CN115337331B - 一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物及液态发酵物的制备方法 - Google Patents
一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物及液态发酵物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，包括以下步骤：杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入杀青机中杀青2~5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，搅拌均匀，蒸汽蒸制后取出至得到枸骨叶混合物；接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，并将其发酵10~15天得到初级枸骨叶固态发酵物；烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，烘干，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。本发明还公开了一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法。本发明中主要由枸骨叶经过酵母菌发酵得到能抑制PTP1B活性的枸骨叶发酵物，与枸骨叶水提取液相比较，发酵物具有更高的活性。
Description
技术领域
本发明涉及枸骨叶制备方法领域，尤其涉及一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法及液态发酵物的制备方法。
背景技术
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是由于胰岛素分泌缺乏或机体产生胰岛素抵抗所引起的以血糖升高为主要特征的常见内分泌代谢性疾病。主要分为1型和 2型糖尿病，在糖尿病患者中90%以上为2型糖尿病。2型糖尿病现已成为肿瘤和心脑血管疾病之后的第三大危害人类健康的慢性疾病。
从1999年被发现PTP1B可对胰岛素和瘦素信号通路具有负调控作用以来，对于肥胖2型糖尿病的治疗和预防PTP1B以成为潜在的、重要的、有效的药物靶点。在天然产物的研究中，现以发现在60多种属,约500多个天然化合物具有高PTP1B抑制活性。这类化合物分布广泛、种类繁多。存在于植物的根、茎、叶、果，也在微生物的次代谢产物中被发现。它们的结构包括脂肪酸、酚类、萜类、类固醇和生物碱类等。目前为止，PTP1B抑制剂类药物还没有真正上市。名为ertiprotafib药物在二期临床试验中因无效和剂量依赖性副作用而中止。还有在白斑角鲨(Squalus acanthias)肝脏中提取的trodusquemine结束了Ⅰ期临床试验，结果对糖尿病患者表现出良好的耐受性。这项报告进一步证实了天然物中寻找PTP1B抑制剂是可行的。上述这些已发现的PTP1B抑制剂的数目来说，在不尽其数的天然产物中还是微乎其微的。所以在天然产物中筛选出更多的PTP1B抑制剂已成为研究者们的热门关注。
枸骨叶为冬青科植物枸骨（Ilex cornuta Lindl.）的叶，始载于《本草拾遗》，具有清热养阴、补益肝肾的功效，用于用于头晕、头痛、目眩等。现代药理学研究表明，具有抗炎、抗肿瘤，扩张冠状动脉、免疫提高等活性。其主要活性物有黄酮类、三萜类、甾醇类、有机酸类等，但很少报道其抗糖尿活性，特别是针对于肥胖2型糖尿病。专利《无糖型仙灵地黄组合物及其颗粒剂和制法》中，采用包括枸骨叶等组分制备成颗粒剂来治疗肾阳虚症。专利《一种降血糖的中药制剂》中，采用枸骨叶在内的20多种的中药组合物为一种可降血糖的中药制剂。这些说明枸骨叶本身，降低血糖或抗糖尿活性并不强，但是有潜在的抵抗糖尿病能力。
综上，现有技术存在的问题是枸骨叶提取物的抗糖尿病活性发挥作用有限，我们需要开发出具有强抗糖尿活性的枸骨叶保健食品。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法。
本发明还提供了一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法。
本发明的创新点在于本发明中主要由枸骨叶经过酵母菌发酵得到能抑制PTP1B活性的枸骨叶发酵物，与枸骨叶水提取液相比较，发酵物具有更高的活性。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：
一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120~200℃杀青机中杀青2~5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
（2）高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，按质量分数取，杀青枸骨叶为88~93%、大米淀粉5~10%、葡萄糖0.5~1%、酵母粉0.02~0.05%、纯净水0.5~1%，搅拌均匀，蒸汽蒸制30min后取出至45~50℃时得到枸骨叶混合物；
（3）接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1~2%，并将其发酵10~15天得到初级枸骨叶固态发酵物；
（4）烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，在80~120℃条件下，烘干8~12h，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。
进一步地，所述步骤（3）中接种发酵时，发酵温度为25~30℃。
进一步地，所述步骤（3）中发酵至第7天时，取出，搅拌均匀后再发酵。
一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120~200℃杀青机中杀青2~5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
（2）粉碎：将杀青枸骨叶与水混合并磨成枸骨叶浆料，所述杀青枸骨叶与水的质量比为2~3:7~8；
