CN115340989B - 一种金属蛋白酶及其分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种金属蛋白酶及其分离方法。一种金属蛋白酶，所述金属蛋白酶分子量为48‑50kDa，其N末端氨基酸序列为QADAEKVNLPVGVCV。该蛋白酶从霞水母触手自溶液中分离得到，其肽指纹图谱与尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶H5肽段FLTDKK和蝮蛇毒液金属蛋白酶kistomin的肽段SDELIK匹配。本发明从霞水母触手自溶液中分离出一种新的金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有较高的毒性，该金属蛋白酶的分离纯化为水母毒素蛋白的深入研究和开发水母蜇伤治疗药物奠定基础。

Description

一种金属蛋白酶及其分离方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种金属蛋白酶及其分离方法。
背景技术
近年来，全球范围水母暴发经常发生，造成众多游泳者、海员等涉海人员被蜇伤，轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能够给人们带来如此大的危害，最主要的原因是：水母触手内含有大量的水母毒素。水母毒素具有很强的毒性作用，包括溶血毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性及致死毒性等，研究发现水母毒素是一种有多种毒素蛋白组成的复杂混合物，包括金属蛋白酶、磷脂酶A2、C型凝集素、溶血素、丝氨酸蛋白酶抑制剂等，其中金属蛋白酶是水母毒液中最主要的成分，在水母蜇伤症状甚至致死中起到重要作用。所以水母金属蛋白酶类毒素的分离纯化，为研究水母毒素的作用机制，开发治疗水母蜇伤的药物具有重要意义。
但是，目前为止对水母毒素的研究主要集中在水母毒素粗提取物层面，其主要原因是由于水母毒素中含有大量毒素蛋白和非毒素成分，其中某些组分之间的结构、性质非常相近，分离纯化难度非常大；而不同的毒素蛋白的物理化学性质也存在较大区别，对于不同毒素蛋白的纯化，只能通过实验条件的不断优化摸索才能获得，无法直接照搬其他毒素的纯化条件。所以，水母毒素的分离纯化工作具有很大的挑战性。
发明内容
本发明的目的是提供一种从霞水母触手自溶液中分离的金属蛋白酶及方法，为水母毒素蛋白的深入研究和开发水母蜇伤治疗药物奠定基础。
为实现上述目的，本发明首先提供的技术方案是：一种金属蛋白酶，所述金属蛋白酶的分子量约为48-50kDa，其N末端氨基酸序列为QADAEKVNLPVGVCV。
优选地，所述金属蛋白酶从霞水母触手自溶液中分离得到，其氨基酸序列与尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶H5肽段FLTDKK和蝮蛇毒液金属蛋白酶kistomin的肽段SDELIK匹配。
本发明还提供了从霞水母触手自溶液中分离所述金属蛋白酶的方法，包括：
（1）将霞水母自溶液与预冷的pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液混合，然后低温高速离心，收集上清液待用；
（2）将步骤（1）所得上清液泵入到含Q Sepharose HP的阴离子交换树柱在低温下进行分离，首先采用pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液冲洗，而后采用洗脱液进行线性洗脱，将各洗脱峰进行测定活性，收集活性组分待用；
（3）将步骤（2）获得的活性组分浓缩后上样到含Superdex 200的凝胶过滤色谱柱，在低温下使用洗脱液分离, 将各洗脱峰进行测定活性，收集活性组分待用；
（4）将步骤（3）获得的活性组分上样至Mono S阳离子交换色谱柱在低温下进行分离，采用洗脱液进行线性洗脱，最终获得霞水母金属蛋白酶。
优选地，所述步骤（2）所用的洗脱液为10-20倍柱体积的、浓度为0.25M NaCl溶液与pH7.8、 20mM Tris-HCl的混合液，洗脱体积为200-400mL，流速为1-2 mL/min。
优选地，所述步骤（3）中，洗脱液为pH6.0，20mM MES，洗脱体积为120-160 mL，流速为0.8-1.2 mL/min。
