CN101230375A - 一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的糖蛋白及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明发明了一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的糖蛋白及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。它提供了一种新型的天然海洋生物活性糖蛋白，该糖蛋白中含75％的蛋白质，25％的糖，平均分子量为56,000。其所含单糖以葡萄糖为主，所含氨基酸中甘氨酸占20％以上，羟脯氨酸占5％以上。按照本发明进行操作，能够获得2％的纯度达到90％以上的糖蛋白。这种新型糖蛋白完全没有毒副作用，具有显著的抗疲劳活性。
Description
技术领域
本专利涉及一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的糖蛋白及其制备工艺，属天然生物活性物质及其制备技术领域。
背景技术
霞水母(Cyanea nozakii)，俗称麻蜇，是一种大型海洋浮游生物，属刺胞动物门(Phylum Cnidaria)，钵水母纲(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我国沿海已发现的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferrugineaEschscholtz)，和紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)4个种，其中以白色霞水母数量最多、分布范围最广。霞水母通常以小型浮游动物为饵，其生殖腺发达，繁殖能力强，生长速度极快，目前我国霞水母的年产量已经高达千万吨，构成了一种新的天然海洋生物资源。
海洋来源的多糖、蛋白聚糖和糖蛋白是十分重要的天然海洋食品资源，常常具有显著的生物活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的生物活性。以霞水母为原料，从中分离提取制备糖蛋白的研究国内外尚未见任何报道。
发明内容
本专利发明了一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的糖蛋白及其制备工艺。较为独特的是，它以一种新型的天然海洋生物资源-霞水母(Cyanea nozakii)-作为糖蛋白的制备原料进行加工，实现了对霞水母进行开发利用的目的。按照本专利进行操作，能够以极高的产率获得高纯度糖蛋白产品。这对于霞水母这一天然海洋生物资源的综合利用而言是至关重要的。
本专利发明的霞水母活性糖蛋白经初步的研究确认，基本无毒，具有显著的抗疲劳活性，将作为新型的生物活性材料和保健食品原料被广泛应用于食品工业和医药工业。
具体来说，首先，我们发现新鲜的或经过三矾腌制处理的市售麻蜇可以在经过脱盐处理之后用作糖蛋白的制备原料。其中所含的糖蛋白对水浸泡处理是稳定的，在我们所采取的浸泡工艺条件下，既不会因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不会因受过浸泡而影响其在后续的水解处理中的分散性，即经过三矾腌制处理的市售麻蜇与刚捕捞上岸的新鲜的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制备高纯度高生物活性糖蛋白的原料。由此奠定了以霞水母为原料加工制备高纯度高生物活性糖蛋白的基础。
其次，在对pH、温度、压力等溶融和酶解条件以及氢氧化钠、盐酸、胶原蛋白酶等各种常用的溶融剂进行了系统的考察和对比后，我们发现，在适当的溶融条件下，霞水母中所含有的糖蛋白以及胶原蛋白不经过变性处理，便可直接被溶融，分散到水中，得到澄清透明，所含杂质很少的高纯度分散液。这种分散液经过酶解处理可有效的使其中所含的糖蛋白与胶原蛋白相分离。
我们发现，在浸泡pH、浸泡压力、浸泡时间、溶融(酶解)剂等水解工艺参数中，溶融(酶解)剂的种类和溶融(酶解)时所采用的温度对于得率而言是最为重要的。其中，有效的溶融剂为常见的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)。当选用盐酸为溶融剂时，pH值应当在0.5-6.8范围之内；有效的酶解剂为各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。酶解时，pH值应当在所选酶的最适pH范围之内。当选用盐酸为溶融剂时，溶融温度应当在-30-200℃范围内，最好是在0-60℃的范围内，当选用胰蛋白酶为酶解剂时，应当在胰蛋白酶的最适温度下进行溶融。其他各项参数，浸泡脱盐需进行6-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。液体的干燥方式，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
取1000g三矾腌制处理的市售麻蜇，沥水后，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm为止(氯离子检测呈阴性)。浸泡后的脱盐霞水母用醋酸将其pH调节至3.5-5.5，在30-60℃下保温融溶20-48小时，得到一澄清透明的粘性液体。然后将粘性液体的pH调节至胰蛋白酶的最适pH，在该酶的最适温度下保温处理8-16小时，然后离心，弃去不溶性残渣，得到上清液，即为糖蛋白液；糖蛋白液经浓缩后喷雾干燥，得到20g纯度达到90％以上的具有显著的抗疲劳活性的糖蛋白粉固体。
