CN115317520B - 一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用 - Google Patents
一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种锌铝类水滑石‑痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用，涉及肿瘤治疗领域，该方法是通过共沉淀法制备锌铝类水滑石，厌氧培养痤疮丙酸杆菌获得分散在去离子水中的菌液；锌铝类水滑石水溶液与菌液按比例混合、振荡、离心、重悬获得杂化材料。该杂化材料通过细菌代谢和免疫以及与纳米材料的协同实现对肿瘤的清除，解决单一治疗途径效果局限的难题。本发明中细菌杂化材料合成简单，细菌的厌氧特性使材料能够深入肿瘤组织低氧内部，并代谢产生具有杀伤作用的一氧化氮，同时促进锌铝类水滑石降解释放锌离子，锌离子与一氧化氮进一步打破肿瘤细胞内氧化还原平衡，促进细胞凋亡；细菌同时激活免疫反应，最终实现对肿瘤协同杀伤。
Description
技术领域
本申请涉及微生物杂化材料领域，尤其涉及一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用。
背景技术
癌症是当前全球共同面对的持续性公共卫生挑战，全球范围内，癌症所带来的负担正在逐渐加重。很多对癌症患者的化疗、放疗、免疫疗法等传统治疗手段普适性低、副作用强、容易产生抗药性，导致临床治疗效果不甚理想。由于癌症发病机制复杂，癌细胞具有异质性，很难实现对肿瘤的普遍性、特异性和全面性清除。因此，开发出安全、高效的新型肿瘤治疗手段符合肿瘤诊治研究的迫切需求。
细菌疗法的发展可以追溯到19世纪。近年来，沙门氏菌、李斯特菌等已经进入肿瘤治疗的临床试验阶段。但是，细菌的安全性、可控性以及有效性等问题，限制了肿瘤细菌疗法的进一步推广。另外细菌单药治疗面临着效果参差、有限的困境。因此，开发出优秀的治疗菌种，并且与其他治疗手段相结合，将进一步推动细菌治疗的发展。
近几年，许多研究将细菌与纳米材料相结合，利用细菌的靶向定植能力和杀伤性代谢产物，进一步提高抗肿瘤效率。设计和构建新的微生物杂化材料体系，细菌和纳米材料彼此补足缺陷，增强肿瘤治疗效果的技术具有强大的发展前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用，以解决细菌和纳米材料单独使用的局限，实现协同杀伤肿瘤的功效。
根据本申请实施例的第一方面，提供一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)将去离子水煮沸去除二氧化碳后冷却至室温；将六水硝酸锌和九水硝酸铝溶于去离子水中，得到的锌铝溶液，所述锌铝溶液中的六水硝酸锌和九水硝酸铝的浓度分别为0.3M和0.1M；将硝酸钠溶于去离子水得到0.2M的硝酸钠溶液，并使用0.8M的氢氧化钠溶液将硝酸钠溶液的pH调至9.5-10；将锌铝溶液逐滴加入硝酸钠溶液中，所述锌铝溶液与硝酸钠溶液的体积比为2:3，同时以 800-1200rpm搅拌下滴加0.8M的氢氧化钠溶液维持碱性，得到混合溶液，将混合溶液转移至水热釜中80℃反应16-24小时得到锌铝类水滑石晶体；重复三次超声和离心，过滤得到锌铝类水滑石水溶液；
(2)将存放于-80℃下的含25％-30％甘油的痤疮丙酸杆菌冻存液取出，在 35-38℃水浴解冻后，将其在厌氧超净工作台中加入液体培养基，置于35-38℃的摇床中，复苏40-50小时后，4000-5000rpm离心5-10分钟，去离子水清洗一次；再次4000-5000rpm离心5-10分钟，分散在去离子水中即得到痤疮丙酸杆菌分散液；
(3)将步骤(1)得到的锌铝类水滑石水溶液和步骤(2)得到的痤疮丙酸杆菌分散液以50μg/mL和15x107CFU/mL的比例混合得到混合液，所述混合液置于温度35-38℃下摇床中1-2小时；将混合液在4000-5000rpm下离心5-10分钟，去离子水重悬得到锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料。
进一步地，所述步骤(1)中滴加0.8M的氢氧化钠溶液维持碱性，其pH 控制为9.5-10。
进一步地，所述步骤(1)中重复三次超声和离心，具体为，9.5-20.5Hz下超声2-4分钟，再以10000-12000rpm离心5-10分钟，重复三次此过程。
进一步地，所述步骤(2)中在无氧超净工作台中加入液体培养基；培养需要使用厌氧反应包和密封袋，以确保无氧环境。
进一步地，所述步骤(2)中所述摇床的旋转速率为150-180rpm。
因此，上述的制备方法可得到的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料。
