CN115381812A - 山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。由于核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦等存在着停药后反弹、耐药突变、交叉耐药等问题。而高剂量的重组干扰素也具有持续应答率低、副作用大等局限性。因此，治疗HBV感染引起的相关疾病尚缺乏十分有效的药物与手段。本发明的山奈酚可用作活性成分，应用于抗慢性乙型肝炎的药物中，开拓了山奈酚的新用途。此外，山奈酚与恩替卡韦的联合用药对于慢性乙型肝炎起到协同治疗作用，弥补了抗慢性乙型肝炎药物的不足之处。

Description

山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是急性肝炎、慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌的主要诱因，严重威害人类的生命和健康。目前全球大约有2.96亿人患有慢性乙肝感染，每年有150万新发感染者，2019年乙型肝炎导致约82万人死亡，2020年我国新发乙肝患者人数为90.63万人。乙型肝炎病毒可分为8个不同的基因型，即A、C、D、E、F、G、H。HBV高度的变异性与多样性决定了众多基因亚型的存在，基因亚型间序列差异至少大于4％。乙型肝炎病毒可以引起非常严重的并发症和死亡，对于慢性HBV感染，尚缺乏彻底清除病毒的治愈性药物，必需长期依赖于核苷类似物与干扰素类药物来降低血清HBV拷贝数。
山奈酚是一种黄酮类化合物，它主要来源于姜科植物山柰的根茎，广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中，人们已经从茶叶、椰菜、巫榛子、蜂胶、柚子以及其他绿色植物提取到它的纯品。因其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效而受到人们的广泛关注。山奈酚资源丰富，易于提取分离，是一种具开发潜力的药物资源，在食品和医药领域表现出很好的应用前景。
由于核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦等存在着停药后反弹、耐药突变、交叉耐药等问题。而高剂量的重组干扰素也具有持续应答率低、副作用大等局限性。因此，治疗HBV感染引起的相关疾病尚缺乏十分有效的药物与手段。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种山奈酚的新用途，具体的提供一种山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
技术方案：本发明的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
本发明通过实验证实，山奈酚可显著抑制HBV DNA和RNA的表达量，具体的，山奈酚可以显著影响HBV的转录过程，其在5、25μmol/L对HBV pgRNA的抑制率分别为48.44％、53.59％；山奈酚可以显著影响HBV DNA的表达量。山奈酚在1、5、25μmol/L对上清HBV DNA的抑制率分别为54.09％、73.59％、94.54％。山奈酚可以显著抑制小鼠血清中HBV DNA的表达量，并且抑制率随着剂量和时间的增加而增加，山奈酚在10、20、40mg/kg对小鼠肝脏组织HBV DNA的抑制率分别为29.20％、39.58％、54.35％；山奈酚与恩替卡韦联合用药对于HBV起到协同治疗的作用，联合给药组对小鼠肝脏组织HBV DNA的抑制率为88.30％。
进一步地，所述的药物为山奈酚作为唯一活性成份或包含山奈酚的药物组合物。
进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
进一步地，所述的药物组合物包括山奈酚和恩替卡韦。
进一步地，药物组合物中山奈酚的含量为0.1-99wt％。
进一步地，山奈酚的给药量为10-40mg/kg。
另一方面，本发明提供一种山奈酚在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的应用。
本发明通过实验证实，山奈酚可显著抑制HBV DNA和RNA的表达量，并随着剂量和药物作用时间的增长抑制率也随之增加。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述的山奈酚可用作活性成分，应用于抗慢性乙型肝炎的药物中，开拓了山奈酚的新用途。此外，山奈酚与恩替卡韦的联合用药对于慢性乙型肝炎起到协同治疗作用，弥补了抗慢性乙型肝炎药物的不足之处。
附图说明
图1为山奈酚给药6天和9天后HBeAg的表达量；
图2为山奈酚给药6天和9天后HBsAg的表达量；
图3为山奈酚给药6天后HBV pgRNA的表达量；
图4为山奈酚给药6天后HBV总RNA的表达量；
图5为山奈酚给药9天后HBV DNA的表达量；
图6为山奈酚单独给药和与恩替卡韦联合给药后HBV DNA的表达量；
图7为山奈酚给药后小鼠血清中HBV DNA的表达量；
图8为山奈酚给药后小鼠肝脏中HBV DNA的表达量；
图9为山奈酚给药后小鼠肝组织H&E染色检测HBcAg的表达量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
HepG2.2.15细胞培养：
HepG2.2.15细胞系用10％胎牛血清，青霉素100IU/ml及链霉素100ug/ml，G418400μg/ml的DMEM培养基培养，37℃，5％CO2的条件下培养。
山奈酚对HepG2.2.15细胞毒性：
HepG2.2.15细胞按1×103个/孔浓度接种到96孔板中置37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，将细胞用PBS洗2次，分别加入含不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200、400μmol/L)山奈酚的100μL细胞维持液，实验设置正常细胞对照组，每个浓度设置3个复孔。HepG2.2.15细胞于37℃培养9天，每三天换新鲜给药培养基，每日观察细胞状态。最后采用CCK8法测定细胞活力，每孔加入CCK8 10μL，避光放置30min，在450nm处检测其吸光度。实验共重复3次，计算细胞毒性。