实例二
取1000g新鲜霞水母，室温下浸没于2-5倍量的去离子水中浸泡，并每2-3小时换一次水，直至浸泡水中氯化钠的含量低于1.5ppm为止(氯离子检测呈阴性)。浸泡后的脱盐霞水母用醋酸将其pH调节至3.5-5.5，在30-60℃下保温融溶20-48小时，得到一澄清透明的粘性液体。然后将粘性液体的pH调节至胰蛋白酶的最适pH，在该酶的最适温度下保温处理8-16小时，然后离心，弃去不溶性残渣，得到上清液，即为糖蛋白液；糖蛋白液经浓缩后喷雾干燥，得到10g纯度达到90％以上的具有显著的抗疲劳活性的糖蛋白粉固体。
实例三
对一份糖蛋白粉样品进行了蛋白含量的测定，总糖含量的测定，氨基酸组成的测定以及单糖组成的测定。测定结果表明，该样品中含75％的蛋白质，25％的糖，平均分子量为56,000。所含单糖以葡萄糖为主，所含氨基酸的组成见表1。
表1供试样品的氨基酸组成
| 氨基酸 | 含量(mg/g) | ％ |
| 天冬氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸精氨酸丙氨酸酪氨酸胱氨酸缬氨酸蛋氨酸苯丙氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸脯氨酸色氨酸羟脯氨酸总氨基酸 | 4.14186.767732.303970.230829.603421.816074.02953.49030.547790.430211.780330.588820.824561.242361.867062.193381.97024-2.3417146.17007 | 8.9714.664.990.5020.803.938.737.561.190.933.861.281.792.694.044.754.270.005.07 |
实例四
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的糖蛋白粉进行急性毒性试验，所得结果如下：
表2供试样品对小鼠体重的影响
| 天数/组别 | 空白对照组体重(g) | 试验组体重(g) |
| 1d2d3d4d5d6d7d | 22.80622.98524.30024.68825.14626.08426.180 | 23.82523.36523.79523.88924.61025.05325.404 |
表3急性毒性实验结果
| 组别 | 小鼠数量 | 给药剂量 | 一周体重增长 | 增长率 | 死亡数 |
| 空白对照组试验组 | 1010 | 0.5mL/只7500mg/kg | 3.374g1.579g | 14.79％6.63％ | 00 |
通过观察，给药后1h内小鼠活动均减少，4h后逐渐恢复正常活动。试验组2d内进食量有所减少，以后的5d内小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脱颈处死，肉眼尸检未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器病变和中毒现象。观察期7d内每天称重，试验组小鼠的体重在给药后2d内下降，说明这2d小鼠的进食量减少，以后的5d内，体重逐渐恢复并不断增加。研究结果表明，在供试样品大剂量灌胃的情况下，未出现小鼠死亡，也未有明显毒性反应。说明其无毒性或毒性很小，其最大安全剂量在7500mg/Kg以上。
实例五
以健康昆明种小白鼠(雌雄各半，4周龄，体重18-22g，由无锡市惠山江南实验动物场提供【批准号：SCXK(苏)2002-0006】)为实验动物，对所得到的糖蛋白粉进行抗疲劳保健功能测试，所得结果如下：
1负重游泳实验
表4供试样品对小鼠负重游泳时间的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg) | 持续游泳时间(min) |
| 空白对照组试验组 | -50100200 | 15.25±0.6418.99±1.12**21.37±1.04**22.69±1.22** |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较**P＜0.01
由表4可知，试验组小鼠的负重(5％)游泳时间均比对照组的延长，且低剂量组、中剂量组、高剂量组与对照组比较，游泳时间的差异具有高度显著性(P＜0.01)，表明供试样品能延长小鼠的负重游泳时间，增强其耐力。并且低剂量组与中剂量组、高剂量组之间差异显著(P＜0.05)，中剂量组与高剂量组之间差异不显著((P＞0.05)。
2血清尿素氮测定
表5供试样品对小鼠尿素氮的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg ) | 尿素氮含量(mmol/L) |
| 空白对照组试验组 | -50100200 | 14.503±0.7713.017±0.81*12.783±0.45*11.713±0.91** |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01
由表5可知，试验组的小鼠血清尿素氮含量均低于对照组，且与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，表明供试样品能减少或抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生。各剂量组之间差异不显著(P＞0.05)。
3肝糖元含量测定
表6供试样品对小鼠肝糖原含量的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/kg) | 肝糖元(g) |
