CN115403669A - 一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法。该方法通过以下步骤实现：将脱毛后的牛皮脱脂处理，水洗至中性；水洗后的牛皮加入氯化钠水溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮，浸泡，进行冻融处理；将清洗干净的牛皮捣碎，浆料中加入浓度为柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，酶解，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；将得到的酶解液分离纯化，得到胶原蛋白。本发明提供的制备方法，能够大大提高牛皮前处理过程中的溶胀，促进后续胶原蛋白的溶出，提高胶原蛋白的提取率；本发明提供的制备方法，能够制备得到500‑2000道尔顿的超低分子牛皮胶原蛋白，分子量分布窄，生物活性高，利用度好。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白具有良好的生物相容性、可降解、免疫原性低等优点，在生物医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。胶原蛋白的应用与其分子量息息相关。
原料皮为鲜皮或经过防腐处理后的皮，其是由水分、蛋白质、脂类等组成，原料皮的前处理方式对后期胶原蛋白的提取也具有重要的影响，前期处理即需要进行有效的脱脂、去除表面杂物，同时需要最大程度的保持较远的三股螺旋结构，进而保证提取后胶原蛋白的活性。酶解法提取胶原蛋白是目前常用的方法之一，具有专一性强，反应条件温和、反应速度快等优点，但是，酶解过程中，随着酶解的进行，胶原的不断溶出导致体系粘度变大，影响进一步的酶解，胶原蛋白提取率低。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂超声脱脂处理，水洗至中性；
(2)水洗后的牛皮加入氯化钠水溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮，浸泡，进行冻融处理，然后清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，浆料中加入浓度为柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入酸性蛋白酶和甘露聚糖酶，酶解，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
进一步的，步骤(1)中，所述复合脱脂剂是由10％正丁醇和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成；所述脱脂处理的时间为3-5h。
进一步的，步骤(2)中，所述牛皮和氯化钠水溶液的料液比为1g：50mL；所述氯化钠水溶液的质量浓度为10％；所述聚乙烯吡咯烷酮在氯化钠水溶液中的浓度为0.02％；浸泡时间为4h；所述冻融处理的次数为3次。
进一步的，所述冻融处理的具体步骤为：首先在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温。
进一步的，步骤(3)中，所述浆料和柠檬酸溶液的料液比为1g：15mL；所述柠檬酸溶液的质量浓度为5％。
进一步的，步骤(3)中，所述酸性蛋白酶的加入量为2000-2500U/g牛皮；所述甘露聚糖酶的加入量为100-200U/g牛皮。
进一步的，步骤(3)中，所述酶解的时间为15-20h。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的制备方法，能够大大提高牛皮前处理过程中的溶胀，促进后续胶原蛋白的溶出，提高胶原蛋白的提取率；
(2)本发明提供的制备方法，能够制备得到500-2000道尔顿的超低分子牛皮胶原蛋白，分子量分布窄，生物活性高，利用度好。
附图说明
图1为胶原蛋白提取率对照图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂(10％正丁醇：壬基酚聚氧乙烯醚＝50:1)超声脱脂处理3.5h，水洗至中性；
(2)按照1g水洗后的牛皮加入质量浓度为10％的氯化钠水溶液50mL，加入聚乙烯吡咯烷酮至其在氯化钠溶液中的浓度为0.02％，浸泡4h后，取出，将牛皮在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温，反复处理3次，然后清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，每g浆料中加入15mL，浓度为5％的柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入2200U/g牛皮的酸性蛋白酶和150U/g牛皮的甘露聚糖酶，在34-38℃下酶解18h，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析2d后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
实施例2
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂(10％正丁醇：壬基酚聚氧乙烯醚＝50:1)超声脱脂处理4h，水洗至中性；
(2)按照1g水洗后的牛皮加入质量浓度为10％的氯化钠水溶液50mL，加入聚乙烯吡咯烷酮至其在氯化钠溶液中的浓度为0.02％，浸泡4h后，取出，将牛皮在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温，反复处理3次，然后清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，每g浆料中加入15mL，浓度为5％的柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入2500U/g牛皮的酸性蛋白酶和200U/g牛皮的甘露聚糖酶，在34-38℃下酶解15h，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析2d后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
