可以作为区分两种果实的依据。
文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (9)
1.一种区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，采收掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子；
步骤二，预处理：分别称取掌叶覆盆子果实和甜叶悬钩子果实各100 g，进行烘干10h处理，使其完全干燥，将烘干后的果实进行粉碎，并全部过四号筛，即得均一的两种样品粉末；
步骤三，有效成分的提取：
鞣化酸对照品溶液的配制：取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含5μg鞣花酸的溶液，即得；
分别准确称取两种果实粉末各2.0-4.0g置于两个三角烧瓶中，按料液比1:35加入70-80%甲醇，称定重量，超声处理20-40min，80-95℃回流1.5h，冷却至室温10-30℃，用70-80%甲醇补重后，过滤，精密量取10mL液体至蒸发皿中，蒸干后，用甲醇转移至5mL容量瓶中；
步骤四，HPLC指纹图谱的确定：
将步骤三获得的两种果实的提取物，分别用0.45μm微孔滤膜过滤后，制得待测溶液，得到两种果实的HPLC指纹图谱；
步骤五，图谱的处理：
用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理所得图谱；
所述步骤五，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理所得图谱时，HPLC的色谱条件为：仪器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪；色谱柱：inertsil ODS-3 5μm，4.6×250mm；检测器：Agilent G7115A DAD检测器；流动相：0.4%甲酸：乙腈；柱温：25-35℃；流速：1.0mL/min；进样体积：10-20μL；
所述甜叶悬钩子流动相比例为：
指纹图谱运行0-25分钟，0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到75.2%，同时乙腈的比例从5%升高到24.8%；
指纹图谱运行25-40分钟，0.4%的甲酸水溶液从75.2%的比例下降到70.9%，同时乙腈的比例从24.8%升高到29.1%；
指纹图谱运行40-57分钟，0.4%的甲酸水溶液从70.9%的比例下降到63.4%，同时乙腈的比例从29.1%升高到36.6%；
指纹图谱运行57-77分钟，0.4%的甲酸水溶液从63.4%的比例下降到53%，同时乙腈的比例从36.6%升高到47%；
指纹图谱运行77-90分钟，0.4%的甲酸水溶液从53%的比例下降到43.7%，同时乙腈的比例从47%升高到56.3%；
指纹图谱运行90-120分钟，0.4%的甲酸水溶液从43.7%的比例下降到36.6%，同时乙腈的比例从56.3%升高到63.4%；
指纹图谱运行120-150分钟，0.4%的甲酸水溶液从36.6%的比例下降到0%，同时乙腈的比例从63.4%升高到100%；
所述掌叶覆盆子流动相比例为：
指纹图谱运行0-8分钟，0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到90.6%，同时乙腈的比例从5%升高到9.4%；
指纹图谱运行8-27分钟，0.4%的甲酸水溶液从90.6%的比例下降到83%，同时乙腈的比例从9.4%升高到17%；
指纹图谱运行27-55分钟，0.4%的甲酸水溶液从83%的比例下降到78.9%，同时乙腈的比例从17%升高到21.1%；
指纹图谱运行55-79分钟，0.4%的甲酸水溶液从78.9%的比例下降到53.3%，同时乙腈的比例从21.1%升高到46.7%；
指纹图谱运行79-86分钟，0.4%的甲酸水溶液从53.3%的比例下降到32.6%，同时乙腈的比例从46.7%升高到67.4%；
指纹图谱运行86-90分钟，0.4%的甲酸水溶液从32.6%的比例下降到0%，同时乙腈的比例从67.4%升高到100%；
所述区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的流动相比例为：
指纹图谱运行0-10分钟，0.4%的甲酸水溶液从95%的比例下降到89.5%，同时乙腈的比例从5%升高到10.5%；
指纹图谱运行10-25分钟，0.4%的甲酸水溶液从89.5%的比例下降到84.5%，同时乙腈的比例从10.5%升高到15.5%；
指纹图谱运行25-47分钟，0.4%的甲酸水溶液从84.5%的比例下降到76.3%，同时乙腈的比例从15.5%升高到23.7%；
指纹图谱运行47-60分钟，0.4%的甲酸水溶液从76.3%的比例下降到35%，同时乙腈的比例从23.7%升高到65%；
指纹图谱运行60-75分钟，0.4%的甲酸水溶液从35%的比例下降到15.8%，同时乙腈的比例从65%升高到84.2%。
2.根据权利要求1所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤一，掌叶覆盆子和甜叶悬钩子的鲜品采收时期在4月下旬至5月上旬；采集多个不同产地的掌叶覆盆子与甜叶悬钩子未成熟果实，果实为青绿色。
3.根据权利要求2所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，选取6个不同产地的6批掌叶覆盆子分别进行实验，6批掌叶覆盆子分别为掌叶—1、掌叶—2、掌叶—3、掌叶—4、掌叶—5、掌叶—6；选取6个不同产地的6批甜叶悬钩子分别进行实验，6批甜叶悬钩子分别为甜叶—1、甜叶—2、甜叶—3、甜叶—4、甜叶—5、甜叶—6。
4.根据权利要求1所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤二，掌叶覆盆子药材和甜叶悬钩子的鲜品干燥温度为50-60℃，控制烘干温度，保证样品中有效成分损失最小。
5.根据权利要求1所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤三，超声处理时间为30min。
