CN115364271A - 一种基于Janus颗粒的可形变、可显影、高载药乳滴栓塞微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Janus颗粒的可形变、可显影、高载药乳滴栓塞微球及其制备方法。其利用两亲性的Janus颗粒作为稳定剂，在碘化油和化疗药物体系中，通过剪切乳化得到的油包水型或水包油型乳滴栓塞微球，粒径为10～1000微米。其具有高载药能力及优良的缓释特性，可有效提高肿瘤局部药物浓度、降低药物突释带来的副作用。其还具有良好的分散性和稳定性，介入手术时在微导管中通过性好且不易堵管，栓塞术中X线透视下即能肉眼分辨单个乳滴微球。还具有良好的粘弹形变特性和机械性能，可适应血管的尺寸，并且长时间乳液滴微球显影性不减弱，制备成本低廉，可快速大量制备。

Description

一种基于Janus颗粒的可形变、可显影、高载药乳滴栓塞微球 及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种基于Janus颗粒的可形变、可显影、高载药乳滴栓塞微球及其制备方法。

背景技术

栓塞剂是一种具有栓塞肿瘤血管，促进肿瘤缺血、坏死的临床药物。从1978年，日本学者Yamada教授提出TACE(经导管动脉化疗栓塞术)概念，到1990年，Hori教授等首先提出并在实验室合成吸水性载药微球。

肝动脉化疗栓塞术(TACE，transcatheter arterial chemoembolization)因其有效性和高效性的优势，已成为肝癌最有效的治疗方法之一。TACE中的栓塞微球具有不同的化学组成和特殊的形态结构，造就了此类微球独特的物理化学性质，进而引起了人们极大的研究兴趣。目前，临床上TACE疗法主要包括两种体系：(1)碘化油和药物栓塞化疗体系，即C-TACE体系；(2)固态载药微球栓塞化疗体系，即D-TACE体系。C-TACE碘化油体系因在X光下显影及可携载多种化疗药，已被临床广泛使用。但是，相关技术中的C-TACE碘化油体系悬浮不稳定，容易分层，易致药物突释，栓塞作用弱，使用时仍需加用明胶海绵或空白微球进行栓塞。而D-TACE载药微球虽然提升了药物缓释和血管栓塞效能，但是临床使用的D-TACE微球不具备X光下显影的能力，且载药种类单一，同时只可携带正电荷的水溶性药物，目前尚无携带脂溶性药物的报道。故现有的两类栓塞剂体系均存在使用缺陷，目前临床急需一种将碘化油乳液体系和载药微球体系两者优点能相结合的栓塞剂药物，以能够同时达到可显影、药物缓释和血管栓塞的目的。而且，现有的微球还存在不少的问题，如1)阻断肿瘤供效应单一，由于栓塞剂粒径相对固定，其往往留存于肿瘤供血动脉内，仅能阻断肿瘤血供。肿瘤细胞在缺氧状态下，可启动自噬、乳酸代谢途径等方式继续存活，引起栓塞后肿瘤复发；2)由于不同种类的栓塞剂其比重、表面电荷不同，在溶液中的悬浮性、分散性、流动性较差，注射速度过快可能会导致导管堵塞；3)不具备显影、微环境响应、协同治疗作用；4)制备产率低，且所得到的颗粒均一性及单一分散性差；5)合成及后处理过程复杂等，这些问题在很大程度上限制了栓塞剂微球的进一步应用。

相关技术中，合成栓塞微球的方法主要有：乳化法制备工艺、喷雾干燥制备工艺、单凝聚制备工艺、膜乳化法、溶剂-非溶剂制备工艺等。然而，具有可显影、载药及肿瘤栓塞功能的栓塞微球的研究与开发还处于起步阶段，制备难度较大，在合成上具有很大的局限性，可以说，在现有环境下制备可显影、载药及肿瘤栓塞功能的栓塞微球并实现规模化生产是目前医学材料科学领域中颇具挑战性的工作。

