CN102002094A - 一种保护霞水母毒素生物活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种保护霞水母毒素生物活性的方法。在霞水母毒素内添加金属酶抑制剂或酸性蛋白酶抑制剂，进而有效保护霞水母毒素生物活性。本发明利用丰富的霞水母资源，获取具有较高生物活性的霞水母毒素蛋白，并能够快速有效地抑制毒素中蛋白酶的活性，从而使生物活性蛋白得到保护，为霞水母活性物质的分离纯化、结构鉴定、机理研究以及开发利用提供有力的保障。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体是一种保护霞水母毒素生物活性的方法。
背景技术
霞水母属刺胞动物门，钵水母纲，旗口水母目，霞水母科，触须4m-6m，广泛分布于我国沿海，尤其夏季会在近海区域集中出现，给渔业生产、生态环境以及游泳者都造成了严重的影响，霞水母触手上刺丝囊细胞的毒素能引起被蜇伤者皮疹、瘙痒、水肿、肌肉疼痛、血压降低、呼吸困难甚至死亡。霞水母毒素是一类结构新颖的海洋生物蛋白，具有多种生物活性，如溶血活性、抗氧化活性、心脏血管毒性、肝脏毒性、酶活性和神经毒性等，为开发新型的海洋药物提供重要的先导化合物，而如何有效地得到高生物活性的水母毒素是研究其毒素结构、理化性质、生物活性以及对水母毒素进行开发应用的前提。
以霞水母毒素的溶血活性为活性指标，溶血活性作为一个非常重要的生物活性。它是指能够导致红细胞破裂并伴随着释放出血红蛋白的现象，而具有溶血活性的物质统称为溶血素。溶血素主要存在于蜂毒、蛇毒、蜈蚣毒素、水母毒素等动物分泌的毒素中，同时也存在在于一些细菌产物中如Escherichia coli的α-hemolysin、Bacillus cereus的hemolysin BL(HBL)和Bordetella pertussis的FHAhemolysin等。溶血素主要是一些蛋白类物质，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugi.nosa)的磷脂酶C和美人鱼发光杆菌(Photobacteri.Um damselae)的磷脂酶D，这些磷脂酶通过酶解细胞膜表面的磷脂分子层而造成细胞破裂出现溶血现象；另外还有由一些细菌产生的，能够通过在红细胞膜上形成小孔而产生溶血作用的溶血素。因此以溶血活性为活性指示，研究有对霞水母毒素生物活性的保护作用具有重要意义。
在提取霞水母毒素的过程中，很多细胞内的蛋白酶也被释放出来，而蛋白酶的催化作用具有极高的效率，能够迅速的造成活性蛋白的降解而使其活性降低甚至丧失。目前保护霞水母毒素生物活性的方法主要集中在向毒素中添加甘油、蔗糖、谷胱甘肽等物质来稳定毒素蛋白，虽然能起到一定的作用，但并不能从根本上解决活性蛋白被蛋白酶迅速降解导致的活性降低这一根本问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种保护霞水母毒素生物活性的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种保护霞水母毒素生物活性的方法：在霞水母毒素内添加金属酶抑制剂或酸性蛋白酶抑制剂，进而有效保护霞水母毒素生物活性。
所述在0.5-5mg/ml的霞水母毒素内添加终浓度0.1-20mM的金属酶抑制剂EDTA和终浓度2-6μg/mL的酸性蛋白酶抑制剂Pepstantin A，进而抑制毒素中蛋白酶的溶血活性。
所述霞水母毒素按如下步骤进行提取：
1)将冷冻于-80--20℃下的霞水母触角于0-8℃自溶2-96h，而后以0-8℃下5000-30000g离心5-30min，收集沉淀霞水母刺丝囊细胞，待用；
2)将上述每5-50mg的霞水母刺丝囊细胞内加入0.5-2mL在0-8℃预冷的10-30mM pH6.0-8.0缓冲液，然后在振动频率2500-5000rpm下破碎1-5min，其中每破碎10-30s将霞水母刺丝囊细胞取出置于冰水中冷却1-5min；
3)将破碎后霞水母刺丝囊细胞在0-8℃下，5000-30000g离心5-30min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素。
所述步骤1)中自溶后用20-60目的标准分样筛滤去除触手残片。
所述步骤2)中霞水母刺丝囊破碎时利用Mini-Beadbeater组织研磨器破碎；所述缓冲液为0-8℃预冷的10-30mM pH6.0-7.0的PBS缓冲液或0-8℃预冷的10-30mM pH7.0-8.0的Tris-HCl缓冲液。
本发明所具有的优点：
1、资源非常丰富。本发明利用了霞水母这种丰富的海洋生物资源，为霞水母这种低值资源获得高值化发展提供了新的途径。
2、提取速度快。本发明能够快速的从霞水母体内获取大量的毒素，为其进一步应用提供了必要条件。