（3）高温杀菌：在枸骨叶浆料中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉，按质量分数取，杀青枸骨叶浆料为89~93.5%、大米淀粉5.5~10%、葡萄糖0.5~1%、酵母粉0.02~0.05%，搅拌均匀后杀菌得到枸骨叶混合物，杀菌时温度控制在140~150℃加热2~10秒；
（4）接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1~2%，于发酵罐中发酵2~3天得到发酵液；
（5）过滤：将发酵液采用50nm陶瓷膜过滤，得到枸骨叶液态发酵物。
进一步地，所述步骤（3）中搅拌均匀后的杀菌采用超高温瞬时杀菌机。
进一步地，所述步骤（4）中接种发酵时，温度为28~35℃，通气量为0.5 vvm，搅拌转速为200 rpm，溶解氧控制在30~60%。
本发明的有益效果是：
1、本发明中主要由枸骨叶经过酿酒酵母菌干粉发酵得到能抑制PTP1B活性的枸骨叶发酵物，与枸骨叶水提取液相比较，发酵物具有更高的活性。
2、本发明中对比单纯以通过葡萄糖苷酶、淀粉酶抑制为靶点的抗糖尿病的保健食品来说，结合PTP1B的新靶点，可对糠尿病人群可有更多的选择性。并且复配后，可达到多靶点、多协同控血糖的功能性食品，特别是针对于肥胖型糖尿病患者。
3、本发明中比起已有报道的真菌属产PTP1B抑制活性物来说，酿酒酵母菌干粉更安全。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120℃杀青机中杀青2min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，按质量分数取，杀青枸骨叶为88%、大米淀粉9.95%、葡萄糖1%、酵母粉0.05%、纯净水1%，搅拌均匀，蒸汽蒸制30min后取出至45℃时得到枸骨叶混合物；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1%，并将其发酵10天得到初级枸骨叶固态发酵物；发酵至第7天时，取出，搅拌均匀后再发酵。接种发酵时，发酵温度为25℃。
烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，在80℃条件下，烘干8h，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。
实施例2：一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入160℃杀青机中杀青3min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，按质量分数取，杀青枸骨叶为88.98%、大米淀粉10%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.02%、纯净水0.5%，搅拌均匀，蒸汽蒸制30min后取出至48℃时得到枸骨叶混合物；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1.5%，并将其发酵12天得到初级枸骨叶固态发酵物；发酵至第7天时，取出，搅拌均匀后再发酵。接种发酵时，发酵温度为28℃。
烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，在100℃条件下，烘干10h，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。
实施例3：一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入200℃杀青机中杀青5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，按质量分数取，杀青枸骨叶为93%、大米淀粉5%、葡萄糖0.98%、酵母粉0.04%、纯净水0.98%，搅拌均匀，蒸汽蒸制30min后取出至50℃时得到枸骨叶混合物；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的2%，并将其发酵15天得到初级枸骨叶固态发酵物；接种发酵时，发酵温度为30℃。
烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，在120℃条件下，烘干12h，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。
实施例4：一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120℃杀青机中杀青2min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
粉碎：将杀青枸骨叶与水混合并磨成枸骨叶浆料，所述杀青枸骨叶与水的质量比为2:7；
高温杀菌：在枸骨叶浆料中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉，按质量分数取，杀青枸骨叶浆料为89%、大米淀粉9.95%、葡萄糖1%、酵母粉0.05%，搅拌均匀后杀菌得到枸骨叶混合物，搅拌均匀后的杀菌采用超高温瞬时杀菌机，杀菌时温度控制在140℃加热2秒；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1%，于发酵罐中发酵2~3天得到发酵液；接种发酵时，温度为28℃，通气量为0.5 vvm，搅拌转速为200 rpm，溶解氧控制在30%。
过滤：将发酵液采用50nm陶瓷膜过滤，得到枸骨叶液态发酵物。
实施例5：一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入160℃杀青机中杀青3min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
粉碎：将杀青枸骨叶与水混合并磨成枸骨叶浆料，所述杀青枸骨叶与水的质量比为2.5:7.5；