因此，开发一种简单有效，且能够同时具有可显影、载药和栓塞肿瘤的栓塞剂的制备方法显得尤为重要，其对于后续产业的扩展与开发营造了有利的物质基础和有效的技术支持条件。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于Janus颗粒的可形变、可显影、高载药乳滴栓塞微球及其制备方法，该方法基于剪切乳化的方法，使活性剂Janus颗粒与油滴表面充分接触，从而提升乳液滴的表面张力，得到了一种稳定的具有可显影、载药和栓塞肿瘤血管的乳液滴微球(乳滴栓塞微球)。该乳液滴微球能够兼具可形变、显影、载药、栓塞等多种功能，对新一代血管或肿瘤栓塞药物的开发提供了有利的物质基础和有效的技术支持。

本发明的第一个方面，提供一种乳液滴微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将肿瘤化疗药物与显影剂混合，得到油相溶液；

(2)加入含有两亲性Janus颗粒的水性溶液，剪切乳化，得到乳液滴微球。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述显影剂包括碘化油、碘苯酯、碘化钠、泛影葡胺、碘海醇、硫酸钡、碘克沙克、碘苯六醇、碘普罗胺、碘必乐、碘曲仑中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒包括含有如下物质中的至少一种的Janus颗粒，所述物质包括：聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物、、聚己内酯丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯、聚异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酸、聚乙二醇-聚己内酯-聚甲基丙烯N,N-二甲基氨基乙酯、聚氧化乙烯-聚己内酯-聚氧化乙烯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酸、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酰胺、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚甲基丙烯酰胺、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酸羟乙酯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚马来酸酐、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚马来酸、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚衣康酸。

在本发明的一些实施方式中，所述Janus颗粒的引入可显著提高所合成的栓塞剂的均一性和稳定性。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的形状包括圆球形、椭球型、月牙状、囊泡状、盘状、蘑菇状、哑铃状、树莓状、雪人状(葫芦形)、核壳状。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的制备方法包括微流合成、拓扑选择表面改性、模板自组装、可控相分离、可控表面成核。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，采用本领域其他已知Janus颗粒制备方法进行制备或采用市售Janus颗粒，其制备方法包括但不限于上述方法。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒是以疏水性聚苯乙烯作为种子，加入十二烷基硫酸钠(SDS)后超声分散；然后加入1-氯癸烷(CD)；混合均匀后，加入苯乙烯(St)、二乙烯基苯(DVB)、丙烯酸(AA)和偶氮二异丁腈(AIBN)的十二烷基硫酸钠(SDS)混合液，再加入聚乙烯醇(PVA)，在无氧环境下进行聚合，得到两亲性Janus颗粒。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的粒径为0.001～1000μm。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的粒径为0.01～10μm。

在本发明的一些实施例中，所述两亲性Janus颗粒的粒径为2.36±0.5μm。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的浓度为0.1～10000mg/mL。

发明人发现，在制备乳液滴微球时，两亲性Janus颗粒的浓度会对乳液滴微球的粒径带来影响。其中，发现随着Janus颗粒浓度的增大，乳液滴微球粒径显著降低，说明本发明中的乳液滴微球的粒径可以基于使用的Janus颗粒浓度进行调整，且具有明显的线性关系。

在本发明中，Janus颗粒在水性溶液中的的浓度对最后制备得到的栓塞剂微球的形貌及粒径起关键性的作用。

在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球的制备方法具体为：

(1)将肿瘤化疗药物、显影剂与油红混合，0～60℃超声1～100min，得到油相溶液；

(2)加入含有两亲性Janus颗粒的水性溶液，剪切乳化，得到乳液滴微球。

在本发明的一些实施方式中，所述剪切乳化的转速为1～20000rpm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述剪切乳化的转速为500～1000rpm。

