CN101181305A - 一种水母毒素提取物及其制备方法与用途 - Google Patents

一种水母毒素提取物及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明是一种水母毒素提取物，其特征在于，它是从水母触手中分离得到的多肽混合物，其制备方法如下：(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；(2)葡聚糖凝胶G－10脱盐柱脱盐；(3)SP Sephadex C－25离子交换柱层析，收集第五峰分离物；(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C－25离子交换柱层析，收集第六峰分离物，即得。本发明还公开了一种水母毒素提取物的制备方法及其用途。本发明的水母毒素提取物是一种首次从水母触手中分离得到的具有较强抑制疼痛和抑菌活性的多肽混合物，有利于水母特别是海蛰这种低值资源获得高值化发展。

Description

一种水母毒素提取物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种海洋生物提取物，特别是一种水母毒素提取物；本发明还公开了上述水母毒素提取物的制备方法和用途。
背景技术
镇痛药是指能选择性地抑制痛觉，缓解消除疼痛的一类药物。目前广泛使用的镇痛药物主要有两类：第一类是作为受体激动剂与中枢神经系统的阿片受体结合，模拟内源性镇痛物质的功能、激活体内抗痛系统而发挥镇痛作用的阿片类镇痛药；第二类是通过抑制下视丘脑体温调节中枢前列腺素合成酶而抑制体神经传导的疼痛的非固醇类抗炎镇痛药。前者往往存在着较严重的耐受性和药物依赖性，而后者的镇痛效果有限。
生物毒素是具有特异活性和高选择性的天然活性物质，是很有价值的药物或药物导向化合物。水母毒素具有溶血活性、酶活性、神经毒性、皮肤坏死和肌肉毒性、肝脏毒性、心脏毒性、细胞毒性和影响粒子运转等活性。国外从六七十年代起就对水母毒素进行了研究，目前用分离纯化的方法已经从多种水母中提取去许多具有溶血、心脏毒性、神经毒性和肝细胞毒性的毒素蛋白。但是具有抑制疼痛和抑菌活性的水母毒素提取物未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的具有较强有效活性的水母毒素提取物，该提取物的提取原料易得，提取方法简单、操作性强。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种水母毒素提取物，其特点是，它是从水母触手中分离得到的多肽混合物，其制备方法如下：
(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；
(2)葡聚糖凝胶G-10脱盐柱脱盐：将冻干粉溶于纯净水后上样于G-10葡聚糖凝胶过滤柱，用Tris-HCl pH 7.8缓冲液洗脱，当测得A280小于0.03时停止洗脱；将按上述方法收集的脱盐后样液装入离心管，封口并做好标记放进-20℃冰箱中冷藏备用；
(3)SP Sephadex C-25离子交换柱层析：采用Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集第五峰分离物；
(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C-25离子交换柱层析，方法同步骤(3)，收集第六峰分离物，即得。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的水母毒素提取物，其特点是，步骤(1)所述的冻干粉制备的方法如下：将水母触手剪成小块，加入适量磷酸盐缓冲液，用高速组织捣碎机进行组织匀浆，收集匀浆液；高速冷冻离心取出上清液；将上清液倒平板后保鲜膜封存于-40℃冰柜冷冻，然后再放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥成冻干粉，装入离心管中于-20℃冰柜中保存备用。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的水母毒素提取物，其特点是，所加入的磷酸盐缓冲液为0.1M，pH为6.0。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的水母毒素提取物，其特点是，高速冷冻离心20min，10000r/min，4℃。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的水母毒素提取物，其特点是，在步骤(3)中所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.8。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的水母毒素提取物，其特点是，所述的原料水母触手为海蛰触手。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种如以上技术方案所述的水母毒素提取物的制备方法，其特点是，它采用了以下方法进行制备：
(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；
(2)葡聚糖凝胶G-10脱盐柱脱盐：将冻干粉溶于纯净水后上样于G-10葡聚糖凝胶过滤柱，用Tris-HCl pH 7.8缓冲液洗脱，当测得A280小于0.03时停止洗脱；将按上述方法收集的脱盐后样液装入离心管，封口并做好标记放进-20℃冰箱中冷藏备用；
(3)SP Sephadex C-25离子交换柱层析：采用Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集第五峰分离物；
(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C-25离子交换柱层析，方法同步骤(3)，收集第六峰分离物，即得。
本发明所述的水母毒素提取物可以用来制备抑制疼痛及抗微生物感染治疗的药物。
下面用本发明的水母毒素提取物的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果。
1.水母毒素提取物的小白鼠痛觉测定。
把恒温水浴的水温调解至55±0.5℃，取一个大烧杯置于恒温水浴锅中(烧杯底部一定要接触水面)。左手轻轻抓住小白鼠背部，在将小白鼠放入烧杯内的同时用秒表记时，同时用右手给烧杯加盖，避免小白鼠因受热而从烧杯内蹦出。此时，应密切观察小白鼠的活动，如果出现小白鼠因脚爪受热而舔爪现象或用力挣扎，要立即开盖取出小鼠，避免不必要的烫伤。记录小白鼠自放入烧杯至添后足所需时间(s)作为该小白鼠的痛阈值。凡在3s内出现或30s内不出现添后足者，属于过于敏感或过于迟钝，以及在烧杯内跳跃频繁者均弃之不用。