所述的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料在肿瘤一氧化氮杀伤、锌离子稳态失衡和免疫治疗剂中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明制备的痤疮丙酸杆菌与锌铝类水滑石的特性，该杂化材料具有以下优势：肿瘤微环境靶向性；肿瘤组织内部穿透力强；原位释放；低剂量可满足高效杀伤；激活免疫应答；良好的生物相容性。
锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料的成功合成为细菌杂化材料的制备和抗肿瘤策略提供了思路；锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌通过细菌代谢与纳米颗粒的协同，进一步将气体治疗、细菌治疗和纳米医用材料应用于肿瘤治疗；锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料在细胞水平和动物模型中表现出优秀的抗肿瘤性能，为安全、高效的抗肿瘤平台。
附图说明
图1为本发明实施例中锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料的合成示意图和电镜图，其中(a)为透射电镜图，(b)为扫描电镜图；
图2为本发明实例中锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料合成过程中的X 射线衍射分析变化图；
图3为本发明实例中锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料合成过程中的表面电位变化图；
图4为发明实例中痤疮丙酸杆菌使培养基pH降低以及锌铝类水滑石酸性条件下降解释放锌离子的性能图，(a)为低氧条件下培养基pH随时间的变化图， (b)为锌铝类水滑石分别在pH 6.5和5.5条件下24小时后锌离子的释放量，(c)为锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料在pH 5条件下24小时后的扫描电镜图；
图5为发明实例中痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌在低氧条件下代谢产生一氧化氮的性能图；
图6为发明实例中锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料在低氧条件下对 4T1细胞的杀伤性能图，(a)为不同的锌铝类水滑石浓度下锌铝类水滑石和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料对4T1细胞存活率的影响图，(b)为不同的痤疮丙酸杆菌浓度下痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料对4T1 细胞存活率的影响图；
图7为发明实例中巨噬细胞与锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料共培养后的转型情况以表征杂化材料的免疫激活性能图，(a)为对照组巨噬细胞光学显微镜下的细胞形态图，(b)为锌铝类水滑石处理18小时后巨噬细胞光学显微镜下的细胞形态图，(c)为痤疮丙酸杆菌处理18小时后巨噬细胞光学显微镜下的细胞形态图，(d)为锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料处理18小时后巨噬细胞光学显微镜下的细胞形态图；
图8为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠体重变化曲线图；
图9为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠肿瘤体积变化曲线图；
图10为发明实例中在荷瘤小鼠模型上各处理组小鼠肿瘤重量柱状图；
图11为发明实例中在远端瘤模型上各处理组小鼠肿瘤体积变化曲线图；
图12为发明实例中在远端瘤模型上各处理组小鼠的肺墨水染色图；
图13为发明实例中在远端瘤模型上各处理组小鼠的生存曲线图。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
下面结合附图和具体实例对本发明作进一步的说明。