在本发明的一些优选实施方式中，所述剪切乳化的转速为800rpm。

在本发明的一些实施方式中，剪切乳化的温度为20～60℃。

在本发明的一些实施方式中，剪切乳化的时间为1～1000min。

在本发明的一些优选实施方式中，所述剪切乳化的时间为20～40min。

在本发明的一些优选实施方式中，所述剪切乳化的时间为30min。

在本发明中，发明人基于水包油体系中，以碘油和两亲性活性剂Janus颗粒为基本构筑单元，通过剪切乳化技术构筑稳定的水包油乳液滴，通过控制剪切乳化的时间、温度、转速、油水比、Janus浓度等条件，实现一系列不同粒径及形貌的栓塞剂的合成。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的浓度为1～10000mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的浓度为1～100mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的浓度为1～60mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述两亲性Janus颗粒的浓度约为3.5mg/mL。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液和水性溶液的体积比为1～1000：1～1000。

发明人发现，在制备乳液滴微球时，所述油相溶液和水性溶液的体积比(油水比)会对乳液滴微球的粒径带来影响。其中，发现随着油水比的增大，乳液滴微球粒径显著降低，说明本发明中的乳液滴微球的粒径可以基于油水比的调整进行调整，具有明显的线性关系。

而且，基于油相溶液和水性溶液的体积比的差异，制备得到乳液滴微球可以为水包油型或油包水型。

在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液和水性溶液的体积比为1：1～1000。

在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液和水性溶液的体积比为1：25～200。

在本发明的一些实施方式中，所述油相溶液和水性溶液的体积比约为1：50。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤化疗药物包括铂类药物、蒽环类药物、紫杉醇类药物、抗嘧啶类药物、长春碱类药物、喜树碱类药物、亚硝酸类药物、抗叶酸类药物、其他常规抗肿瘤药。

在本发明的一些实施方式中，所述铂类药物包括顺铂(Pt)、卡铂、奥沙利铂、洛铂、奈达铂、草酸铂。

在本发明的一些实施方式中，所述蒽环类药物包括多柔比星、表柔比星、吡柔比星。

在本发明的一些实施方式中，所述紫杉醇类药物包括紫杉醇、多西紫杉醇。

在本发明的一些实施方式中，所述抗嘧啶类药物包括氟尿嘧啶、吉西他滨、安西他滨、卡培他滨，替西氟、氟脲苷、优福定。

在本发明的一些实施方式中，所述长春碱类药物包括长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨。

在本发明的一些实施方式中，所述喜树碱类药物包括伊立替康、拓扑替康、卢比替康。

在本发明的一些实施方式中，所述亚硝酸类药物包括卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀。

在本发明的一些实施方式中，所述抗叶酸类药物包括甲氨蝶呤、培美曲塞、洛拉曲塞、雷替曲塞。

在本发明的一些实施方式中，所述其他常规抗肿瘤药包括博来霉素、平阳霉素、舒尼替尼、吉非替尼、索拉菲尼、伊马替尼、瓦他拉尼、米托蒽醌。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，使用其他抗肿瘤药进行替换使用，包括但不限于上述药物。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤化疗药物的加入量为0.1mg～100g。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤化疗药物的加入量为1mg～100mg。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤化疗药物的加入量为1mg～20mg。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤化疗药物的加入量约为6mg。

发明人发现，在制备乳液滴微球时，所述肿瘤化疗药物的加入量会对乳液滴微球的包封效果带来影响。其中，发现在1～6mg的肿瘤化疗药物使用量范围中，乳液滴微球的药物包封率会随着肿瘤化疗药物使用量的增加而增加，但一旦超过6mg，乳液滴微球的药物包封率反而会随着肿瘤化疗药物使用量的增加而下降，但整体的包封率仍相对于3mg及其以下的负载药物使用量所带来的药物包封率要高。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述制备方法制备得到的乳液滴微球，所述乳液滴微球的粒径为0.01-1000μm。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球的粒径为10～500μm。