高温杀菌：在枸骨叶浆料中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉，按质量分数取，杀青枸骨叶浆料为89.48%、大米淀粉10%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.02%，搅拌均匀后杀菌得到枸骨叶混合物，搅拌均匀后的杀菌采用超高温瞬时杀菌机，杀菌时温度控制在145℃加热6秒；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1.5%，于发酵罐中发酵2~3天得到发酵液；接种发酵时，温度为31℃，通气量为0.5 vvm，搅拌转速为200 rpm，溶解氧控制在45%。
过滤：将发酵液采用50nm陶瓷膜过滤，得到枸骨叶液态发酵物。
实施例6：一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，包括以下步骤：
杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入200℃杀青机中杀青5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
粉碎：将杀青枸骨叶与水混合并磨成枸骨叶浆料，所述杀青枸骨叶与水的质量比为3: 8；
高温杀菌：在枸骨叶浆料中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉，按质量分数取，杀青枸骨叶浆料为93.5%、大米淀粉5.5%、葡萄糖0.97%、酵母粉0.03%，搅拌均匀后杀菌得到枸骨叶混合物，搅拌均匀后的杀菌采用超高温瞬时杀菌机，杀菌时温度控制在150℃加热10秒；
接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的2%，于发酵罐中发酵2~3天得到发酵液；接种发酵时，温度为35℃，通气量为0.5 vvm，搅拌转速为200 rpm，溶解氧控制在60%。
过滤：将发酵液采用50nm陶瓷膜过滤，得到枸骨叶液态发酵物。
测定：取实施例1~3的成品2 kg，配制成40 mg/ml的样品，震荡1min后，过滤除去不溶物，取上清作为供检液做PTP1B的抑制率测定。
取实施例4~6中的成品，做PTP1B的抑制率测定。
对比例1~3：分别取实施例4~6中未经过接种发酵的枸骨叶混合物做PTP1B的抑制率测定。
PTP1B抑制率测试（测试样品中，保证了杀青枸骨叶含量的一致性）
根据结果显示，枸骨叶经过酿酒酵母菌干粉固态发酵后，PTP1B抑制活性是最高的，与对比例相比，枸骨叶经过酿酒酵母菌干粉液态发酵后，活性提升了3倍。因此，采用酒酵母菌干粉发酵枸骨叶，是一种有效的提升其功效和利用价值的方法。
效果试例：将实施例1、实施例4、对比例1得到的成品进行小鼠抗糖尿病验证实验。
肥胖型糖尿病小鼠模型的构建
4周龄雄性ob/ob小鼠30只在室温（22±2℃），恒定湿度（50-80%），12小时（6a.m.-6p.m.）自然昼夜循环下，在SPF级动物实验室饲养。所有动物自由饮水、摄食，5只/笼。经过1周适应性喂养，所有小鼠禁食不禁水12小时，测定空腹血糖（尾部取血）和体重。经4周喂养后（小鼠8周龄），挑选出ob/ob空腹血糖明显高于第1周的，且满足空腹血糖>13.8mmol/L的，肥胖型糖尿病小鼠。
动物分组与处理
把肥胖二型糖尿病ob/ob小鼠随机分为4组，实施例1组、实施例4组、对比例1组、空白组。上述小鼠每组各6只，干预组分别以ig 0.1mL/10g的量给药，空白组用去离子水来代替，每天两次（上午/晚上）。继续喂养8周后测定空腹血糖。
上表可以看出枸骨叶经过酿酒酵母菌干粉发酵后，能显著降低肥胖型糖尿病小鼠血糖水平。说明本发明制备的枸骨叶发酵物具有抗糖尿病功效，为糖尿病治疗的提供了新的方向。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.一种抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120~200℃杀青机中杀青2~5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
（2）高温蒸制：向杀青枸骨叶中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉、纯净水，按质量分数取，杀青枸骨叶为88~93%、大米淀粉5~10%、葡萄糖0.5~1%、酵母粉0.02~0.05%、纯净水0.5~1%，搅拌均匀，蒸汽蒸制30min后取出至45~50℃时得到枸骨叶混合物；
（3）接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1~2%，并将其发酵10~15天得到初级枸骨叶固态发酵物，发酵温度为25~30℃；
（4）烘干：将初级枸骨叶固态发酵物，在80~120℃条件下，烘干8~12h，粉碎即可得到枸骨叶固态发酵物。
2.根据权利要求1所述的抗糖尿病枸骨叶固态发酵物制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵至第7天时，取出，搅拌均匀后再发酵。
3.一种抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）杀青：采摘新鲜枸骨叶，放入120~200℃杀青机中杀青2~5min，取出放至室温得到杀青枸骨叶；
（2）粉碎：将杀青枸骨叶与水混合并磨成枸骨叶浆料，所述杀青枸骨叶与水的质量比为2~3:7~8；
（3）高温杀菌：在枸骨叶浆料中加入大米淀粉、葡萄糖、酵母粉，按质量分数取，杀青枸骨叶浆料为89~93.5%、大米淀粉5.5~10%、葡萄糖0.5~1%、酵母粉0.02~0.05%，搅拌均匀后杀菌得到枸骨叶混合物，杀菌时温度控制在140~150℃加热2~10秒；
（4）接种发酵：向枸骨叶混合物中添加酿酒酵母菌干粉并搅拌均匀，酿酒酵母菌干粉的质量为枸骨叶混合物质量的1~2%，于发酵罐中发酵2~3天得到发酵液，发酵时温度为28~35℃，通气量为0.5 vvm，搅拌转速为200 rpm，溶解氧控制在30~60%；
（5）过滤：将发酵液采用50nm陶瓷膜过滤，得到枸骨叶液态发酵物。
4.根据权利要求3所述的抗糖尿病枸骨叶液态发酵物制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中搅拌均匀后的杀菌采用超高温瞬时杀菌机。
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