CN115385811A

CN115385811A - 一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法

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Publication number: CN115385811A
Application number: CN202211055245.5A
Authority: CN
Inventors: 吴琪; 罗益明; 李莉; 聂梦平; 万燕; 邬晓勇; 刘长英; 叶雪玲; 白雪; 赵钢
Original assignee: Chengdu University
Current assignee: Chengdu University
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2022-11-25

Abstract

本发明公开了一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法，具体为一种从成熟期藜麦秸秆、叶片和种皮三种副产物种大量提取高纯度食用甜菜素的方法。其提取方法是经过品种筛选、预处理、浸提、离心、抽滤、乙醇除杂、冻结、冷冻干燥、储藏等工艺完成。本发明通过响应面优化了藜麦甜菜素提取工艺，通过稳定性实验探究了甜菜素的储藏条件。本发明提取的藜麦甜菜素的平均纯度达到87.57±1.6％，甜菜素得率为9.55±0.12％。

Description

一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法

技术领域

本发明属于天然色素提取方法技术领域，具体涉及到一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法。

背景技术

食用色素在食品加工过程中不可或缺，其分为人工合成色素和天然色素。食品安全受到国家的重视和人民的关注，天然色素脱颖而出。相较于其它合成色素而言，天然色素有着安全无毒、色彩自然丰富等特点，还具有营养价值和药理作用等优势。近年市场调研结果表明，全球有61.3％的消费者表示要尽量避免使用合成色素。天然色素市场主要分为胭脂红、花青素、焦糖色素、类胡萝卜素、姜黄素、甜菜素等。天然色素有取代合成色素的趋势，而甜菜素作为优质的天然植物色素却份额较少。

甜菜素(Betalains)最早在红甜菜(Beta vulgaris L.)根中分离得到。自然界中甜菜素主要分布在石竹目下17个科属植物中，如红甜菜、火龙果 (HylocereusundulatusBritt.)和仙人掌(Opuntiastricta(Haw.)Haw.var.dillenii (Ker-Gawl.)Benson)等植物。甜菜素为水溶性含氮色素，有良好的着色能力，还有抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌、治疗肥胖和预防冠心病等作用。很长一段时间，红甜菜几乎是甜菜素的唯一来源。但是，以红甜菜为商业化来源提取的甜菜素容易携带微生物，同时伴有强烈的土腥味。同时，种植红甜菜经济价值低，种植面积在逐渐减少。火龙果和仙人掌果常作为水果开发，难用于甜菜素商业化。所以，寻找甜菜素的其它来源是亟待解决的问题。

学者们研究发现深红色藜麦(Chenopodium quinoawilld.)中也富含甜菜素，尤其是成熟后的藜麦秸秆、叶片、种皮等地上部分的副产物。藜麦为一种营养丰富的杂粮，其种子的营养价值被人们重视，但是，其秸秆、叶片、种皮等副产物往往被人们忽视，部分地区甚至直接将这类副产物丢弃，对环境造成负面影响。深红色藜麦的副产物中富含甜菜素，如果将其作为提取甜菜素的原料，不仅能弥补红甜菜提取的甜菜素伴有土腥味的不足，还能在实现藜麦副产物废物利用的同时减少环境污染，增加甜菜素在色素市场上份额，同时使藜麦种植户增收。

目前，在其它植物中有许多天然色素提取相关的报道，但是，从藜麦秸秆等副产物中大量提甜菜素的方法还未被人提及。学者发现，甜菜素与众多天然色素一样，存在结构稳定性容易受到温度、pH等环境因素的影响，得率较低、纯度低等问题。因此，如何提供一种从藜麦秸秆等副产物中大量提取高纯度甜菜素的方法，成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法，可以弥补红甜菜提取甜菜素伴有土腥味的不足，并且提高藜麦作物的附加价值，减少环境污染的同时实现可持续发展。