本发明的目的在于提供一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料及其制备方法、应用。利用痤疮丙酸杆菌的厌氧特性，特异性定植于肿瘤乏氧环境；代谢产生丙酸，进一步降低微环境的pH，促进其表面包覆的锌铝类水滑石降解释放锌离子。同时，痤疮丙酸杆菌利用锌铝类水滑石中插层的和环境中的硝酸根进行反硝化作用生成一氧化氮，一氧化氮在胞内破坏金属硫蛋白螯合锌离子的能力以及清除自由基的能力。因此，痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石互相协同，打破肿瘤细胞内锌离子稳态，导致氧化损伤，引起细胞凋亡。锌铝类水滑石的降解，暴露出痤疮丙酸杆菌，将诱导肿瘤部位浸润的巨噬细胞由M2向M1转型，M1型巨噬细胞一方面直接杀伤肿瘤细胞，一方面能够通过激活树突状细胞向T细胞呈递抗原，引起免疫应答，激活对肿瘤细胞的免疫杀伤。这一多功能、相协同的细菌杂化材料在肿瘤治疗研究中具有重要意义。
下面通过实施例以详细说明本发明。应理解为以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述实例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
本实例提供一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备，包括：
步骤(1)，共沉淀法制备锌铝类水滑石水溶液：
具体地，将去离子水煮沸去除其中的二氧化碳，冷却至室温。称取1.785g 六水硝酸锌和0.75g九水硝酸铝溶于20mL上述去离子水中得到锌铝溶液；称取 0.51g硝酸钠溶于30mL的上述去离子水中，使用0.8M的氢氧化钠溶液将硝酸钠溶液的pH调至9.8。向上述硝酸钠溶液中逐滴加入锌铝溶液，并滴入0.8M的氢氧化钠溶液维持碱性。pH在9.8上下波动，并保持在9.5-10范围内。滴加过程 1000rpm持续搅拌。滴加完，将浑浊液转移至水热斧，80℃水热20小时以促进结晶。20Hz超声2分钟、11000rpm离心8分钟，重复三次后，过滤得到锌铝类水滑石水溶液。取出一定体积，烘干称量，计算锌铝类水滑石浓度。所述锌铝溶液与硝酸钠溶液的体积比为2:3，所述滴加过程以800-1200rpm速率搅拌效果相同，最佳搅拌速率为1000rpm，所述超声频率在9.5-20.5Hz下超声2-4分钟，再以10000-12000rpm离心5-10分钟，在此范围内达到的实验效果相同。
步骤(2)，痤疮丙酸杆菌的复苏过程以及制备痤疮丙酸杆菌水溶液：
具体地，将痤疮丙酸杆菌冻干菌粉溶解在液体培养基中，无氧环境下复苏70 小时后，加入已灭菌的甘油，使甘油浓度为25％，小管分装，-80℃保存。将细菌冻存液从-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴中融化，待冻存液解冻，完全融化后，在厌氧超净工作台中，将其加入液体培养基，放入厌氧反应包和密封袋，在恒温摇床中37℃，以170rpm的旋转频率进行复苏。48小时后，4500rpm离心 8分钟去除培养基，去离子水清洗两遍，最后分散在去离子水中。紫外-可见光分光光度计测量并换算出菌液浓度。所述无氧超净工作台中加入液体培养基；培养需要使用厌氧反应包和密封袋，以确保无氧环境。所述混合液置于温度 35-38℃下摇床中1-2小时；将混合液在4000-5000rpm下离心5-10分钟，实验中在这些范围内进行实验，达到的技术效果相同。
步骤(3)，制备锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料：
具体地，痤疮丙酸杆菌与锌铝类水滑石混合的浓度为15x107CFU/mL和50 μg/mL；混合液在37℃摇床振荡1.5小时，4500rpm转速离心8分钟，去离子水清洗两遍。根据处理量加入适量重悬液，获得一定浓度的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料。
锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的形貌分析图如图1所示，可见在上诉优选制备条件下，锌铝类水滑石结晶性良好，大部分呈现规则形状；痤疮丙酸杆菌为杆状，为锌铝类水滑石提供充足的结合空间；锌铝类水滑石与痤疮丙酸杆菌混合后，锌铝类水滑石包覆在细菌表面。图2为X射线衍射图，可见痤疮丙酸杆菌呈现非晶态馒头峰，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌复合材料呈现出锌铝类水滑石的特征峰，进一步确认锌铝类水滑石加载到痤疮丙酸杆菌上。图3为表面电位图，可见锌铝类水滑石呈正点，痤疮丙酸杆菌表面带负电荷，复合材料的点位更加接近中性，说明二者可通过静电吸附结合。
实施例2
材料释放锌离子和一氧化氮的性能：
实验(1)，痤疮丙酸杆菌代谢降低培养基pH：