细胞存活％＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100％
表1山奈酚对HepG2.2.15的细胞毒性
Figure BDA0003864039450000031
实施例2
山奈酚对HBV抗原分泌的抑制作用
HepG2.2.15细胞按5×104个/孔浓度接种到24孔板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。将含有不同浓度山奈酚的DMEM培养基维持液加入HepG2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/L。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳性药恩替卡韦组。组将细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h，收集培养上清至1.5ml EP管内，置于-20℃冰箱保存。用ELISA试剂盒检测山奈酚处理HepG2.2.15细胞6天、9天的HBV抗原分泌的量。
结果见附图1，2，山奈酚对HBeAg及HBsAg都存在抑制作用，并随着剂量和药物作用时间的增长抑制率也随之增加。
实施例3
山奈酚对HBV RNA的抑制作用
HepG2.2.15细胞核5×104个/孔浓度接种到24孔板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。将含不同浓度山奈酚的DMEM培养基维持液加入HepG2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/L。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳性药恩替卡韦组。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每3天换一次新鲜的含药培养基，6天后利用Trizol法提取胞内RNA。qRT-PCR检测山奈酚对胞内HBV相关RNA的转录影响。
附图3实验结果表明山奈酚可以显著影响HBV的转录过程，发现其在5、25μmol/L对HBV pgRNA的抑制率分别为48.44％、53.59％。附图4实验结果表明山奈酚对HBV总RNA的抑制效果较好，在5、25μmol/L对HBV mRNA的抑制率分别为56.67％、73.90％。综上结果表明山奈酚在25μmol/L对HBV RNA的抑制率都高达50％，说明其可以显著性抑制HBV相关RNA的转录，且存在剂量依赖性关系。
实施例4
山奈酚对HBV相关DNA的抑制作用
HepG2.2.15细胞核1×105个/孔浓度接种到12孔板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。将含不同浓度山奈酚的DMEM培养基维持液加入HepG2.2.15细胞中，使得孔中药物终浓度为1、5、25μmol/L。实验还设有不加药的正常细胞对照组以及阳性药恩替卡韦组。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每3天换一次新鲜的含药培养基，9天后用QIAamp DNABlood Mini Kit检测试剂盒提取培养上清中HBV DNA，qRT-PCR检测HBV DNA的表达量。
附图5实验结果表明山奈酚可以显著影响HBV DNA的表达量。山奈酚在1、5、25μmol/L对上清HBV DNA的抑制率分别为54.09％、73.59％、94.54％。表明山奈酚对上清HBVDNA抑制存在剂量依赖关系。附图6实验结果表明山奈酚与恩替卡韦联合给药对上清HBVDNA抑制起到协同作用。
实施例5
山奈酚在动物水平对HBV的抑制作用
将10μg PAAV-HBV1.2质粒通过高压尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，随机分成7组(空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、联合给药、组阳性药组)，每组6只小鼠。通过灌胃给与相应的药物，空白组不做任何处理，模型组给与同体积的PBS。每4天小鼠眼静脉取血，第20天解剖小鼠取肝脏组织。QIAamp DNA Blood Mini Kit检测试剂盒提取血清中HBV DNA，qRT-PCR检测HBV DNA的表达量。
附图7实验结果表明山奈酚可以显著抑制小鼠血清中HBV DNA的表达量，并且抑制率随着剂量和时间的增加而增加。山奈酚和恩替卡韦的联合给药与体外实验结果一致起到协同作用。附图8实验结果表明山奈酚可以显著抑制小鼠肝脏组织中HBV DNA的表达量。山奈酚在10、20、40mg/kg对小鼠肝脏组织HBV DNA的抑制率分别为29.20％、39.58％、54.35％。联合给药组对小鼠肝脏组织HBV DNA的抑制率为88.30％。附图9免疫组化结果表明山奈酚给药组和联合给药组小鼠肝脏组织中HBcAg阳性细胞数显著减少，且联合给药组比阳性药组抑制效果更好。
以上结果表明山奈酚可以显著抑制HBV感染的体内和体外模型中HBV的复制。

Claims (7)

1.山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为山奈酚作为唯一活性成份或包含山奈酚的药物组合物。
3.根据权利要求1所述的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
4.根据权利要求2所述的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括山奈酚和恩替卡韦。
5.根据权利要求3所述的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，药物组合物中山奈酚的含量为0.1-99wt％。
6.根据权利要求3所述的山奈酚在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的应用，其特征在于，山奈酚的给药量为10-40mg/kg。
7.山奈酚在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的应用。
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