CN103613653A - 一种水母心血管毒素粗提物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，本发明的目的在于提供一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，该方法是以鲜活水母触手（非口腕或整个口腕部组织）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。

Description

一种水母心血管毒素粗提物的制备方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种水母心血管毒素粗提物的制备方法。 
背景技术
水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤，水母毒素是导致蜇伤后系列症状的主要原因。水母毒素具有心血管、溶血、神经、肝脏、皮肤与肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是一类具有较高研究价值的海洋肽类毒素。 
心血管毒素造成的循环功能损伤是水母蜇伤致死的主要原因，但心血管毒素组分在水母毒素中丰度较低。以往的水母毒素粗提物制备方法存在耗时长、易引入非毒素成分、制备量小等不足，尤其是不能避免其他高丰度蛋白和毒素（如组织蛋白、溶血毒素）的干扰，长期以来水母毒素心血管毒性成分的纯化、鉴定及机制研究进展缓慢。 
水母毒素粗提物制备主要有两种方法：一种是以水母口腕部组织（触手、口腕的混合物）为原料，利用水母组织易自溶的特点，低温（4℃）下搅拌自溶3-4天，离心收集上清经透析即为毒素粗提物（Xiao L,He Q,Guo Y,et al.,Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:Its cardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures[J].Toxicon.2009,53(1):146–152）；另一种是切取水母触手、口腕或整个口腕部组织，低温自溶3-4天后，离心收集沉淀，洗涤沉淀并收集其中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析为毒素粗提物样品（Marino A,Crupi R,Rizzo G,Morabito R,Musci G,La Spada G.2007.The unusual toxicity and stability properties of crude venom from isolated nematocysts of Pelagia noctiluca(Cnidaria,Scyphozoa).Cell Mol Biol(Noisy-le-grand).53Suppl:OL994-1002.）。 
综上所述，这两种方法均需经过组织自溶，耗时较长。前者操作相对简易，但必然引入大量非毒素类组织蛋白；后者所制毒素粗提物较前者纯净，但操作环节较多，期间刺丝囊发射率高、损耗大，所获毒素蛋白量很小。总 的来说，这两种制备水母毒素粗提物的方法均存在局限性，难以满足后续毒素组分离纯化的需要。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、耗时较短、杂质较少、更利于进一步纯化的水母心血管毒素粗提物的制备方法。 
本发明的主要技术方案是：以鲜活水母触手（非口腕或整个口腕部组织）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。 
本发明提供了一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，包括以下步骤： 
A、以鲜活水母触手为原料，加入PBS（Phosphate Buffer Solution，磷酸盐缓冲液）清洗； 
B、振荡：加入与步骤A的触手等体积的PBS，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm，最优为3200rpm，振荡1-5min，最优为2min； 
C、过滤：步骤B得到的内容物以100-500目，最优为300目筛网过滤，收集滤液； 
D、透析：步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4℃下用预冷的PBS透析6-24h，最优为8h后，4℃下3000-10000×g离心10-30min，最优为10000×g离心10min，收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。 
所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；分离不含口腕组织的触手，剪取触手组织，分装到离心管中。 
上述步骤中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution）。 
上述步骤中，预冷的PBS缓冲液中的预冷为常规技术，最优的为：使用的PBS缓冲液需经过孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。 
所述的步骤A中，加入与触手组织等体积的PBS，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。 
本发明的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。 
附图说明
图1是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物SDS-PAGE电泳图； 
图2是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物溶血活性比较。 
图3是本发明的方法与自溶法所制水母毒素粗提物心血管活性比较。 
具体实施方式
现结合附图和实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1 
本发明的方法（简称快速法）制备水母心血管毒素粗提物 
PBS配制：称取8g NaCl、0.2g KCl、3.63g Na2HPO4·6H2O和0.24gKH2PO4，溶于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，最后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。 