具体地，将痤疮丙酸杆菌悬液稀释到1mL无抗性细胞培养基中，浓度为3x107CFU/mL，无氧条件下培养。分别在0、5、18、24、29、42和48小时，检测培养基pH。
实验(2)，锌铝类水滑石酸性条件下释放锌离子：
具体地，取1mL锌铝类水滑石注入透析袋，将透析袋分别放入pH为6.5 和5.5的醋酸缓冲液中。振荡24小时后，吸取5mL透析袋外的溶液，电感耦合等离子光谱发生仪检测锌离子含量。
实验(3)，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料在酸性条件下表面锌铝类水滑石的降解：
具体地，将复合后的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌材料置于pH为5的盐酸溶液中，放置24小时。扫描电镜观察复合材料形态特征。
实验(4)，痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌代谢释放一氧化氮：
具体地，分别将痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌稀释至1mL无抗性细胞培养基中，浓度为3x107CFU/mL，置于厌氧反应袋中，37℃摇床振荡培养。分别在0、2、4、8、20、32和48小时，将培养基5000rpm转速离心5分钟，吸取上清液，使用一氧化氮检测试剂盒，酶标仪检测信号强度，根据标准曲线计算一氧化氮含量。
如图4a所示，痤疮丙酸杆菌低氧条件下代谢降低培养基pH，48小时后，培养基的pH降低至5.5-6.0之间。由图4b可见，锌铝类水滑石在酸性条件下降解释放更多的锌离子，pH5.5条件下，24小时约有50％的锌离子从锌铝类水滑石中释放出来。图4c显示，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌在pH 5条件下24小时，表面包覆的锌铝类水滑石几乎全部降解，暴露出痤疮丙酸杆菌。因此，图4 证明了痤疮丙酸杆菌通过代谢降低pH，从而促进锌铝类水滑石降解释放锌离子的性能。由图5可知，痤疮丙酸杆菌低氧环境下代谢释放一氧化氮，随着细菌进入平台期，一氧化氮的释放量在培养20小时达到最大量，随后不再继续增加，并且锌铝类水滑石的包覆将进一步提高一氧化氮的产量，这是由于锌铝类水滑石插层的硝酸根为该反硝化作用提供原料。因此，图5证明了锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料释放一氧化氮的性能。
实施例3
本实验通过在细胞水平的杀伤效果来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。所选用的肿瘤细胞为4T1小鼠乳腺癌细胞系：
实验(1)锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌与相同浓度锌铝类水滑石杀伤性能的比较：
具体地，提前两天复苏痤疮丙酸杆菌，提前一天将细胞种植在24孔板中。用盐酸将无抗性细胞培养基pH调至6.5。将15x107CFU/mL的痤疮丙酸杆菌分别与50、100、150、200和250μg/mL的锌铝类水滑石复合，5000rpm转速离心10 分钟后，使用无抗性细胞培养基重悬。杂化材料处理组，插入式细胞培养器 (0.4μm孔径)下室加入800μL无抗性细胞培养基，上室加入200μL材料悬液。锌铝类水滑石组对应的浓度分别为0、10、20、30、40和50μg/mL。乏氧培养箱(氧气浓度为3％)中处理40小时，检测细胞活性。
实验(2)锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌与相同浓度痤疮丙酸杆菌杀伤性能的比较：
具体地，提前两天复苏痤疮丙酸杆菌，提前一天将细胞种植在24孔板中。用盐酸将无抗性细胞培养基pH调至6.5。将100μg/mL的锌铝类水滑石分别与5、 10、15、20、25和30x107CFU/mL的痤疮丙酸杆菌复合，离心之后，使用无抗性细胞培养基重悬。插入式细胞培养器(0.4μm孔径)下室加入800μL无抗性细胞培养基，上室加入200μL材料悬液。痤疮丙酸杆菌组对应的浓度分别为1、2、 3、4、5和6x107CFU/mL。乏氧培养箱(氧气浓度为3％)中处理40小时，检测细胞活性。
如图6所示，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌对4T1细胞的杀伤能力显著强于同浓度的锌铝类水滑石和痤疮丙酸杆菌分别处理。一定浓度范围内的锌铝类水滑石和痤疮丙酸杆菌具有较好的细胞相容性，复合后的材料具有较强的细胞毒性。在锌铝类水滑石和痤疮丙酸杆菌复合浓度分别为3x107CFU/mL和30μg/mL以及 4x107CFU/mL和20μg/mL时，对4T1细胞具有约70％的杀伤能力。说明锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌具有优异的肿瘤细胞杀伤性能。