为达上述目的，本发明提供了一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法，包括以下步骤：

(1)藜麦副产物回收及预处理：将成熟的藜麦地上部分整株回收，高温烘干并粉碎成粉末；

(2)提取甜菜素：将粉末加入提取溶剂，加热提取后过滤，将滤液离心后静置，取上清液抽滤；

(3)除杂：向抽滤后得到的滤液中加入无水乙醇混匀离心，收集沉淀静置后冷冻成固体；

(4)干燥：步骤(3)所得固体冷冻干燥，制成粉末即可。

进一步地，藜麦地上部分包括植株茎干、叶片和种皮，藜麦的品种为ZL-7。

进一步地，烘干的温度为30～40℃，烘干的时间为2～5d。

进一步地，步骤(1)粉碎后的粉末过10～40目筛。

进一步地，提取溶剂为去离子水，提取的料液比为1g：10～30mL，提取的温度为25～30℃，提取方法为恒温摇床避光条件下以150～200rpm提取20～60min。

进一步地，步骤(2)过滤的方法为采用100～200目尼龙布双层过滤；步骤 (2)离心的转速为5000rpm，离心的时间为10～15min，静置的时间为1h；步骤(2抽滤的方法为用定性滤纸抽滤1-3次。

进一步地，无水乙醇加入后，滤液中的无水乙醇体积分数为80％。

进一步地，步骤(3)离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min，静置的时间为1～2h；冷冻的温度为-20℃，冷冻的时间为2～3d。

进一步地，步骤(4)冷冻干燥的温度为-80℃，真空度为18～22Pa。

综上所述，本发明具有以下优点：

本发明以藜麦秸秆、叶片、种皮等副产物为原材料提取甜菜素，成本低廉，来源便捷，提高藜麦作物的附加价值，减少环境污染的同时实现可持续发展。

本发明从藜麦副产物中提取甜菜素，弥补了红甜菜提取甜菜素伴有土腥味的不足，同时采用乙醇除杂，降低了产物中皂苷等杂质等含量。同时，乙醇安全性较高、能回收利用，进一步减少生产成本。

本发明的提取溶剂为去离子水，未添加任何防腐剂、抗氧化剂等成分，安全无毒。通过响应面优化了甜菜素提取步骤，其工艺简单、容易放大、适宜推广，且得到的甜菜素纯度和得率较高。采用冷冻干燥技术，维持藜麦甜菜素结构稳定，使其具有较高的生理活。

附图说明

图1为40％乙醇溶液制作的甜菜素标准曲线；

图2为去离子水制作的甜菜素标准曲线；

图3为藜麦皂苷(齐墩果酸)标准曲线；

图4为不同植物中甜菜素光谱扫描图；

图5为不同植物中甜菜素含量比较图；

图6为不同品种藜麦中甜菜素含量对比图；

图7为ZL-7藜麦不同组分甜菜素含量对比图；

图8为ZL-7藜麦不同组分重量对比图；

图9为不同提取剂对藜麦甜菜素溶解效果比较图；

图10为乙醇浓度对藜麦甜菜素的提取效果影响图；

图11为时间对藜麦甜菜素的提取效果影响图；

图12为料液比对藜麦甜菜素的提取效果影响图；

图13为温度对藜麦甜菜素的提取效果影响图；

图14为摇床转速对藜麦甜菜素的提取效果影响图；

图15为响应面优化提取藜麦甜菜素组图；

图16为不同处理方法对藜麦皂苷的影响图；

图17为不同除杂方法对藜麦甜菜素的影响图；

图18为90％乙醇萃取杂质实图；

图19为藜麦甜菜素粉末实图；

图20为藜麦甜菜素纯度分析图；

图21为烘干时间对藜麦甜菜素含量影响图；

图22为温度对藜麦甜菜素含量影响图；

图23为pH值对藜麦甜菜素含量影响图。

具体实施方式

本发明采用的藜麦品种为ZL-7，该藜麦颜色十分鲜红，甜菜素含量较高。同时本发明提取的是ZL-7成熟期的秸秆和种皮等地上部分副产物，可大量提取，还有废物利用、减少污染、增加藜麦附加价值的作用。