1.水母采集：发形霞水母（Cyanea capillata）采自浙江省舟山市嵊泗县。挑选活力较好且触手发达的水母个体，以手抄网捕捞。首先将捕获的水母放入盛有海水的水箱中静置10min，待其恢复自然活动状态。 
2.触手分离：剔除触手处杂质，仔细区分触手和口腕等不同组织，准确剪取触手，置于50ml离心管中，每管新鲜触手组织约20ml。 
3.清洗：加入20mlPBS，轻柔摆动离心管清洗触手组织，将上层清洗液轻轻倾尽。 
4.振荡：加入20ml PBS，于涡旋振荡器上以转速3200rpm连续振荡2min。5.过滤：管中内容物以300目筛网过滤2次，收集滤液。 
6.透析：将滤液置于1000Da透析袋中，4℃下用预冷PBS中透析8h后，4℃下10000×g离心10min，收集上清液，即为快速法所制水母心血管毒素粗提物。 
实施例2 
现有技术的自溶法制备水母毒素粗提物 
发形霞水母采自浙江省舟山市嵊泗县。取口腕部组织（触手、口腕的混 合物）100g，加入等体积预冷的3.34％人工海水100mL，自溶4天，磁力搅拌器每日搅拌2次，每次10min；100目细胞筛网过滤3次，滤液10000×g离心3次，每次10min，收集上清液；将上清液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，4℃下用预冷PBS中透析8h后，4℃下10000×g离心10min，上清液即水母毒素粗提物（TE,tentacle extract）。（人工海水配制：称取NaCl28g，MgCl2·6H2O5g，KCl0.8g，CaCl21.033g，加蒸馏水至1L，混匀后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。） 
实施例3 
自溶法与快速法所制水母毒素粗提物比较 
1、蛋白质纯度比较 
将快制法和自溶法所制毒素粗提物及蛋白分子量标准参照物（Marker）进行SDS-PAGE电泳，分别采用5％积层胶和12％分离胶，单孔上样20μl（蛋白总量20μg），积层胶和分离胶电压分别采用80v和160v，电泳结束后用银染法进行染色。 
结果如图1所示，与自溶法相比，快速法所制水母心血管毒素粗提物中大分子量组织蛋白（非毒素类蛋白）含量明显减少，提示本发明方法能有效降低非毒素类杂质蛋白的引入，利于后续的毒素分离纯化。 
2、溶血活性比较 
麻醉雄性SD大鼠（购自第二军医大学实验动物中心）尾静脉取血，等体积50U肝素生理盐水抗凝，PBS漂洗数次，每次漂洗后1000×g离心5min弃上清，至上清清亮。红细胞与PBS按体积比1:200（0.5％）稀释成红细胞悬液。0.5ml离心管中先加入红细胞悬液0.1ml，然后分别加入0.1ml快制法和自溶法所制水母毒素粗提物（0.2mg/ml），反应总体积达到0.2ml，另设等体积阴性对照组（PBS）和阳性对照组（SDS，十二烷基磺酸钠）。37℃水浴30min，1000×g离心5min后，各吸取0.15ml上清液于96孔板中，用酶标仪检测A415，溶血分数=[(样品管A415)－(阴性对照A415)]/[(阳性对照A415)－(阴性对照A415)]×100%。 
结果如图3所示，快速法所制水母心血管毒素粗提物不具有溶血活性，而自溶法所制粗提物具有一定的溶血活性。 
3、心血管活性比较 
麻醉Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自第二军医大学实验动物中心）大鼠股动脉插管，连接MPA-2000生理记录仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）监测大鼠血压，颈外静脉插管给予毒素（0.2mg/ml，5ml/kg，1mg/kg），观察大鼠血压变化，检测两法所制水母粗提物的心血管毒性。 
结果见图2，同等剂量下，快速法与自溶法所制水母毒素粗提物均可使大鼠静脉压明显下降，且快速法毒素在10min内迅速致大鼠死亡。 
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。 

Claims (7)

1.一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、以鲜活水母不含口腕组织的触手为原料，加入PBS缓冲液清洗；
B、振荡：加入与步骤A的触手组织等体积的PBS缓冲液，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm，振荡1-5min；
C、过滤：步骤B得到的内容物以100-500目筛网过滤，收集滤液；
D、透析：步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4℃下，用预冷的PBS缓冲液透析6-24h后，4℃下3000-10000×g离心10-30min，收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。
2.根据权利要求1所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；
分离不含口腕的触手组织，剪取触手组织，分装到离心管中。
3.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，加入与触手组织等体积的PBS缓冲液，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。
4.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤B中在涡旋振荡器上以转速为3200rpm，振荡2min。
5.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤C中以300目筛网过滤，收集滤液。
6.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，步骤D中用预冷的PBS缓冲液透析8h后，4℃下10000×g离心10min。
7.根据权利要求1或2所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的预冷的PBS缓冲液是指PBS缓冲液需经过孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤，于4℃预冷。
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