6.根据权利要求1所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤三，回流提取温度控制在90℃，保证提取物不被高温破坏且提取完全。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所获得的甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱包括35个共有特征峰，从左到右编号为1至35，以甜叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.781~7.789min；8.155~8.274min；8.593~8.633min；10.054~10.157min；
11.435~11.551min；13.204~13.228min；15.389~15.408min；17.335~17.621min；
20.100~20.234min；20.799~20.874min；21.863~21.978min；25.165~25.190min；
26.877~27.051min；27.496~27.573min；32.366~32.631min；35.104~35.352min；
38.401~38.509min；40.862~40.983min；42.370~42.482min；53.221~53.355min；
56.867~56.971min；60.003~60.020min；62.457~62.531min；64.001~64.137min；
67.095~67.142min；69.735~69.907min；70.663~70.819min；72.286~72.433min；
77.856~77.940min；79.008~79.338min；83.876~84.111min；86.496~86.657min；
133.017~134.149min；135.654~136.008min；
其中，31号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所获得的掌叶覆盆子的HPLC指纹图谱包括35个共有特征峰，从左到右编号为1至35，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至35的共有特征峰相对保留时间依次为：
7.704~7.780min；8.798~8.88min；12.783~12.801min；14.351~14.508min；
15.706~15.821min；17.737~17.812min；18.265~18.292min；19.255~19.407min；
21.877~21.938min；24.292~24.367min；26.541~26.875min；27.246~27.338min；
29.650~29.937min；30.322~30.678min；31.494~31.753min；32.582~33.010min；
35.377~35.804min；36.572~36.868min；37.234~37.708min；38.215~38.858min；
40.329~40.911min；41.746~42.070min；43.375~43.778min；44.101~44.675min；
44.996~45.057min；45.693~45.873min；47.072~47.566min；49.525~49.967min；
50.33~50.509min；53.466~53.893min；56.012~56.274min；60.003~60.032min；
69.317~69.328min；73.691~73.727min；
其中，32号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸。
9.根据权利要求1-6任意一项所述的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所获得的区分掌叶覆盆子与甜叶悬钩子的HPLC指纹图谱包括25个共有特征峰，从左到右编号为1至25，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至25的共有特征峰相对保留时间依次为：
8.555~8.96min；12.614~12.875min；14.336~14.54min；17.252~17.718min；
18.095~18.397min；19.001~19.336min；21.509~21.992min；24.095~24.337min；
26.554~26.839min；27.010~27.358min；29.776~29.911min；31.336~31.674min；
32.342~32.798min；36.279~36.781min；37.556~37.864min；38.576~38.742min；
40.406~40.883min；341.359~41.945min；43.995~44.276min；44.618~44.979min；
49.534~49.808min；50.177~50.414min；53.272~53.736min；55.765~56.331min；
其中，25号共有峰为覆盆子指标性成分鞣花酸；
还包括7个甜叶悬钩子特征峰、3个掌叶覆盆子特征峰，以掌叶—1为参照峰，分别计算其他特征峰相对保留时间，编号为1至7的甜叶悬钩子特征峰以及编号为8至10的掌叶覆盆子特征峰相对保留时间依次为：
9.823~9.98min；11.122~11.234min；19.894~19.925min；28.792~28.834min；
30.496~30.529min；37.947~37.961min；58.983~59.015min；63.125~63.289min；
69.154~69.28min；73.672~73.691min。
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