在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球的粒径为25～500μm。

在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球的粒径约为150±8μm。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球在外力作用下会发生形变或融合。

在本发明的一些实施方式中，所述乳液滴微球的形貌包括圆球形、椭球形、面包型、哑铃型、开心果型、葫芦形、子弹型。

在本发明中，发明人发现该乳液滴微球在没有外界作用力时保持稳定的圆球形形态。而当对其施加不同方向的外力时，受到外力作用后的乳液滴微球可形变为椭球型、哑铃型及葫芦形等形状，且不会破碎。基于此，类比在栓塞血管时，当血管直径大于乳液滴微球直径时，乳液滴微球在血管内保持圆球形形态。当血管直径小于乳液滴微球时，血管会对乳液滴微球施加外力，乳液滴微球由于压力而出现粘弹性形变，在血管中出现椭球型。

而且，发明人还发现，当血管中两个乳液滴微球接触后，在外界外力作用下，两个乳液滴微球的最先接触的点会融合，合并成一个哑铃型的乳液滴微球。而一般情况下，注射入肿瘤血管中的乳液滴微球的粒径并不完全相同，故大小不一的乳液滴微球在外力的作用下，其相互接触的点会先融合，从而使大小不一的两个乳液滴微球形成哑铃型或葫芦形等特殊的形态。同时，由于乳液滴微球之间的不断融合，乳液滴微球的长度会变长，原本栓塞血管的乳液滴微球会向血管更深一级的位置移动，通过这种乳液滴形态不同变化，肿瘤血管最终会被完全彻底栓塞。

本发明的第三个方面，提供一种试剂，所述试剂中含有本发明第二个方面所述的乳液滴微球和/或其他药学上可接受的辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、染剂、润滑剂。

本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述的乳液滴微球在制备如下(1)～(3)中任一项所述产品中的应用；

(1)血管栓塞产品；

(2)造影剂；

(3)抗肿瘤药物。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括任意可以通过血管栓塞进行治疗的相关肿瘤疾病。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、肾癌、子宫肌瘤、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺恶性肿瘤。

本发明的有益效果是：

1、本发明提出了一种乳液滴微球的制备方法，其基于两亲性Janus颗粒包被含有可显影类的油相溶液中，再通过剪切乳化方式使两亲性Janus颗粒与油相表面充分接触，从而提升乳液滴的表面张力，得到了一种稳定的具有可显影、载药和栓塞肿瘤血管的乳液滴微球(乳滴栓塞微球)，从而打破了传统的化学合成不均一、不稳定、不可显影的球形颗粒的限制。

2、本发明中的乳液滴微球在可以作为栓塞剂的同时，还兼具可显影、载药和栓塞肿瘤的功能，其载药组分可灵活调整，并通过乳液滴微球中组分的比例、剪切乳化条件等调节其粒径等参数的大小，具有形态可变的特点，且具有可进一步修饰的潜力。

3、基于本发明中的乳液滴微球的粒径大小及形变能力，其可以有效用于不同癌症的血管栓塞，以及动脉瘤、子宫肌瘤、创伤和消化道出血等方面，具有极高的灵活性，有着巨大的临床应用前景。

4、本发明中的制备和使用方法工艺简单、实验条件易控，后处理方法及贮存简单易行，具有一定的临床TAE治疗的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中的Janus颗粒的表征图像。

图2为本发明实施例中的乳液滴微球的显微镜明场图像(A)及其粒径分布图(B)。

图3为不同负载药物量的乳液滴微球的包封效果对比。

图4为不同顺铂负载药物量的乳液滴微球与对应顺铂溶液的细胞毒性效果对比。

图5为本发明实施例中的乳液滴微球在毛细玻璃管中堆积图示以及乳液滴微球的不同形变图示，其中有为圆球形、椭球型、哑铃型和葫芦形(A)以及其部分放大图(B)。

图6为本发明实施例中的乳液滴微球在SD大鼠肝脱细胞模型的栓塞实验图像(A)及其部分放大图(B)。

图7为本发明实施例中的乳液滴微球对新西兰大白兔肝动脉的栓塞效果。

图8为本发明实施例中的乳液滴微球对新西兰大白兔动脉的栓塞效果，其中，(A)为栓塞前造影，(B)为栓塞后复查图像，(C)为栓塞14天后的造影复查图像。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1乳液滴微球的制备