3、操作简单方便。本发明仅是通过向提取的毒素内加入蛋白酶抑制剂，即可使其生物活性得到很好的保持，操作简单方便。
4、提取的霞水母毒素生物活性高。本发明能够快速有效地抑制毒素中蛋白酶活性，使具有生物活性的蛋白得到有效保护，从而获取具有高生物活性的霞水母毒素蛋白。为霞水母活性物质的分离纯化、结构鉴定、机理研究以及开发利用提供有力的保障。
附图说明
图1为本发明实施例利用组织研磨器Mini-Beadbeater破碎霞水母刺丝囊细胞不同时间的破碎效果图。
具体实施方式
实施例1
霞水母刺丝囊的制备
将1kg冰冻的霞水母触手于4℃下自溶过夜后，用20-60目的标准分样筛滤去除霞水母触手残片，收集上清液倒掉。然后10000g，4℃下冷冻高速离心15min并收集下层沉淀，用生理盐水(0.154mol·L-1NaCl溶液)于4℃反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20℃下冷冻保存备用。
称取冷冻干燥的刺丝囊细胞5mg，加入1.0mL预冷到0℃的10mMpH6.0PBS缓冲液于破碎管中，用组织研磨器Mini-Beadbeater在功率2500rpm下破碎3min，期间每破碎10s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min。破碎完毕，取5μL破碎液于显微镜下观察破碎情况。然后于4℃，5000g冷冻离心5min，收集上层液，即为霞水母毒素。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定上清液中的霞水母毒素的蛋白浓度。
实施例2：
与实施例1不同之处在于：
称取冷冻干燥的刺丝囊细胞10mg，加入1.2mL预冷到8℃的20mMpH7.0PBS缓冲液于破碎管中，用组织研磨器Mini-Beadbeater在功率4200rpm下破碎3min，期间每破碎20s，将破碎管取出置于冰水中冷却2min。破碎完毕，取5μL破碎液于显微镜下观察破碎情况。然后于4℃，10000g冷冻离心15min，收集上层液，即为霞水母毒素。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定上清液中的霞水母毒素的蛋白浓度。
实施例3：
称取冷冻干燥的刺丝囊细胞15mg，加入1.3mL预冷到3℃20mMpH7.5Tris-HCl缓冲液于破碎管中，用组织研磨器Mini-Beadbeater在功率4600rpm下破碎3min，期间每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却3min。破碎完毕，取5μL破碎液于显微镜下观察破碎情况。然后于4℃，20000g冷冻离心20min，收集上层液，即为霞水母毒素。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定上清液中的霞水母毒素的蛋白浓度。
实施例4：
称取冷冻干燥的刺丝囊细胞20mg，加入1.4mL预冷到5℃的20mMpH8.0Tris-HCl缓冲液于破碎管中，用组织研磨器Mini-Beadbeater在功率4800rpm下破碎5min，期间每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却4min。破碎完毕，取5μL破碎液于显微镜下观察破碎情况。然后于4℃，25000g冷冻离心25min，收集上层液，即为霞水母毒素。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定上清液中的霞水母毒素的蛋白浓度。
实施例5：
称取冷冻干燥的刺丝囊细胞50mg，加入1.5mL预冷到7℃的20mMpH8.0Tris-HCl缓冲液于破碎管中，用组织研磨器Mini-Beadbeater在功率5000rpm下破碎5min，期间每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却5min。破碎完毕，取5μL破碎液于显微镜下观察破碎情况。然后于4℃，30000g冷冻离心30min，收集上层液，即为霞水母毒素。以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定上清液中的霞水母毒素的蛋白浓度。
以上利用组织研磨器Mini-Beadbeater破碎霞水母刺丝囊细胞
通过以上实施例结果显示，利用组织研磨器Mini-Beadbeater下破碎霞水母刺丝囊细胞时，随着破碎时间的增长毒素蛋白的浓度不断增加，但是当破碎时间到120-180s时，毒素蛋白的浓度却只有很小幅度的增长，说明此时绝大多数刺丝囊细胞被破碎；同时利用显微镜下观察到破碎情况与上述数据一致，通过下图所示，当破碎时间到达120s时，大约90％左右的刺丝囊细胞已被破碎，尤其是当破碎时间到达180s时，刺丝囊细胞已基本破碎完全。