实施例4
本实验通过在细胞水平的促巨噬细胞转型效果来说明材料在免疫治疗方面的应用。所选用的细胞为RAW 264.7巨噬细胞系：
具体地，提前两天复苏痤疮丙酸杆菌，提前一天将细胞种植在24孔板中。使用无抗性细胞培养基。分别将锌铝类水滑石、痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石- 痤疮丙酸杆菌杂化材料与巨噬细胞共同培养，锌铝类水滑石浓度为20μg/mL，痤疮丙酸杆菌浓度为3x107CFU/mL。在乏氧培养箱(氧气浓度为3％)中孵育18 小时。光学显微镜观察巨噬细胞形态。
如图7所示，对照组(a)和锌铝类水滑石(b)处理组的巨噬细胞呈圆形或椭圆形，而痤疮丙酸杆菌(c)和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料(d)处理组的细胞形态发生显著改变，细胞变大，呈不规则状，并伸出细长伪足。说明痤疮丙酸杆菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料能够有效诱导巨噬细胞转型，以激活免疫应答，实现肿瘤免疫治疗。
实施例5
本实验通过在动物(小鼠)水平的肿瘤抑制来说明材料在肿瘤治疗方面的应用。小鼠模型为乳腺癌细胞皮下移植瘤：
具体地，首先将4T1细胞种植在四周龄母鼠一侧背部，构建荷瘤小鼠模型。待肿瘤长至70-100mm3，随机将小鼠分为六组，进行注射处理。杂化材料最终用生理盐水重悬，死菌杂化材料组在处理前在60℃热灭火30分钟，室温后即可注射。在第0、2、4天进行以下处理：第一组(I)静脉注射生理盐水，第二组(II) 静脉注射锌铝类水滑石(100μg)，第三组(III)瘤内注射灭活菌(10x107CFU) 包覆锌铝类水滑石(100μg)的杂化材料，第四组(IV)静脉注射活菌(10x107CFU)，第五组(V)静脉注射锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌(100μg-10x107CFU)杂化材料，第六组(VI)瘤内注射锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌(100μg-10x107CFU)杂化材料。每隔一天称量小鼠体重和肿瘤尺寸，在第14天，牺牲小鼠，取下肿瘤称重。
从图8中可以看出，所有处理组小鼠体重并未出现下降，随时间呈现逐渐增加的趋势，说明上述处理对小鼠的正常生理活动并无明显影响。图9所示，静脉注射锌铝类水滑石没有产生明显的肿瘤抑制效果。静脉注射痤疮丙酸杆菌和瘤内注射热灭活的杂化材料具有一定地抑制肿瘤生长的效果，可能由于活菌在肿瘤部位定植、代谢，并引起免疫应答，产生一定杀伤和免疫作用，肿瘤部位的死菌也具有激活免疫的作用。而静脉注射锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料显著抑制了肿瘤，并且瘤内注射活菌杂化材料表现出最强的抑制效果。该结果表明，锌铝类水滑石和痤疮丙酸杆菌代谢产物的相互协同以及痤疮丙酸杆菌的免疫激活作用赋予了该杂化材料优秀的抑瘤能力。图10所示的肿瘤重量与肿瘤体积基本吻合，进一步证明了锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料在荷瘤小鼠模型中优异的肿瘤杀伤功能。
实施例6
本实验通过在动物(小鼠)水平的远端肿瘤抑制来说明材料在肿瘤免疫治疗方面的应用。小鼠模型为远端移植瘤模型：
具体地,图12所示，上述荷瘤小鼠的肿瘤被治愈或切除后，在第一组(I) 静脉注射生理盐水，第二组(II)静脉注射锌铝类水滑石，第四组(IV)静脉注射活菌和第五组(V)静脉注射锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料的小鼠另外一边种上第二个瘤。之后测量记录肿瘤尺寸变化。在种瘤后20天，每组随机选择一只小鼠做肺墨水染色，具体地：将小鼠安乐死后剪开小鼠的胸腔使肺和气管暴露出来，用注射器吸取一定浓度的黑色墨水后，从气管将墨水注入肺部，待肺中充满墨水后，取下肺组织观察转移病灶并拍照。记录各组小鼠自然死亡的时间，绘制生存曲线。