优选地，所述步骤（4）中，洗脱液为0.25M NaCl溶液与pH6.0、20mM MES的混合液，洗脱体积为20-40mL，流速为0.5-1mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1. 本发明从霞水母触手自溶液中分离出一种新的金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有较高的毒性，该金属蛋白酶的分离纯化为水母毒素蛋白的深入研究和开发水母蜇伤治疗药物奠定基础。
2. 本发明组合使用Q Sepharose HP阴离子交换柱、Superdex 200的凝胶过滤色谱柱和Mono S阳离子交换色谱柱，首次从霞水母触手自溶液中纯化金属蛋白酶，具有效率高和分辨率高等优点。
附图说明
图1为本发明分离到的金属蛋白酶的纯度及分子量SDS-PAGE 电泳分析测定结果；
图2为本发明分离到的霞水母金属蛋白酶的N末端序列测定；其中，（a）标准品校准测试图谱；（b）N端第1位；（c）N端第2位；（d）N端第3位；（e）N端第4位；（f）N端第5位；（g）N端第6位；（h）N端第7位；（i）N端第8位；（j）N端第9位；（k）N端第10位；（l）N端第11位；（m）N端第12位；（n）N端第13位；（o）N端第14位；（p）N端第15位。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
将20ml霞水母自溶液与在40ml在2℃预冷的pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液混合，然后在2℃10000rpm高速离心20min，收集上清液。将上述上清液上样到Q Sepharose HP色谱柱在2℃下进行分离，先用100mL pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液冲洗非结合蛋白，再用0.25MNaCl，pH7.8 20mM Tris-HCl洗脱液进行浓度由0到100%线性洗脱，洗脱体积为200mL，流速为1mL/min, 将各洗脱峰进行测定活性并收集活性洗脱组分，使用截留分子量为3K的浓缩管进行浓缩。将浓缩后的样品上样到Superdex 200凝胶过滤色谱柱，在2℃下使用pH6.0，20mM MES洗脱液分离，洗脱体积为120mL，流速为0.8 mL/min，将各洗脱峰进行测定活性，并收集活性组分；将上述获得的活性组分上样至Mono S阳离子交换色谱柱在2℃下进行分离，首先用5mL pH6.0，20mM MES冲洗，然后用0.25M NaCl，pH6.0，20mM MES进行线性0到100%线性洗脱，洗脱体积为20mL，流速为0.5mL/min，对各洗脱峰进行活性，以及SDS-PAGE电泳法分析活性组分的纯度，最终获得霞水母金属蛋白酶；
金属蛋白酶活性测定：5 μL 样品，加20 μL Azocasein (5 mg/mL，溶于50 mmol/LTris-HCl, pH 8.8，含150 mmol/L NaCl, 5 mM CaCl2)，于37℃恒温箱中反应90 min。反应完成后，室温下加40μL 5%三氯乙酸终止反应。室温放置30 min后10000 rpm离心10 min。取30 μL 上清液于96孔板中，再加入30 μL 0.5mol/L NaOH 中和多余酸，用酶标仪在450 nm处的吸光度，其中每个梯度均采用三个平行实验,A450=0.003。
实施例2
将20ml霞水母自溶液与在60ml在4℃预冷的pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液混合，然后在4℃，12000rpm高速离心25min，收集上清液。将上述上清液上样到Q Sepharose HP色谱柱在4℃下进行分离，先用120mL pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液冲洗非结合蛋白，再用0.25MNaCl，pH7.8 20mM Tris-HCl洗脱液进行浓度由0到100%线性洗脱，洗脱体积为300mL，流速为1.5 mL/min, 将各洗脱峰进行测定活性并收集活性洗脱组分，使用截留分子量为3K的浓缩管进行浓缩。将浓缩后的样品上样到Superdex 200凝胶过滤色谱柱，在4℃下使用pH6.0，20mM MES洗脱液分离，洗脱体积为140mL，流速为1 mL/min，将各洗脱峰进行测定活性，并收集活性组分；将上述获得的活性组分上样至Mono S阳离子交换色谱柱在4℃下进行分离，首先用7mL pH6.0，20mM MES冲洗，然后用0.25M NaCl，pH6.0，20mM MES进行线性0到100%线性洗脱，洗脱体积为30mL，流速为0.8mL/min，对各洗脱峰进行活性，以及SDS-PAGE电泳法分析活性组分的纯度，最终获得霞水母金属蛋白酶；