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法，包括以下步骤：

(1)品种筛选：在已有的藜麦品种中筛选出颜色较深、产量高、易推广的 ZL-7藜麦品种。

(2)藜麦秸秆等副产物回收及预处理：藜麦成熟后，将其地上部分整株回收，在40℃下避光烘干3d，然后，将藜麦植株秸秆、叶片、种皮分离，粉碎后，过20目筛，保留粉末，用于提取甜菜素。

(3)甜菜素提取：提取溶剂为去离子水，料液比为1:20(g:mL)，提取温度为30℃，用恒温摇床避光条件下150rpm提取40min。然后用100目尼龙布双层过滤，保留滤液，5000rpm条件下离心15min，静置1h(期间不能剧烈摇晃)。取上清液，用定性滤纸抽滤3次。

(4)皂苷等杂质去除：向滤液中加入无水乙醇，至乙醇体积百分数为80％，混合均匀后，室温下，8000rpm离心10min，收集沉淀，室温放置1.5h，等待乙醇挥发干，如果杂质较多，可以进行两次萃取除杂。将沉淀装入塑料袋中，封口后，在-20℃条件下冻结3天，直至完全冻结成固体。

(5)冷冻干燥：将(4)中固体分装至50mL EP管中，管口用保鲜膜封口，将管口保鲜膜扎孔，然后正放于冷冻干燥机内，-80℃、真空度20Pa条件下，冷冻干燥，直到干燥成粉末。

(6)储藏：基于甜菜素的稳定性，将甜菜素粉末储藏于棕色的玻璃瓶中，密封后，放于4℃条件下避光保存。

实施例2

(2)藜麦秸秆等副产物回收及预处理：藜麦成熟后，将其地上部分整株回收，在40℃下避光烘干4d，然后，将藜麦植株秸秆、叶片、种皮分离，粉碎后，过20目筛，保留粉末，用于提取甜菜素。

(3)甜菜素提取：提取溶剂为去离子水，料液比为1:30(g:mL)，提取温度为28℃，用恒温摇床避光条件下180rpm提取60min。然后用100目尼龙布双层过滤，保留滤液，5000rpm条件下离心15min，静置1h(期间不能剧烈摇晃)。取上清液，用定性滤纸抽滤3次。

(4)皂苷等杂质去除：向滤液中加入无水乙醇，至乙醇体积百分数为80％，混合均匀后，室温下，8000rpm离心10min，收集沉淀，室温放置2h，等待乙醇挥发干，如果杂质较多，可以进行两次萃取除杂。将沉淀装入塑料袋中，封口后，在-20℃条件下冻结2天，直至完全冻结成固体。

实施例3

(3)甜菜素提取：提取溶剂为去离子水，料液比为1:10(g:mL)，提取温度为28℃，用恒温摇床避光条件下180rpm提取60min。然后用200目尼龙布双层过滤，保留滤液，5000rpm条件下离心10min，静置1h(期间不能剧烈摇晃)。取上清液，用定性滤纸抽滤3次。

(5)冷冻干燥：将(4)中固体分装至50mL EP管中，管口用保鲜膜封口，将管口保鲜膜扎孔，然后正放于冷冻干燥机内，-80℃、真空度22Pa条件下，冷冻干燥，直到干燥成粉末。

试验例1

本试验例采用制备标准曲线的方法，检验不同植物甜菜素含量、选择藜麦品种、对藜麦不同部位色素进行分析、以及不同部位质量比较、提取剂选择，下列列出了三种标准曲线和两个计算公式，本发明所有的试验检测均采用这三种标准曲线和两个计算公式进行。

1、标准曲线

首先，配置缓冲液，缓冲液包括40％乙醇溶液和1‰抗坏血酸，调pH为4.5。然后，称量0.05g甜菜素标准品，溶解到50mL上述缓冲液中，配成1mg/mL的甜菜素母液，将其用缓冲溶液梯度稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9、1mg/mL的甜菜素溶液，使用酶标仪检测OD₅₃₅，每次三个重复，取平均值，以甜菜素浓度为x轴，OD₅₃₅为y轴，制作标准曲线1(40％乙醇溶液制备的甜菜素标准曲线)；结果如图1，回归方程为y＝852.08x-0.0082，R²＝0.999。