从图11中可以看出，注射了活菌和锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌复合材料的两组小鼠在二次种瘤后，肿瘤生长受到明显抑制，尤其是杂化材料组中第二个种瘤的体积几乎为零。图12显示，对照组和锌铝类水滑石组存在明显的肺转移现象，活菌组也有一定程度的肺转移，而在杂化材料组并未发现肿瘤转移。图13 显示了不同组别的存亡情况，可见对照组和锌铝类水滑石组在第二个种瘤植入后的三十天内全部死亡，活菌注射组在六十天后仍然有约47％小鼠存活，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌复合材料注射组的生存率高达约70％。以上结果表明，锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌杂化材料处理的小鼠体内具有免疫记忆效应，能够抑制远端瘤的生长和肿瘤转移，有效提高小鼠生存率。
由上述实施例可知，本发明提供的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料中，锌铝类水滑石表面带大量正电荷，痤疮丙酸杆菌带负电，二者可以通过静电吸附结合，同时平衡彼此的电位，避免在血液循环过程中被清除；痤疮丙酸杆菌的厌氧趋向性使杂化材料定植于肿瘤乏氧环境，并且能够深入到组织内部；痤疮丙酸杆菌在肿瘤部位代谢产生丙酸，进一步降低pH，促进锌铝类水滑石降解释放锌离子；痤疮丙酸杆菌利用环境中以及表面锌铝类水滑石插层硝酸根进行反硝化作用，生成一氧化氮；一氧化氮在肿瘤细胞内形成超氧亚硝基阴离子，破坏金属硫蛋白螯合锌离子的能力以及清除自由基的能力；胞内锌离子平衡的打破进一步导致氧化还原水平的失衡，引起细胞凋亡，实现对肿瘤细胞的高效杀伤。并且，痤疮丙酸杆菌具有促进巨噬细胞转型的能力，增加肿瘤组织浸润的M1型巨噬细胞，通过激活树突状细胞向T细胞呈递抗原，引起免疫应答，激活对肿瘤细胞的免疫杀伤。这一多功能肿瘤治疗材料利用细菌的厌氧代谢，特异性在肿瘤部位协同杀伤肿瘤细胞，在肿瘤治疗中具有重要意义。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (6)
1.一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）将去离子水煮沸去除二氧化碳后冷却至室温；将六水硝酸锌和九水硝酸铝溶于去离子水中，得到锌铝溶液，所述锌铝溶液中的六水硝酸锌和九水硝酸铝的浓度分别为0.3M和0.1M；将硝酸钠溶于去离子水得到0.2M的硝酸钠溶液，并使用0.8M的氢氧化钠溶液将硝酸钠溶液的pH调至9.5-10；将锌铝溶液逐滴加入硝酸钠溶液中，所述锌铝溶液与硝酸钠溶液的体积比为2:3，同时以800-1200rpm搅拌下滴加0.8 M的氢氧化钠溶液维持pH在9.5-10，得到混合溶液，将混合溶液转移至水热釜中80℃反应16-24小时得到锌铝类水滑石晶体；重复三次超声和离心，过滤得到锌铝类水滑石水溶液；
（2）将存放于-80℃下的含25%-30%甘油的痤疮丙酸杆菌冻存液取出，在35-38℃水浴解冻后，将其在厌氧超净工作台中加入液体培养基，置于35-38℃的摇床中，复苏40-50小时后，4000-5000 rpm离心5-10分钟，去离子水清洗一次；再次4000-5000rpm离心5-10分钟，分散在去离子水中即得到痤疮丙酸杆菌分散液；
（3）将步骤（1）得到的锌铝类水滑石水溶液和步骤（2）得到的痤疮丙酸杆菌分散液以50μg/mL和15x107 CFU/mL的比例混合得到混合液，所述混合液置于温度35-38℃下摇床中1-2小时；将混合液在4000-5000rpm下离心5-10分钟，去离子水重悬得到锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料。
2.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中滴加0.8 M的氢氧化钠溶液维持碱性，其 pH控制为9.5-10。
3.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中重复三次超声和离心，具体为，以频率为9.5-20.5Hz下超声2-4分钟，再以10000-12000rpm离心5-10分钟，重复三次此过程。
4.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中在无氧超净工作台中加入液体培养基；培养需要使用厌氧反应包和密封袋，以确保无氧环境。
5.根据权利要求1所述的一种锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述摇床的旋转速率为150-180rpm。
6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的锌铝类水滑石-痤疮丙酸杆菌细菌杂化材料。
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