(1)制备两亲性的Janus颗粒：

取0.2g粒径为1.22μm的疏水性聚苯乙烯作为种子，加入20.0mL十二烷基硫酸钠(SDS，0.25％w/v)水溶液中，超声分散，得到种子分散体。加入0.1mL 1-氯癸烷(CD)，在40℃下搅拌20h。然后将苯乙烯(St)、二乙烯基苯(DVB)、丙烯酸(AA)和40.0mg偶氮二异丁腈(AIBN)添加到10.0mL SDS(0.25％w/v)溶液中，超声分散获得单体/水乳液。将得到的单体/水乳液加入至1-氯癸烷(CD)和种子分散体的混合液中，在40℃下搅拌6h。加入5.0mL PVA(聚乙烯醇)水溶液(1％w/v)，然后通入氮气5min以隔绝空气，在70℃下聚合14h，得到具有各向异性的Janus颗粒混合物。将Janus颗粒混合物在10000转速下离心10min，用乙醇清洗3次。用5000转速纯水离心10min，去除上清液，真空冷冻干燥得到Janus颗粒冻干粉。

对制备得到的Janus颗粒进行表征，结果如图1所示。

可以发现该Janus颗粒的粒径约为2.36±0.5μm。

(2)乳液滴微球的制备：

取负载药物(在本实施例中，负载药物为顺铂，使用量为6mg)，加入1μg油红染料和0.1mL碘化油，其中，油红染剂的加入是为了便于观察乳液滴微球的形态特征。混合均匀后，超声处理20min，得到油相溶液。称取7mg上述Janus颗粒冻干粉，加入2mL纯水复溶，超声分散10min，得到3.5mg/mL的Janus颗粒水溶液。取1mL Janus颗粒水溶液，加入5mL纯水进行稀释，得到Janus颗粒水性溶液。将油相(0.1mL)和水性溶液(5mL)进行混合，使用粒径为1.5cm的转子，以转速800rpm的条件剪切乳化30min。剪切乳化结束后，取出转子，将转子表面粘附的溶液反复冲洗至原混合液中，保持混合液体积始终不变。密封好容器，手动顺时针匀速转动容器，使混合液中的微球在混合液底部均匀分散开，得到乳液滴微球。

乳液滴微球的保存需吸出3mL混合液上部的溶液部分，沿容器壁回填入3mL纯水。反复进行5次。常温存放。

取出本实施例中制得乳液滴微球，使用光学显微镜进行观测。

结果如图2所示。

可以发现，经显微镜下表征可见本实施例中制得乳液滴微球的形态结构为圆球形，且该乳液滴微球具有良好的尺寸分布及单一分散性，经测定乳液滴微球的平均粒径约为150±8μm。

测试例1 Janus颗粒浓度对乳液滴微球的影响

按照上述实施例1中的制备方法，将碘油替换为罂粟乙碘油(恒瑞医药)。分别使用1、5、10、30和60mg/mL的Janus颗粒水溶液制备水性溶液。最终混合时的油水比保持为1：50(v/v)。得到基于不同Janus颗粒浓度的乳液滴微球。

取出本实施例中制得的基于不同Janus颗粒浓度的乳液滴微球，使用光学显微镜进行观测，测定其粒径分布情况。

结果如表1所示。

表1 基于不同Janus颗粒浓度的乳液滴微球粒径分布情况

Janus颗粒浓度	1mg/mL	5mg/mL	10mg/mL	30mg/mL	60mg/mL
						乳液滴微球粒径(μm)	479.84±30	110±5	80.24±10	48.98±15	25.19±10