称取0.05g甜菜素标准品，用去离子水配置成2mg/mL的甜菜素母液，将其用去离子水梯度稀释成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL 的甜菜素溶液，使用酶标仪检测OD₅₃₅，每次三个重复，取平均值，以甜菜素浓度为x轴，OD₅₃₅为y轴，制作标准曲线2(去离子水配置的甜菜素标准曲线)；结果如图2，回归方程为y＝180.17x-0.0011，R²＝0.999。

取0.01g齐墩果酸，用乙醇定容至10mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 液体于试管中，25℃，-85Kpa，60rpm/min旋转蒸发干，分别得到0、0.0002、 0.0004、0.0006、0.0008、0.001g齐墩果酸(藜麦皂苷)，加入0.2mL 5％香草醛-冰乙酸溶液，加入0.8mL高氯酸，混匀后，60℃水浴15min，冰浴10min，再加入5mL冰乙酸，混匀后，稀释10倍，使用酶标仪检测OD₅₄₅，每次三个重复，取平均值，以皂苷含量为x轴，OD₅₄₅为y轴，制作标准曲线3(藜麦皂苷的标准曲线)；其结果如图3，回归方程为y＝3.33x+0.0514，R²＝0.999。

式1中：W₁为甜菜素百分比含量，OD₅₃₅为样品在波长535nm处的吸光度值， OD_535空白为空白组在波长535nm处的吸光度值，R₁为甜菜素标准曲线的截距，n₁为样品稀释倍数，V为溶剂总体(mL)，k₁为标准曲线斜率，m₁为称取的样品质量(g)。

式2中：W₂为藜麦皂苷百分比含量，OD₅₄₅为样品在波长545nm处的吸光度值，OD_535空白为空白组在波长545nm处的吸光度值，R₂为甜菜素标准曲线的截距， n₂为样品稀释倍数，k₂为标准曲线斜率，m₂为称取的样品质量(mg)。

2、分析不同植物的甜菜素含量

2.1实验方法：

从市面上购买新鲜的白心火龙果，红心火龙果，红甜菜，仙人掌果，自备 ZL-7藜麦新鲜植株。分别称量3g的红心红龙果果皮、红心火龙果果肉，白心火龙果果皮、白心火龙果果肉、红甜菜根、仙人掌果肉、ZL-7藜麦种皮、ZL-7藜麦茎，加入50mL缓冲溶液，37℃，180rpm提取30min，静置1h，4℃，5000rpm 离心15min。取上清液，从波长350nm到700nm分别对火龙果果皮是色素、红甜菜色素、仙人掌果色素、藜麦色素、1％甜菜素标准品进行光谱扫描；其结果如图4。通过酶标仪检测上述组分中OD₅₃₅，每组3个重复，取平均值，通过标准曲线1计算甜菜素含量，其结果如图5。

2.2实验结果：

(1)如图4所示，各种植物中色素在535nm左右处有特征吸收峰。

(2)如图5所示，测得红心红龙果果皮、红心火龙果果肉、白心火龙果果皮、白心火龙果果肉、红甜菜根、仙人掌果肉、ZL-7藜麦种皮、ZL-7藜麦茎中甜菜素百分比含量分别为2.3368±0.3257％、4.1757±0.2573％、1.5990±0.7694％、 0.0197±0.0413％、18.7421±2.5998％、18.9021±2.1678％、13.4592±0.0474％、 2.0619±0.1453％。

3、藜麦品种分析

在已有的多份藜麦资源中，筛选出颜色较深的藜麦植株，植株成熟后，采收地上部分，将其在40℃条件下烘干3天后，将藜麦茎秆、种皮、种子等组分分离，检测藜麦茎秆中的甜菜素含量；部分藜麦植物图片如图6。如图6所示， ZL-7红色较深，并且ZL-7植株茁壮，种植规模较大，材料来源便捷，所以选择 ZL-7藜麦为实验材料。