将上述合格的小白鼠分为3组，每组3只，每组分别腹腔注射样品溶解液，二倍浓度样品溶解液和生理盐水各0.5ml。给药15～60s后测定各组的痛阈值。若小白鼠在热板上停留60s仍无疼痛反应，应予取出，其痛阈值以60s计算。将各组每个小白鼠所测的痛阈值按公式计算用药后痛阈值提高的百分率。
痛阈值提高的百分率＝(注射后的痛阈值—注射前的痛阈值)/注射前的痛阈值×100％。注射后的痛阈提高百分率比对照组提高100％以上为有明显镇痛效果。实验结果见表1和表2。
表1注射样品前后9只小白鼠的痛阈值
注射物小白鼠编号     生理盐水     0.39mg/mL样品溶解液     0.78mg/mL样品溶解液
    1     2     3     4     5     6     7     8     9
注射前痛阈值(S)     19     23     25     20     22     24     21     23     19
15′痛阈值(S)30′痛阈值(S)60′痛阈值(S)     434040     363633     424140     565351     575755     606058     606060     606060     606060
表2注射样品后9只小白鼠的痛阈提高百分率
注射物小白鼠编号     生理盐水     0.39mg/mL样品溶解液     0.78mg/mL样品溶解液
    1     2     3     4     5     6     7     8     9
15′痛阈值提高百分率30′痛阈值提高百分率60′痛阈值提高百分率     126111111     565643     686460     180165155     159159150     150150142     186186186     161161161     216216216
从表1和表2中可以看出，染毒组的痛阈值与对照组相比明显偏高，且在样品浓度高时影响较强。实验结果表明海蛰毒素提取物对痛觉功能有显著的影响，能明显抑制疼痛。
2.水母毒素提取物的抑菌活性。
将高压灭菌后的固体营养琼脂培养基在50～60℃水浴中加热融化，趁热取20mL培养基液均匀地铺于玻璃平皿的底层，冷却凝固。各取100μL大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌悬液分别均匀涂布于培养基上，用微量移液器取20μL的样品(浓度0.39mg/ml)浸润滤纸(直径6mm、四层)，将滤纸片放于涂有菌悬液的培养基上，以无菌水为对照。放入37℃或28℃的生化培养箱中培养6h，及时观察抑菌效果。抗菌活性用抑菌圈直径表示(数值等于抑菌圈外径减滤纸直径)，当抑菌圈直径分别小于0.3mm、0.3-0.5mm、0.5-1.0mm、1.1-1.5mm和大于1.5mm时分别记为“+/-”，“+”，“++”，“+++”和“++++”，无抗菌活性用“”表示。
表3海蛰毒素提取物的抑菌活性
菌株     抑菌活性
大肠杆菌     ++++
枯草芽孢杆菌     +
金黄色葡萄球菌     ++
白色念珠菌     +++
该药理实验表明海蛰毒素提取物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和真菌(白色念珠菌)均表现出明显的抑菌活性。
本发明的水母毒素提取物是一种首次从水母触手中分离得到的具有较强抑制疼痛和抑菌活性的多肽混合物。本发明有利于水母特别是海蛰这种低值资源获得高值化发展。
附图说明
图1为水母毒素提取物的SP Sephadex C-25离子交换柱层析图。
图2为图1第五峰分离物再经过SP Sephadex C-25离子交换柱层析图。
具体实施方式
实施例1。参照图1、图2。一种水母毒素提取物，它是从水母触手中分离得到的多肽混合物，其制备方法如下：
(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；
(2)葡聚糖凝胶G-10脱盐柱脱盐：将冻干粉溶于纯净水后上样于G-10葡聚糖凝胶过滤柱，用Tris-HCl pH 7.8缓冲液洗脱，当测得A280小于0.03时停止洗脱；将按上述方法收集的脱盐后样液装入离心管，封口并做好标记放进-20℃冰箱中冷藏备用；
(3)SP Sephadex C-25离子交换柱层析：采用Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集第五峰分离物；
(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C-25离子交换柱层析，方法同步骤(3)，收集第六峰分离物，即得。
所得水母毒素提取物可用于制备抑制疼痛及抗微生物感染治疗的药物。
实施例2。在实施例1所述的水母毒素提取物中，步骤(1)所述的冻干粉制备的方法如下：将水母触手剪成小块，加入适量磷酸盐缓冲液，用高速组织捣碎机进行组织匀浆，收集匀浆液；高速冷冻离心取出上清液；将上清液倒平板后保鲜膜封存于-40℃冰柜冷冻，然后再放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥成冻干粉，装入离心管中于-20℃冰柜中保存备用。
实施例3。在实施例2所述的水母毒素提取物中，所加入的磷酸盐缓冲液为0.1M，pH为6.0。
实施例4。在实施例2所述的水母毒素提取物中，高速冷冻离心20min，10000r/min，4℃。
实施例5。在实施例1所述的水母毒素提取物中，在步骤(3)中所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.8。
实施例6。在实施例1-5中任何一项所述的水母毒素提取物中，的原料水母触手为海蛰触手。
实施例7。一种水母毒素提取物的制备方法，其步骤如下：
(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；
(2)葡聚糖凝胶G-10脱盐柱脱盐：将冻干粉溶于纯净水后上样于G-10葡聚糖凝胶过滤柱，用Tris-HCl pH 7.8缓冲液洗脱，当测得A280小于0.03时停止洗脱；将按上述方法收集的脱盐后样液装入离心管，封口并做好标记放进-20℃冰箱中冷藏备用；
(3)SP Sephadex C-25离子交换柱层析：采用Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集第五峰分离物；
(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C-25离子交换柱层析，方法同步骤
(3)，收集第六峰分离物，即得。
 所得水母毒素提取物可用于制备抑制疼痛及抗微生物感染治疗的药物。