金属蛋白酶活性测定：5 μL 样品，加20 μL Azocasein (5 mg/mL，溶于50 mmol/LTris-HCl, pH 8.8，含150 mmol/L NaCl, 5 mM CaCl2)，于37℃恒温箱中反应90 min。反应完成后，室温下加40μL 5%三氯乙酸终止反应。室温放置30 min后10000 rpm离心10 min。取30 μL 上清液于96孔板中，再加入30 μL 0.5mol/L NaOH 中和多余酸，用酶标仪在450 nm处的吸光度，其中每个梯度均采用三个平行实验,A450=0.003。
实施例3
将20ml霞水母自溶液与在80ml在6℃预冷的pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液混合，然后在6℃，12000rpm高速离心25min，收集上清液。将上述上清液上样到Q Sepharose HP色谱柱在6℃下进行分离，先用150mL pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液冲洗非结合蛋白，再用0.25MNaCl，pH7.8 20mM Tris-HCl洗脱液进行浓度由0到100%线性洗脱，洗脱体积为400mL，流速为2 mL/min, 将各洗脱峰进行测定活性并收集活性洗脱组分，使用截留分子量为3K的浓缩管进行浓缩。将浓缩后的样品上样到Superdex 200凝胶过滤色谱柱，在6℃下使用pH6.0，20mM MES洗脱液分离，洗脱体积为160mL，流速为1.2 mL/min，将各洗脱峰进行测定活性，并收集活性组分；将上述获得的活性组分上样至Mono S阳离子交换色谱柱在6℃下进行分离，首先用10mL pH6.0，20mM MES冲洗，然后用0.25M NaCl，pH6.0，20mM MES进行线性0到100%线性洗脱，洗脱体积为40mL，流速为1mL/min，对各洗脱峰进行活性，最终获得霞水母金属蛋白酶。使用SDS-PAGE电泳法分析实施例3得到的金属蛋白酶活性组分纯度，如图1所示，该金属蛋白酶的分子量约为50kDa。
将目的蛋白电转至PVDF膜，采用Edman降解法，使用全自动蛋白质多肽测线仪（PPSQ-33A）对该金属蛋白酶N末端序列进行测定，结果为：Gln-Ala-Asp-Ala-Glu-Lys-Val-Asn-Leu-Pro-Val-Gly-Val-Cys-Val（QADAEKVNLPVGVCV），如图2（b）-图2（p）所示。将该序列在NCBI进行BLAST分析，没有匹配到已知金属蛋白酶，因此该蛋白为一新颖金属蛋白酶。
金属蛋白酶活性测定：5 μL 样品，加20 μL Azocasein (5 mg/mL，溶于50 mmol/LTris-HCl, pH 8.8，含150 mmol/L NaCl, 5 mM CaCl2)，于37℃恒温箱中反应90 min。反应完成后，室温下加40μL 5%三氯乙酸终止反应。室温放置30 min后10000 rpm离心10 min。取30 μL 上清液于96孔板中，再加入30 μL 0.5mol/L NaOH 中和多余酸，用酶标仪在450 nm处的吸光度，其中每个梯度均采用三个平行实验,A450=0.003。
实施例5 实施例3得到的金属蛋白酶肽指纹图谱鉴定分析
将SDS-PAGE电泳蛋白条带切下放入1.5ml离心管中，向其中加入1ml水，清洗10分钟，将水移除，重复一次。在离心管中加入1ml胶内消化脱色液，清洗10分钟，将脱色液移除，重复一次。胶内消化脱色液的配置：50%乙腈，25mM 碳酸氢铵；加入乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。加10 mM DTT，让胶粒吸收完全，放入56度水浴锅内，孵育1个小时。孵育完毕后，移除多余DTT液体，加入55mM IAM，暗室室温孵育，5分钟；孵育完毕后，移除多余IAM液体，加入25mM 碳酸氢铵，清洗10分钟，并重复清洗一次。移除碳酸氢铵，加入脱色液清洗10分钟，并重复一次。乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。1μg/μL的酶储液以25 mM碳酸氢铵稀释15倍，加入脱水后的胶粒中，让胶粒充分吸收。然后加入25mM碳酸氢铵没过胶粒，放入37度水浴锅，消化过夜。过夜后，加入终浓度0.1%的FA终止消化，取10ul样品上机，使用LC-MS/MS液相色谱和质谱仪检测。将结果使用Mascot进行检索分析。匹配到尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）蛇毒金属蛋白酶H5肽段FLTDKK和蝮蛇（Calloselasma rhodostoma）毒液金属蛋白酶kistomin的肽段SDELIK，见表1。