4、ZL-7藜麦部位色素的含量分析

4.1实验方法

采收熟后新鲜的ZL-7藜麦植株，将其茎、分枝、叶柄、叶片、种皮、穗分离，称取1g左右样品，加入50mL缓冲溶液，37℃，180rpm提取30min，静置 1h；然后，4℃，5000rpm离心15min，静置到室温；以缓冲溶液为空白组，每组三个重复，全程避光操作。使用酶标仪检测OD₅₃₅，计算平均值，通过标曲1 计算甜菜素含量，其结果附图7。

4.2实验结果

如图7所示，新鲜的ZL-7藜麦茎、分枝、叶柄、叶片、种皮、穗甜菜素百分比含量分别为2.062±0.1145％、3.0378±0.1716％、2.1586±0.164262％、9.6979±0.1508％、13.4590±0.1632％、4.2670±0.1630％，其中种皮中甜菜素含量最高。

5、藜麦ZL-7不同部位质量分析

5.1实验方法

将ZL-7藜麦地上部分采收，40℃烘干3天，将种子、叶片、种皮、秸秆分离，称重，计算各组分的质量占比，结果如图8。

5.2实验结果

如图8所示，ZL-7植株干样中种子、叶片、种皮、秸秆各占41.6％、10.4％、 6.3％、41.7％，其中副产物质量占总质量体58.4％，可见副产物的回收利用可以提供可观的产量以及资源回收。

6、提取剂的分析

分别取5mL去离子水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、石油醚、食用油、乙二醇、乙酸乙酯、50％甲醇、50％乙醇、50％丙酮、50％乙二醇、50％丙三醇于试管中，分别加入0.2g左右ZL-7种皮，37℃，180rpm提取30min，静置1h；然后，4℃，5000rpm离心15min，静置到室温，以对应提取剂为空白组，每组三个重复，全程避光操作，使用酶标仪检测OD₅₃₅，计算甜菜素提取率。

在实验中发现，ZL-7甜菜素不溶于食用油、丙酮、氯仿、石油醚、甲醇、乙酸乙酯、乙醇等溶剂，可溶于乙二醇、50％乙醇、去离子水、50％丙三酮、50％乙二醇、50％甲醇、50％丙酮；其结果如图9，ZL-7甜菜素在乙二醇中溶解度最大，其次是去离子水和50％乙醇溶液，但是，在50％乙醇和去离子水中的溶解性没有显著性差异，在50％丙酮、50％乙二醇、50％甲醇、50％丙三酮中溶解度逐渐降低。

继续用无水乙醇与水配置成0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液，各取10mL乙醇溶液，分别加入0.5g ZL-7藜麦种皮，37℃，180rpm提取30min，静置1h；4℃，5000rpm离心15min，静置到室温；以对应提取剂为空白组，每组三个重复，全程避光操作。使用酶标仪检测OD₅₃₅，计算甜菜素提取率。其结果如图10，藜麦甜菜素随着乙醇溶浓的浓度增大时，甜菜素的溶解度逐渐降低，当乙醇浓度大于60％后，甜菜素的溶解度显著下降。因此本发明中的提取剂在通过不同浓度乙醇的提取效果以及提取成本和食品安全性等多角度考虑，而选择了去离子水作为提取剂。

试验例2---提取过程的单因素试验

2.1提取时间

分别称取三份0.5g左右的ZL-7藜麦种皮于锥形瓶中，分别加入50mL去离子水，于摇床中37℃，180rpm震荡，分别在0min、1min、5min、10min、15min、 30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h时进行取样，静置1h后，在4℃、5000rpm条件下离心15min，检测OD₅₃₅，全程避光操作。

