KR20080031763A

KR20080031763A - 층상 이중 수산화물을 이용한 생체 내 선택적 종양억제방법

Info

Publication number: KR20080031763A
Application number: KR1020060097719A
Authority: KR
Inventors: 박태운
Original assignee: (주)나노하이브리드
Priority date: 2006-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2008-04-11

Abstract

본 발명은 MTX/LDH 하이브리드를 종양에 처리함으로써 종양의 증식을 생체 내에서 선택적으로 억제하고 내성을 극복하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 금속 이중층 수산화물 (LDH)에 이온 교환 반응을 통하여 Methotrexate (MTX)를 층간 삽입시켜 제조한 크기가 조절된 MTX/LDH 하이브리드를 쥐의 종양모델에 주사함으로써 MTX 단독처리시보다 종양의 증식을 부작용 없이 선택적으로 억제하고 장기약물투여에 의해 생길 수 있는 내성 (multidrug resistance)을 극복하는 방법을 제공한다.

MTX/LDH 하이브리드, 종양억제, 선택성

Description

층상 이중 수산화물을 이용한 생체 내 선택적 종양억제 방법 {Target Delivery of Anti-cancer drug by using LDH}

도 1은 실시예1에서 합성한 LDH의 반응 온도에 따른 크기의 변화를 보여주는 전자현미경 사진이다. 도 1a, 1b, 1c와 1d는 각각 섭씨 100, 125, 150, 180도 조건에서 얻어진 LDH로서 평균입도는 각각 115, 220, 300, 340nm이다. 특히 150도에서 합성된 시료의 경우 입도분포가 50~450nm로서 동물실험에 이용되었다. 그림에서 scale bar는 200nm를 나타낸다.

도 2는 LDH(A)와 MTX/LDH혼성체(B)의 XRD 패턴과 MTX가 LDH내에 담지된 구조 모델을 나타내 보이고 있으며 MTX가 담지되기 전의 LDH는 층간거리가 8.7A이고, MTX가 담지된 MTX/LDH 혼성체의 층간거리는 21.9A이다. 따라서 이러한 XRD 패턴으로부터 MTX가 LDH안에 담지되었는지의 여부를 확인할 수 있다.

도 3는 누드 마우스를 통한 항암제 Xenograft 실험을 위해 누드마우스에 MNNG/HOS 세포주를 착상시켜 1cm정도 성장시킨 다음(2~4주정도 소요됨) 4주동안 매 주 꼬리 정맥을 통하여 LDH(B), MTX(C)와 MTX/LDH(D)를 투여하여 아무것도 투여하지 않은 대조군(A)와 비교한 실험을 보여주고 있는바 대조군(310mm²), LDH투여(244mm²), MTX투여군(288mm²)의 경우 암 성장이 억제되지 않는데 반해 MTX/LDH혼성체를 투여한 D의 경우 그 크기(87mm²)가 확연하게 차이가 나는 것을 보여주고 있다.

도 4는 MTX의 체내의 동태를 보여주기 위하여 MTX에 형광체를 부착한 후 체내에 투여한 다음 간, 허파, 암조직을 관찰한 현미경 사진이다. 이와 비교하기 위하여 형광체(FITC)를 부착한 FITC-LDH와 FITC를 부착한 FITC-MTX를 LDH에 담지시킨 MTX-FITC/LDH의 체내 조직상의 분포도 동시에 보여주고 있는데 MTX의 경우 체내에서 거의 관찰되지 않았지만 LDH에 담지되어 투여된 MTX-FITC는 암조직에서만 뚜렷하게 관찰되었다. 참고로 LDH의 경우는 다른 조직에서는 관찰되지 않았지만 신장에서 관찰되어 주로 신장을 통해 배출되어 지는 것으로 알게 되었다.

악성 종양의 치료에서 화학요법은 수술적 치료와 함께 가장 기본적인 항암치료방법의 하나로서, 생존 기간의 연장과 암 치료를 위한 필수적 수단이 되어왔다. 암 치료 효과를 높이기 위한 화학요법은 항암제를 장기간 고용량으로 투여하는 결과를 초래하여 고용량으로 인한 부작용 유발과 장기간 투여로 인한 내성인자 (multidrug resistance)를 발현시킴으로써 약물 효과를 감소시키는 것이 현 항암치료에 있어서 가장 큰 문제점으로 대두되고 있다. 따라서, 부작용 없는 항암 효과를 위한 암세포로의 선택적 targeting과 내성을 극복하기 위한 획기적인 방법을 찾기 위한 노력이 요구되는 실정이다.