对比例1
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂(10％正丁醇：壬基酚聚氧乙烯醚＝50:1)超声脱脂处理3.5h，水洗至中性；
(2)按照1g水洗后的牛皮加入质量浓度为10％的氯化钠水溶液50mL，浸泡4h后，取出，将牛皮在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温，反复处理3次，然后清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，每g浆料中加入15mL，浓度为5％的柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入2200U/g牛皮的酸性蛋白酶和150U/g牛皮的甘露聚糖酶，在34-38℃下酶解18h，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析2d后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
对比例2
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂(10％正丁醇：壬基酚聚氧乙烯醚＝50:1)超声脱脂处理3.5h，水洗至中性；
(2)按照1g水洗后的牛皮加入质量浓度为10％的氯化钠水溶液50mL，加入聚乙烯吡咯烷酮至其在氯化钠溶液中的浓度为0.02％，浸泡4h后，取出清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，每g浆料中加入15mL，浓度为5％的柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入2200U/g牛皮的酸性蛋白酶和150U/g牛皮的甘露聚糖酶，在34-38℃下酶解18h，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析2d后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
对比例3
(1)将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂(10％正丁醇：壬基酚聚氧乙烯醚＝50:1)超声脱脂处理3.5h，水洗至中性；
(2)按照1g水洗后的牛皮加入质量浓度为10％的氯化钠水溶液50mL，加入聚乙烯吡咯烷酮至其在氯化钠溶液中的浓度为0.02％，浸泡4h后，取出，将牛皮在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温，反复处理3次，然后清洗；
(3)将清洗干净的牛皮捣碎，每g浆料中加入15mL，浓度为5％的柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入2200U/g牛皮的酸性蛋白酶，在34-38℃下酶解18h，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
(4)将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析2d后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
结果与讨论(一)将实施例1-2及对比例1-3制备得到胶原蛋白，进行提取率的统计，提取率按照：提取率＝(冷冻干燥后的胶原蛋白/新鲜牛皮干重)*100％；具体结果如图1所示。
(二)将实施例1及对比例3制备得到的胶原蛋白通过高效液相色谱检测500-1000道尔顿范围内的分子量分布，检测结果如表1所示。
表1
| 胶原蛋白含量(500-1000道尔顿) | |
| 实施例1 | 97.6％ |
| 对比例3 | 93.2％ |
本发明提供的提取方法，酶解过程中，能够调节酶解液的粘度，酶制剂能够作用于肽链间，将胶原酶解成小分子片段，且分布较窄。
Claims (7)
1.一种超低分子量牛皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将脱毛后的牛皮清洗干净，切块，加入复合脱脂剂超声脱脂处理，水洗至中性；
（2）水洗后的牛皮加入氯化钠水溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮，浸泡，进行冻融处理，然后清洗；
（3）将清洗干净的牛皮捣碎，浆料中加入浓度为柠檬酸溶液，搅拌浸泡后，调节pH至中性，然后加入酸性蛋白酶和甘露聚糖酶，酶解，灭酶后进行冷冻离心，得酶解液；
（4）将得到的酶解液采用蒸馏水进行透析后，真空冷冻干燥，然后超纯水溶解，用截留分子量为2000Da的超滤膜进行分离纯化，得到胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述复合脱脂剂是由10%正丁醇和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成；所述脱脂处理的时间为3-5h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述牛皮和氯化钠水溶液的料液比为1g：50mL；所述氯化钠水溶液的质量浓度为10%；所述聚乙烯吡咯烷酮在氯化钠水溶液中的浓度为0.02%；浸泡时间为4h，所述冻融处理的次数为3次。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冻融处理的具体步骤为：首先在-15℃条件下冷冻50min，然后取出恢复至室温。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述浆料和柠檬酸溶液的料液比为1g：15mL；所述柠檬酸溶液的质量浓度为5%。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述酸性蛋白酶的加入量为2000-2500U/g牛皮；所述甘露聚糖酶的加入量为100-200U/g牛皮。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述酶解的时间为15-20h。
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