Claims (8)

1.一种水母毒素提取物，其特征在于，它是从水母触手中分离得到的多肽混合物，其制备方法如下：
(1)冻干粉制备：以水母触手为原料，将其分割成块，组织匀浆，离心去除沉淀，再真空冷冻干燥，得冻干粉备用；
(2)葡聚糖凝胶G-10脱盐柱脱盐：将冻干粉溶于纯净水后上样于G-10葡聚糖凝胶过滤柱，用Tris-HCl pH 7.8缓冲液洗脱，当测得A280小于0.03时停止洗脱；将按上述方法收集的脱盐后样液装入离心管，封口并做好标记放进-20℃冰箱中冷藏备用；
(3)SP Sephadex C-25离子交换柱层析：采用Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集第五峰分离物；
(4)对第五峰分离物再进行SP Sephadex C-25离子交换柱层析，方法同步骤(3)，收集第六峰分离物，即得。
2.根据权利要求1所述的水母毒素提取物，其特征在于，步骤(1)所述的冻干粉制备的方法如下：将水母触手剪成小块，加入适量磷酸盐缓冲液，用高速组织捣碎机进行组织匀浆，收集匀浆液；高速冷冻离心取出上清液；将上清液倒平板后保鲜膜封存于-40℃冰柜冷冻，然后再放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥成冻干粉，装入离心管中于-20℃冰柜中保存备用。
3.根据权利要求2所述的水母毒素提取物，其特征在于，所加入的磷酸盐缓冲液为0.1M，pH为6.0。
4.根据权利要求2所述的水母毒素提取物，其特征在于，高速冷冻离心20min，10000r/min，4℃。
5.根据权利要求1所述的水母毒素提取物，其特征在于，在步骤(3)中所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.8。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的水母毒素提取物，其特征在于，所述的原料水母触手为海蛰触手。
7.一种如权利要求1所述的水母毒素提取物的制备方法，其特征在于，它采用了如权利要求1中所述的步骤(1)-(4)进行制备。
8.一种如权利要求1所述的水母毒素提取物作为制备抑制疼痛及抗微生物感染治疗的药物的应用。
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