实施例6：霞水母毒素生物活性的保护
金属蛋白酶抑制剂EDTA对霞水母毒素溶血活性的保护
将取自于健康鸡的新鲜血液用等渗液(0.145M NaCl 20mM pH 7.4PBS)稀释10倍后，1000g离心15min，弃上清，然后重复三次，收集底部红细胞并用等渗液稀释至体积百分比为0.05％红细胞悬浮液待用。
取100μL的霞水母毒素加入到0.5ml体积百分比为0.05％鸡血红细胞悬浮液中，然后添加终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、5、7、10、15、20mM的金属蛋白酶抑制剂EDTA，然后用等渗液至终体积为5ml，37℃下反应30min，反应结束后1000g离心15min，取上清液于415nm处测定吸光度，以未加毒素但添加上述相同终浓度的EDTA组为溶血的空白对照，以直接用水稀释0.5ml体积百分比为0.05％鸡血红细胞悬浮液至5ml为阳性对照，稀释后使鸡血红细胞100％溶血。实验结果如下表所示：
实验结果显示，EDTA对霞水母毒素溶血活性具有较强的保护作用，尤其是在其浓度为0.1-5mM时其保护作用尤为明显，当EDTA浓度为1mM时能够使其溶血活性从40.0％提高至93.4％左右。
实施例7：酸性蛋白酶抑制剂Pepstantin A对霞水母毒素溶血活性的保护
将取自于健康鸡的新鲜血液用等渗液(0.145M NaCl 20mM pH 7.4PBS)稀释10倍后，1000g离心15min，弃上清，然后重复三次，收集底部红细胞并用等渗液稀释至体积百分比为0.05％红细胞悬浮液待用。
取100μL的霞水母毒素加入到0.5ml体积百分比为0.05％鸡血红细胞悬浮液中，然后添加终浓度分别为：1、2、4、6、8、10μg/mL的酸性蛋白酶抑制剂Pepstantin A，并用等渗液至终体积5ml，37℃下反应30min，反应结束后1000g离心15min，取上清液于415nm处测定吸光度，以未加毒素但添加上述相同终浓度的Pepstantin A组为溶血的空白对照，以直接用水稀释0.5ml体积百分比为0.05％鸡血红细胞悬浮液至5ml为溶血阳性对照。具体实验结果如下表所示：
通过实验结果显示，酸性蛋白酶抑制剂Pepstantin A在浓度为2-6μg/mL时对霞水母毒素溶血活性也起到了较强的保护作用，尤其是当浓度为4μg/mL时，霞水母毒素溶血活性平均从5.3％上升到76.0％左右。
Claims (5)
1.一种保护霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于：在霞水母毒素内添加金属酶抑制剂或酸性蛋白酶抑制剂，进而有效保护霞水母毒素生物活性。
2.按权利要求1所述的保护霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于：所述在0.5-5mg/ml的霞水母毒素内添加终浓度0.1-20mM的金属酶抑制剂EDTA或终浓度2-6μg/mL的酸性蛋白酶抑制剂Pepstantin A，进而抑制毒素中蛋白酶的溶血活性。
3.按权利要求1或2所述的保护霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于：所述霞水母毒素按如下步骤进行提取：
1)将冷冻于-80--20℃下的霞水母触角于0-8℃自溶2-96h，而后以0-8℃下5000-30000g离心5-30min，收集沉淀霞水母刺丝囊细胞，待用；
2)将上述每5-50mg的霞水母刺丝囊细胞内加入0.5-2mL在0-8℃预冷的10-30mM pH6.0-8.0缓冲液，然后在振动频率2500-5000rpm下破碎1-5min，其中每破碎10-30s将霞水母刺丝囊细胞取出置于冰水中冷却1-5min；
3)将破碎后霞水母刺丝囊细胞在0-8℃下，5000-30000g离心5-30min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素。
4.按权利要求3所述保护霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于：所述步骤1)中自溶后用20-60目的标准分样筛滤去除触手残片。
5.按权利要求3所述保护霞水母毒素生物活性的方法，其特征在于：所述步骤2)中霞水母刺丝囊破碎时利用Mini-Beadbeater组织研磨器破碎；所述缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
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