| 空白对照组试验组 | -50100200 | 0.326±0.110.573±0.110.778±0.18**1.858±0.16** |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较**P＜0.01
由表6可知，试验组小鼠肝糖原含量均高于对照组，且中剂量组、高剂量组与对照组比较，差异有高度显著性(P＜0.01)，表明供试样品具有促进肝糖原储备的作用。
4血乳酸测定
表7供试样品对小鼠血乳酸的影响
| 组别 | 游泳前(mmol/L) | 游泳10min后(mmol/L) | 游泳10min后20min(mmol/L) | 血乳酸曲线下面积(mmol/L) |
| 空白对照组试验组(50mg/kg)(100mg/kg)(200mg/kg) | 3.56±0.393.33±0.392.90±0.20*2.82±0.23* | 9.87±0.128.64±0.51*8.50±0.52*8.10±0.88** | 4.63±0.323.45±0.40**3.32±0.42**3.18±0.39** | 212.11±3.27180.79±6.42**175.20±7.07**167.41±10.42** |
方差分析，P＜0.05；与对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05
由表7可知，试验组中低剂量组安静时的血乳酸值与对照组无显著差异(P＞0.05)，中剂量组和高剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。而各剂量组游泳10min后及游泳10min后休息20min这2个时间点的血乳酸值均明显低于对照组，差异均有显著性(P＜0.05)，但各剂量组之间差异无显著性(P＞0.05)。各剂量组的乳酸曲线下面积与对照组相比，差异具有高度显著性(P＜0.01)。表明供试样品能降低小鼠运动后血乳酸含量。
抗疲劳实验结果表明供试样品能延长小鼠的负重游泳时间，减少或抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生，降低小鼠运动后血乳酸含量，促进肝糖原储备的作用。
根据功能学评价检验方法，实验小鼠负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖元三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳功能的作用。本实验在实验小鼠负重游泳实验结果阳性基础上，其余三项生化指标均阳性，因此可判定供试样品具有缓解体力疲劳功能的作用。
Claims (9)
1.一种霞水母来源的具有抗疲劳活性的糖蛋白。
2.如权利要求1所述的糖蛋白的制备工艺。该工艺由下列步骤组成：
(1)以水为溶剂对霞水母进行浸泡，脱除原料霞水母中所含有的盐分。
(2)对脱除了盐分的霞水母进行溶融处理，使霞水母消融，得到一无色或淡黄色的粘稠液体。
(3)对所得到的粘稠液体，进行酶解处理，得到一有沉淀形成的悬浮液。
(4)对悬浮液进行(或不进行)离心、分级、脱色、脱盐等物理处理，得到一无色或淡黄色的溶液。
(5)对溶液进行干燥，得到一白色-浅黄色的粉末，即为糖蛋白。
所宣称的霞水母，俗称麻蜇，系指霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、发形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)的新鲜捕捞品或其经过三矾腌制的腌制品。
所宣称的溶融处理，系指在一定的pH、温度、压力下，用特定的溶融剂进行的将霞水母融化在水中，形成粘稠液体的加工过程。
所宣称的酶解处理，系指在一定的pH、温度、压力下，用特定的酶对霞水母融化在水中形成的粘稠液体进行降解的加工过程。
所宣称的物理处理，系指在一定的温度、压力下，对悬浮液体进行的运用离心、分级、脱色、脱盐等加工过程。
所宣称的干燥为使经过溶液脱除水分，得到固体的加工过程。
所宣称的糖蛋白为自霞水母中分离提取得到的一种产物。它是一种白色或淡黄色粉末，无嗅，略带苦味，其中含有70～90％的蛋白质，10～30％的糖，平均分子量在1,000～100,000之间。该糖蛋白无毒，具有显著的抗疲劳生物活性。
3.权利要求2中宣称的水系指pH调节为某一定值的自来水或去离子水，其pH值在2-12范围之内。
4.权利要求2中宣称的浸泡，进行6-15次，每次浸泡所需的用水量为所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡温度在-50-98℃范围内，浸泡时间为0.5-12hr次-1。
5.权利要求2中宣称的溶融处理，在pH＝0.5-6.8的条件下进行，其操作压力为0.0001-0.5MPa，操作温度为-30-200℃
6.权利要求2中宣称的酶解处理，在pH＝5.5-7.5的条件下进行，其操作压力为0.0001-0.5MPa，操作温度为-30-200℃。
7.权利要求2中宣称的溶融处理，可供选用的溶融剂为0.1～10molL-1的酸(如盐酸、磷酸、硫酸等无机酸或甲酸、醋酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸等有机酸)。
8.权利要求2中宣称的酶解处理，可供选用的酶为各种蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶等)中的一种或若干种。
9.权利要求2中宣称的干燥，可以是冷冻干燥，也可以是喷雾干燥。
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