其结果如图11，随着提取时间增加，甜菜素百分比含量逐渐上升，在1.5h 达到最高点，随着时间的继续增加，甜菜素百分比含量逐渐下降。

2.2提取料液比

以ZL-7藜麦种皮为原材料，去离子水为提取剂，将料液比配置为1:1、1:2、 1:4、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:400、 1:1000(g:mL)，于摇床中37℃，180rpm震荡30min，静置1h后，5000rpm条件下离心15min，检测OD₅₃₅，每组3个重复，全程避光操作。

其中料液比为1:1和1:2(g:mL)的组分中，溶剂太少，无法检测；其它组分的检测结果如图12所示，随着料液比的增大，藜麦甜菜素百分比含量逐渐升高，当料液比为1:30(g:mL)时达到最高点，当料液比超过1:30(g:mL)后，甜菜素百分比含量逐渐下降。

2.3提取温度

称取0.1g左右的ZL-7藜麦种皮，加入20mL去离子水，将提取温度设置为 0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，180rpm条件下震荡30min，静置1h，5000rpm条件下离心15min，检测OD₅₃₅，每组三个重复，全程避光操作。

其结果如图13，随着提取温度的上升，甜菜素提取率逐渐上升，当温度大于50℃后，甜菜素提取率逐渐降低。

2.4摇床转速

称取0.1g左右的ZL-7藜麦种皮，加入20mL去离子水，将摇床转速梯度设置为0rpm、50rpm、100rpm、150rpm、200rpm、250rpm，温度设置为30℃，震荡时间为30min，结束后静置1h，5000rpm条件下离心15min，检测OD₅₃₅，每组三个重复，全程避光操作。

其结果如图14，随着摇床转速的增加，藜麦甜菜素的提取率逐渐上升，当摇床转速高于150rpm后，甜菜素提取率趋于稳定。将藜麦甜菜素提取时摇床转速设定为150rpm，减少提取藜麦甜菜素时的能耗。

试验例3---响应面优化试验

使用Deseign-Expert 12进行响应面分析，其响应面因素如表1所示，试验设计及结果如表2所示，回归模型显著性检验及方差分析结果如表3所示，响应面优化结果见图15.

表1响应面因素水平编码

名称	单位	最低值	最高值
				A-溶剂体积	mL	20	40
B-温度温度	℃	40	60
				C-时间	min	20	60

表2Box-Behnken试验设计及结果

表3回归模型显著性检验及方差分析

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
							Model	15.05	9	1.67	88.7	<0.0001	显著
A-溶剂体积	0.0061	1	0.0061	0.3212	0.5886	不显著
							B-温度	3.41	1	3.41	180.99	<0.0001	显著
C-时间	1.68	1	1.68	89.24	<0.0001	显著
							AB	0.0448	1	0.0448	2.38	0.167	不显著
AC	0.0006	1	0.0006	0.0344	0.8582	不显著
							BC	0.0141	1	0.0141	0.7479	0.4158	不显著
A2	1.63	1	1.63	86.44	<0.0001	显著
							B2	4.24	1	4.24	224.69	<0.0001	显著
C2	3.03	1	3.03	160.68	<0.0001	显著
							残差	15.05	9	1.67	88.7	<0.0001	显著
失拟值	0.0061	1	0.0061	0.3212	0.5886	不显著
							纯误差	3.41	1	3.41	180.99	<0.0001	显著

由上表1-3和图15可知，方差分析结果表明，各因素显著水平：提取温度> 提取时间>料液比(溶剂体积)，失拟项不显著，模型显著，表明实验值与预测值拟合度高，模型可信度高，回归方程的复相关系数R²＝0.9913，决定系数 R^2adj＝0.9801，实验模型可信度高。

用Deseign-Expert 12分析得到三个因素的关系拟合回归方程， Y＝9.65-0.0275*A-0.6531*B-0.4586*C-0.1059*AB+0.0127*AC-0.0594*BC-0.6222 *A²-1.00*B²-0.8482*C²。