可以发现，随着Janus颗粒浓度的增大，乳液滴微球粒径显著降低，说明上述实施例中的乳液滴微球的粒径可以基于使用的Janus颗粒浓度进行调整，且具有明显的线性关系。

测试例2 油水比对乳液滴微球的影响

按照上述实施例1中的制备方法，将碘化油替换为不同体积的罂粟乙碘油，使油水比分别为1：25、1：50、1：100和1：200。Janus颗粒水溶液的浓度固定为3.5mg/mL。得到基于不同油水比对的乳液滴微球。

取出本实施例中制得的不同油水比对的乳液滴微球，使用光学显微镜进行观测，测定其粒径分布情况。

结果如表2所示。

表2 基于不同油水比的乳液滴微球粒径分布情况

油水比	1:25	1:50	1:100	1:200
					乳液滴微球粒径(μm)	443.84±20	130±5	109.35±10	62.97±15

可以发现，随着油水比的增大，乳液滴微球粒径显著降低，说明上述实施例中的乳液滴微球的粒径可以基于油水比的调整进行调整，具有明显的线性关系。

测试例3 乳液滴微球的药物包封率、药物释放效果和细胞毒性

(1)药物包封率：

按照上述实施例1中的制备方法，Janus颗粒水溶液的浓度固定为3.5mg/mL，最终混合时的油水比保持为1：50(v/v)，负载药物分别为1mg、3mg、6mg、9mg、15mg、20mg的顺铂。制得乳液滴微球后，消解处理得到样品液，使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定样品液中顺铂的质量，从而计算得到乳液滴微球对于顺铂的药物包封率。

结果如图3所示。

可以发现，在1～6mg的负载药物使用量范围中，乳液滴微球的药物包封率会随着负载药物使用量的增加而增加，但一旦超过6mg，乳液滴微球的药物包封率反而会随着负载药物使用量的增加而下降，但整体的包封率仍相对于3mg及其以下的负载药物使用量所带来的药物包封率要高。

(2)药物释放效果：

按照上述实施例1中的制备方法制备得到乳液滴微球。取6mg乳液滴微球溶液装载在透析袋中。将透析袋分别浸入装有100mL的PBS溶液的透析盒中，混合液的pH分别7.4和5.5。室温条件下放在摇床上振荡。按时间点在1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h、36h、48h时分别从两组不同pH的组中各取200μL的溶液作为检测样品(取出后立即回填同体积的PBS溶液，使总体积保持不变)。对取出的检测样品立即消解处理，使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定样品液中顺铂的质量，每次结果重复测量3次，计算药物释放率。

结果发现，上述实施例1中的乳液滴微球在pH 5.5弱酸性条件下的24小时药物释放率可以达到78％±5％，而在pH 7.4中性时的6小时药物释放率为38％±5％。对于肿瘤弱酸性的条件下，该载药乳液滴微球更利于药物释放。

(3)细胞毒性：

使用MTT法检测上述实施例1中的制备方法制备得到乳液滴微球的细胞毒性。具体步骤为：将HepG2细胞接种在96孔板中，每孔5000个细胞，置于细胞培养箱中培养约12小时。吸取96孔板中的培养基，换成等体积的分别含有顺铂溶液或乳液滴微球的新鲜培养基。其中，顺铂溶液或乳液滴微球中的顺铂的浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL和31μg/mL，顺铂质量对应为0.4ug、0.8ug、0.16ug、0.32ug和0.64ug，以未加任何药物的细胞作为空白对照组，每个浓度设置5个孔，置于细胞培养箱中避光培育48h。48h后取出培养板，每孔加入110μL的MTT培养基(培养基：MTT＝100:10)，继续培养4h，取出培养板倒扣在干净的纸上，吸干废液，然后在每孔中加入150μL DMSO。将96孔板放在摇床上轻轻震荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解。在酶标仪上测定波长为490nm处各孔吸光度值(OD)。