表1 肽指纹图谱匹配到来源蛇毒液中的金属蛋白酶
蛋白编号 蛋白名称 物种来源 匹配到肽段
1 Q9IAY2 Snake venom metalloproteinase H5 (Fragment) Deinagkistrodon acutus FLTDKK
2 P0CB14 Snake venom metalloproteinase kistomin Calloselasma rhodostoma SDELIK
实施例6 实施例3得到的金属蛋白酶致死性实验
实验组是用微量注射器向长度约为4cm的小草鱼尾部分注射20μL的上述含纯化的金属蛋白酶的pH6.0，20mM MES缓冲液，然后观察鱼的行为及12小时内生存状况，同时用20μL pH6.0，20mM MES缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组每个梯度均用3条鱼平行实验。实验显示，分离纯化到的霞水母金属蛋白酶对草鱼具有显著致死毒性，最小致死浓度（最小致死量）<1μg/g.bw。
实施例8 本发明提供的金属蛋白酶的用途
本发明提供的金属蛋白酶与蛇毒金属蛋白酶kistomin具有一定同源性，蛇毒金属蛋白酶kistomin已被证明可通过特异性结合血小板糖蛋白VI (GP6)和血小板糖蛋白Ibα(GP1BA)抑制血小板聚集。还能切割纤维蛋白原的α-(FGA)和纤维蛋白原的γ链(FGG)，而β链不受影响。此外，它还能抑制胶原蛋白、惊厥素和利斯托西汀诱导的血小板聚集，阻断血小板对固定化胶原的粘附，但对纤维蛋白原的抑制作用较弱。在体内，它发挥了强大的抗血栓作用，具有较好的药物开发潜力。因此，本发明提供的金属蛋白酶可能也具有抑制血小板聚集、抗血栓作用，是一种潜在的抗血栓成药因子。
此外，本发明提供的金属蛋白酶还可以作为一种实验材料，用于研究水母毒素的作用机制，开发治疗水母蜇伤的药物。

Claims (3)

1.一种从霞水母触手自溶液中分离金属蛋白酶的方法，其特征在于，包括：
（1）将霞水母自溶液与预冷的pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液混合，然后低温高速离心，收集上清液待用；
（2）将步骤（1）所得上清液泵入到含Q Sepharose HP的阴离子交换树柱在低温下进行分离，首先采用pH7.8，20mM Tris-HCl缓冲液冲洗，而后采用洗脱液进行线性洗脱，将各洗脱峰进行测定活性，收集活性组分待用；所用的洗脱液为10-20倍柱体积的、浓度为0.25MNaCl溶液与pH7.8、 20mM Tris-HCl的混合液，洗脱体积为200-400mL，流速为1-2 mL/min；
（3）将步骤（2）获得的活性组分浓缩后上样到含Superdex 200的凝胶过滤色谱柱，在低温下使用洗脱液分离, 将各洗脱峰进行测定活性，收集活性组分待用；洗脱液为pH6.0，20mM MES，洗脱体积为120-160 mL，流速为0.8-1.2 mL/min；
（4）将步骤（3）获得的活性组分上样至Mono S阳离子交换色谱柱在低温下进行分离，采用洗脱液进行线性洗脱，最终获得霞水母金属蛋白酶；洗脱液为0.25M NaCl溶液与pH6.0、20mM MES的混合液，洗脱体积为20-40mL，流速为0.5-1mL/min。
2.一种金属蛋白酶，其特征在于：采用如权利要求1所述的方法分离获得；所述金属蛋白酶分子量约为48-50kDa，其N末端氨基酸序列为QADAEKVNLPVGVCV。
3.根据权利要求2所述的金属蛋白酶，其特征在于：其肽指纹图谱与尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶H5肽段FLTDKK和蝮蛇毒液金属蛋白酶kistomin的肽段SDELIK匹配。
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