响应面优化结果为料液比为1:20.03(g:mL)，提取温度为26.8℃，提取时间为34.82min，优化方案得到预计甜藜麦副产物菜素含量为9.815％。

综上所述，藜麦甜菜素最终提取条件最优的方案为：提取溶剂为去离子水，料液比为1:20(g:mL)，温度为27℃，提取时间为35min，摇床转速为150rpm。

试验例4---藜麦甜菜素线性化比较、纯度比较、得率检测

以试验例1-3得到的参数为准，提取藜麦甜菜素并进行各项试验。

(1)将藜麦秸秆、种皮等粉末用去离子水提取甜菜素，料液比为1:20(g:mL)，温度为27℃，提取时间为35min，摇床转速为150rpm。用100目尼龙布将滤液与滤渣分离，收集滤液，再5000rpm离心15min，取上清液，用定性滤纸抽滤两次，回收滤液，放入塑料袋中，封口后，于-20℃条件下冻结2～3天，直至完全冻结成固体。

(2)将冻结的藜麦甜菜素固体放入塑料盘中或EP管中，用保鲜膜包裹，再将管口保鲜膜扎孔后，正放于冷冻干燥机中，-80℃、20Pa条件下冷冻干燥，直到得到藜麦甜菜素粉末，用棕色瓶封装后，放于4℃冰箱内避光保存；得到的藜麦甜菜素粉末如图16，甜菜素粉末呈深红色，略微有颗粒状结晶，其粉末容易吸水，尽量避免将甜菜素粉末直接暴露于空气中。

(3)研究不同除杂方法对藜麦皂苷的影响和对藜麦甜菜素提取率的影响

通过过滤除杂处理，可减少藜麦甜菜素粗提物中的固形物杂质，用90％乙醇、1％活性炭、除泡沫三种方法去除皂苷，用去离子水做空白对照，每组三个重复。

其结果如图17、18，皂苷分别减少23.05％、45.04％、18.06％，但是甜菜素分别损失15.04％、27.53％、6.04％，综合甜菜素在乙醇中的溶解性考虑，选择用90％的乙醇溶液除皂苷。

在步骤(1)得到固体中加入无水乙醇使乙醇体积分数为90％，混匀后，室温下，8000rpm离心10min，收集沉淀，室温放置1-2h，等待乙醇挥发干，如果杂质较多，可以进行两次萃取除杂；如图19，甜菜素会以沉淀的形式析出，上层液体呈黄色。然后，收集沉淀，室温放置，等乙醇自然挥发，保留沉淀。

将上述采用90％的乙醇溶液除皂苷后得到的甜菜素(自提)和甜菜素标准品均配置成0.01g/mL，即1％的甜菜素母液，对自提1％的藜麦甜菜素和1％甜菜素标准品进行光谱扫描；其结果如图4，其最大吸收峰在535nm左右，与标准品和仙人掌果、红甜菜、火龙果等中色素的最大吸收峰保持一致。

同时，将0.01g/mL的甜菜素母液和自提藜麦甜菜素均梯度稀释成0.001、 0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01g/mL的溶液，分别检测OD₅₃₅，以甜菜素浓度为x轴，OD₅₃₅为y轴，进行线性拟合；其结果如图20，藜麦甜菜素浓度和OD₅₃₅呈线性相关。

称取0.1g自提的藜麦甜菜素粉末三份，配置成1‰的藜麦甜菜素水溶液，检测测得OD₅₃₅，测得吸光度分别为0.219、0.214、0.214，计算的自提藜麦甜菜素的平均纯度达到87.57±1.6％。

称取ZL-7藜麦秸秆、种皮等副产物混合物100g左右，各3份，用优化方案提取藜麦甜菜素，冷冻干燥后得到甜菜素粉末分别为9.67g、9.56g、9.43g，计算甜菜素得率为9.55±0.12％。

试验例5---甜菜素稳定性分析

(1)烘干天数

将新鲜藜麦植株放于40℃鼓风干燥箱，避光恒温干燥，分别在烘干到0、1、 2、3、4、5、6、7、8天进行取材，以去离子水，料液比为1:20，27℃，150rpm 提取35min，静置1h后，5000rpm离心15min，检测OD₅₃₅，计算甜菜素百分比含量，每组3个重复，取平均值。