结果如图4所示。

可以发现，装载了顺铂的乳液滴微球与直接使用顺铂对HepG2细胞的杀伤效果相当，无显著差异性，说明基于乳液滴微球的顺铂给药能够用于替换常规的顺铂给药方式，并展示出同样的治疗效果。

测试例4 乳液滴微球的粘弹性形变效果及栓塞效果

根据本领域常规操作，构建毛细玻璃管模型以用于模拟体内栓塞效果，毛细玻璃管内径为500μm。取1mL上述实施例1中的乳液滴微球，加入至毛细玻璃管内。

结果如图5所示。

在光学显微镜下观察到不同粒径的乳液滴微球在毛细玻璃管中紧密堆积，乳液滴微球在堆积压力下呈椭球型，融合后的乳液滴微球形状变成哑铃型或葫芦形。

可以发现，上述实施例1中的乳液滴微球在没有外界作用力时保持稳定的圆球形形态。而当对其施加不同方向的外力时，受到外力作用后的乳液滴微球可形变为椭球型、哑铃型及葫芦形等形状，且不会破碎。基于此，类比在栓塞血管时，当血管直径大于乳液滴微球直径时，乳液滴微球在血管内保持圆球形形态。当血管直径小于乳液滴微球时，血管会对乳液滴微球施加外力，乳液滴微球由于压力而出现粘弹性形变，在血管中出现椭球型。

而且，发明人还发现，当血管中两个乳液滴微球接触后，在外界外力作用下，两个乳液滴微球的最先接触的点会融合，合并成一个哑铃型的乳液滴微球。而一般情况下，注射入肿瘤血管中的乳液滴微球的粒径并不完全相同，故大小不一的乳液滴微球在外力的作用下，其相互接触的点会先融合，从而使大小不一的两个乳液滴微球形成哑铃型或葫芦形等特殊的形态。同时，由于乳液滴微球之间的不断融合，乳液滴微球的长度会变长，原本栓塞血管的乳液滴微球会向血管更深一级的位置移动，通过这种乳液滴形态不同变化，肿瘤血管最终会被完全彻底栓塞。

测试例5 乳液滴微球对SD大鼠肝脱细胞模型(透明化肝脏离体模型)的栓塞效果

取脱细胞后的SD大鼠肝脏(透明状)，用紫外照射20分钟消毒，使用前去离子水清洗20分钟。

取5mL上述实施例1中的乳液滴微球，注射入透明化肝脏中，用倒置显微镜观察血管中乳液滴微球的粘弹性形变情况。

结果如图6所示。

可以发现，在施以外力时，用于栓塞的乳液滴微球即发生粘弹性形变，呈现如椭球型等形貌。而当乳液滴微球持续堆积融合后，各向异性的乳液滴微球可以进入更深层的下一级血管。同时，这些发生粘弹性形变的乳液滴微球与末端血管壁的接触面积明显大于圆球形乳液滴微球，从而有利于将其负载的药物通过血管释放到周围基质中，而且，还能提高乳液滴微球栓塞时的稳定性，减低血管复通风险。

测试例6 乳液滴微球对新西兰大白兔肝动脉的栓塞效果

本实施例中的动物实验经过南方医科大学动物护理和使用委员会的批准。使用的实验动物为雄性新西兰大白兔，平均体重3kg。每只大白兔通过B超引导下注射1cm³VX2瘤组织块于肝叶中部以制备兔肝VX2瘤模型。所有大白兔饲养2周后经B超观察肝肿瘤生长情况。

实验14天后，在肿瘤大小适合进行TACE处理的条件下，采用TACE的方式将1mL上述实施例1中的乳液滴微球递送至肝肿瘤部位，基于DSA可视动脉介入灌注栓塞术确认完成血管栓塞后结束操作，经观察试验兔无异常后再送回动物房同样条件下饲养。