其结果如图21，随着烘干天数的增加，藜麦副产物中甜菜素百分比含量显著上升，在烘干第三天时，甜菜素含量达到最大值，当烘干天数大于第4天后，甜菜素含量逐渐下降。

(2)温度的区间

将提取的藜麦甜菜素粗提液分装到10mL EP管中，分别在0、10、20、30、 40、50、60、70、80、90、100℃水浴锅中加热30min，冷却至室温后，检测OD₅₃₅，计算甜菜素百分比含量，每组3个重复，取平均值。

其结果如图22，藜麦甜菜素在0～30℃条件下比较稳定，其百分比含量无显著性差异，当温度从40℃升高到100℃时，甜菜素百分比含量显著性下降。

(3)pH的区间

用NaOH和HCl配置pH分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14的溶液，各称取0.5g藜麦甜菜素粉末，分别加入5mL对应pH的溶液， 37℃条件下放置30min，检测OD₅₃₅，每组三个重复，取平均值，用未加色素的溶液做空白对照，全程避光操作。

其结果如图23，藜麦甜菜素在pH值3～12时，甜菜素较稳定，甜菜素百分比含量处于波动状态，差异较小，当pH小于3和pH值大于12时，藜麦甜菜素百分比含量会显著性下降。

综上所述，本发明采用多项试验例对藜麦提取藜麦甜菜素的各项影响因素进行分析，其各自的分析结果如下，即本发明最终得到的最佳参数条件如下：

a预处理：藜麦成熟后，采收地上部分，烘干温度不超过40℃，烘干时间不超过3d，然后，将藜麦植株茎干、叶片、种皮分离，通过打粉机粉碎，过40 目筛，保留粉末，备用。

b甜菜素提取：提取溶剂为去离子水，pH在3-12以内，料液比为1:20(g:mL)，提取温度为27℃，用恒温摇床避光条件下150rpm提取35min。然后用100目尼龙布双层过滤，保留滤液，5000rpm条件下离心15min，静置1h(期间不能剧烈摇晃)。取上清液，用定性滤纸抽滤1-3次。

c杂质去除：向滤液中加入无水乙醇，至乙醇体积百分数为与80-100％，混合均匀后，室温下，8000rpm离心10min，收集沉淀，室温放置1-2h，等待乙醇挥发干，如果杂质较多，可以进行两次萃取除杂。将沉淀装入塑料袋或EP管中，封口后，在-20℃条件下冻结2～3天，直至完全冻结成固体。

d冷冻干燥：将EP管口用保鲜膜封口，将管口保鲜膜扎孔，然后正放于冷冻干燥机内，-80℃、真空度20Pa条件下，冷冻干燥，直到得到甜菜素粉末，全程避光操作；最终藜麦甜菜素得率为9.55±0.12％，平均纯度达到87.57±1.6％。

e储藏：基于甜菜素的稳定性实验结果和甜菜素粉末易吸水的特点，将甜菜素粉末储藏于棕色的玻璃瓶中，密封后，放于4℃冰箱避光保存。

虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims

1.一种从藜麦副产物中提取高纯度甜菜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)干燥：步骤(3)所得固体冷冻干燥，制成粉末即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藜麦地上部分包括植株茎干、叶片和种皮，所述藜麦的品种为ZL-7。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烘干的温度为30～40℃，烘干的时间为2～5d。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)粉碎后的粉末过10～40目筛。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为去离子水，提取的料液比为1g：10～30mL，提取的温度为25～30℃，提取方法为恒温摇床避光条件下以150～200rpm提取20～60min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤的方法为采用100～200目尼龙布双层过滤；所述步骤(2)离心的转速为5000rpm，离心的时间为10～15min，静置的时间为1h；所述步骤(2抽滤的方法为用定性滤纸抽滤1-3次。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇加入后，滤液中的无水乙醇体积分数为80％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min，静置的时间为1～2h；冷冻的温度为-20℃，冷冻的时间为2～3d。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)冷冻干燥的温度为-80℃，真空度为18～22Pa。