使用DSA检测血管栓塞情况，结果如图7所示。

可以发现，使用远端微导管能够成功将乳液滴微球递送至肿瘤血管内时，并很快沉积在肿瘤病灶部位，实现了血管栓塞。且血管栓塞完成后，肝部的3个肿瘤染色完全消失，说明该乳液滴微球能够实现肝动脉的有效栓塞。

测试例7 乳液滴微球对新西兰大白兔肾动脉的栓塞效果

本实施例中的动物实验经过南方医科大学动物护理和使用委员会的批准。使用的实验动物为雄性新西兰大白兔，平均体重3kg。所用新西兰兔均在动物房的标准条件下喂养，禁食12h后，再兔子腿部进行肌注速眠新用于麻醉。全麻后，将新西兰兔仰卧位固定在兔架上。消毒解剖兔腹股沟皮肤，用眼钳分离股动脉。在远离股动脉端结扎后，使用18G穿刺针将4F同轴导管引入近端动脉。先向导管中注射碘海醇进行肾(右肾)动脉造影，然后注射1mL上述实施例1中的乳液滴微球。使用CT在注射后第7天、第14天对新西兰兔肾动脉中的乳液滴微球栓塞效果进行评估。栓塞14天时在DSA辅助下注射造影剂，通过肾动脉造影检查栓塞效果，在本实施例中，DSA仅用于指导无菌条件下的介入情况。注射造影剂2周后进行DSA造影复查，同时CT复检新西兰兔心、肝、脾、肺、肾(左肾)、脑等重要器官。对新西兰兔实施安乐死，取出新西兰兔左肾和右肾进行解剖，评估栓塞效果。

结果如图8所示。

可以发现，使用上述实施例1中的乳液滴微球进行肾(右肾)动脉注射后，成功实现了血管栓塞，栓塞后黑色血管阴影完全消失，表明肾动脉已被彻底栓塞。而后在栓塞第14天进行DSA复查时，肾动脉未见血管黑影，说明乳液滴微球较好的驻留在右肾中，且经解剖确认乳液滴微球大多沉积在肾皮质末端，栓塞效果好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳液滴微球栓塞剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将肿瘤化疗药物与显影剂混合，得到油相溶液；

(2)加入含有两亲性Janus颗粒的水性溶液，剪切乳化，得到乳液滴微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述两亲性Janus颗粒包括含有如下物质中的至少一种的Janus颗粒，所述物质包括：聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯、聚异丙基丙烯酰胺-聚丙烯酸、聚乙二醇-聚己内酯-聚甲基丙烯N,N-二甲基氨基乙酯、聚氧化乙烯-聚己内酯-聚氧化乙烯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酸、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酰胺、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚甲基丙烯酰胺、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚丙烯酸羟乙酯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚马来酸酐、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚马来酸、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)-聚衣康酸。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述显影剂包括碘化油、碘苯酯、碘化钠、泛影葡胺、碘海醇、硫酸钡、碘克沙克、碘苯六醇、碘普罗胺、碘必乐、碘曲仑中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Janus浓度为0.1-10000mg/mL。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述剪切乳化时间为1-1000min；所述剪切乳化转速为100-20000rpm。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相溶液和水性溶液的体积比为1～1000：1～1000。

7.权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的乳液滴微球，其特征在于，所述乳液滴微球为水包油型、油包水型、水包油包水型或油包水包油型的乳滴微球；乳液滴微球的粒径为0.01-1000μm。

8.一种试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求6～7任一项所述的乳液滴微球和/或其他药学上可接受的辅料。

9.权利要求6～7任一项所述的乳液滴微球在制备如下(1)～(3)中任一项所述产品中的应用；

(1)血管栓塞产品；

(2)造影剂；

(3)抗肿瘤药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、肾癌、血管瘤、子宫肌瘤、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺恶性肿瘤。

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