임상에서 골육종 치료의 표준 치료법으로 인정받고 있는 항암 화학요법은 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX), 아드리아마이신 (adriamycin), 시스플라틴 (cisplatin), 이포스파미드 (ifosfamide) 등을 사용하고 있다. 그러나 이들 화학 약물들의 반복된 과량 주입은 환자에게 부작용과 면역체계 손상을 가져올 수 있으며, 특히 정상세포에도 손상을 유발할 수 있어 암세포 만으로의 선택적인 전달이 문제시 되고 있다. 또한, 화학 약물의 장기적 과량 주입은 환자에게 약물에 대한 내성을 유발함으로써 약물의 효과를 감소화 하는 것으로 지적되고 있다. 현재까지 이러한 화학 요법의 문제점을 극복하기 위해서는, 몇 가지 서로 다른 약물을 복합 처방하는 컴비네이션 치료법을 사용하거나 혹은 약물 내성 및 독성을 나타내지 않는 범위 내에서 최대량의 약물을 투여하는 등 주로 약물 개발보다는 치료법 개선에 더 중점이 맞춰져 왔다. 이와 더불어, 약물 전달 시스템 (Drug delivery system)에 관한 연구가 약학 전반에서 이루어짐에 따라서 목표 지향성을 지니고 약물 내성 기작을 회피하려는 의도의 연구들이 활발히 진행되고 있으나, 현재까지 뚜렷한 성과를 지닌 연구 결과들을 없었다. 최근 나노기술을 인체 질병 치료에 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행됨에 따라서, 나노 약물 전달 시스템의 개발이 눈길을 끌고 있으며, 나노 수준에서의 전달 담체 조작에 따라서 특수 기능성이 극대화된 나노 전달 담체의 제조 가능성이 보이고 있다. 특히 시험관 내 실험 결과 LDH 나노 담체와의 하이브리드화를 통하여 세포내 DNA와 MTX 전달이 효과적인 방법이라는 것이 밝혀진 상태다.

브루사이트 (brucite) 층 모양을 가진 양이온성 LDH 층 사이에 음전하를 띤 생체 물질이 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)에 의하여 안정화를 이루게 되어 음이온성 생체 물질들이 보존될 수 있다. 이렇게 보존된 음이온성 생체 물질들은 LDH의 독특한 음이온 교환 능력에 따라서 보존 혹은 방출 될 수도 있다. 또한 LDH와의 혼성화 (hybridization)에 의하여 전기적으로 중성/양이온성을 가지게 되는 생체 물질은 음전하를 띠고 있는 세포막에 대하여 정전기적 반발 작용을 크게 감소시켜 세포내의 진입이 촉진될 수 있다.

또한, LDH는 가장 일반적 엔도사이토시스 (endocytosis) 경로인 클라드린 (clathrin)에 의해 세포내로 전달되는 것으로 밝혀져, 이에 의한 하이브리드의 세포내 진입 및 전달을 촉진시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 실제로 MTX/LDH 하이브리드를 시험관 내에서 종양세포에 처리한 경우 MTX 단독 처리시보다 빠른 시간 내에 종양 세포의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다.

따라서, 본 발명에서는 저분자량의 항암제인 MTX가 생체내의 짧은 체류시간과 종양세포의 선택성 부족으로 인해 암세포 및 조직에서의 농도 저하와 더불어 정상조직으로의 고른 분포를 가져와 바람직하지 못한 부작용을 가져오는 것을 극복하기 위 해 LDH를 이용하여 분자량의 증가 효과를 가져와 생체내의 체류시간의 증가 및 암세포 선택성을 증가시킬 수 있게 한다. 이를 위해 나노 약물 담체로 이용되는 LDH 나노입자의 사이즈 조절하여 암세포조직 주위의 느슨한 혈관 투과망을 쉽게 통과시켜 약물을 암세포로만 선택적으로 전달함으로써 부작용을 최소화하고 약물효과를 극대화시키는 한편, 엔도사이토시스에 의한 세포내 진입 및 전달 촉진으로 항암효과를 극대화 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 MTX/LDH 하이브리드를 쥐의 종양모델에 주사함으로써 선택적으로 종양의 증식을 억제하고 내성을 극복 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 크기가 50-450 nm로 조절된 금속 이중층 수산화물 (Layered Double Hydroxide, LDH)에 이온 교환 반응을 통하여 MTX를 층간 삽입시켜 제조한 MTX/LDH 하이브리드를 쥐의 종양모델에 주사함으로써 MTX 단독 처리시보다 선택적으로 부작용 없이 종양치료에 효과를 보이고 장기 약물투여로 생길 수 있는 내성을 극복할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 증식이 억제되는 종양 세포는 원발성 악성 골종양 중 가장 흔한 골육종 세포로서, 예를 들면 MNNG/HOS(Human Osteosarcoma) 세포 등을 언급할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 하기의 실시예들 및 비교예들을 통해 더욱 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 100-200 nm 수열반응에 의한 균일한 크기 합성법

LDH 나노담체의 크기 조절에 따라서 세포 내 엔도사이토시스를 용이하게 함과 동시에 암조직에 대한 선택성을 부여할 수 있다. 본 발명에서는 다양한 크기의 LDH 나노담체를 제조하였으며, 특히 엔도사이토시스와 향상된 진입 및 유지 효과를 극대화시킬 수 있도록 LDH 나노담체의 크기를 100~200 nm 로 균일하게 유지시켰다. LDH 합성 반응을 위하여 Mg(NO3)2-6H2O 와 Al(NO3)3-9H2O를 이산화탄소가 제거된 물에 녹여 Mg2+/Al3+ 혼합 용액을 만든다. 혼합 용액의 [Mg2+ + Al3+]의 농도는 0.001 ~ 수 M 까지 다양화할 수 있으나, Mg2+/Al3+의 비율은 2:1로 균일하게 한다. Mg/Al 혼합 용액은 음이온 (CO32-, NO3-을 비롯한 다양한 유기 혹은 무기산이 가능하다.) 이 녹아 있는 NaOH 용액으로 적정하여 혼합 용액의 pH를 9에 맞춘다. 혼합 용액은 수열합성 용기 내에서 숙성 과정을 거쳐 균일한 입자 크기를 가진 LDH 나노입자로 얻어질 수 있다. 수열 합성 용기 내의 온도를 100 도부터 250도까지 다양하게 조절하고 또한 숙성 시간을 조절함에 따라서 균일한 크기의 LDH 입자의 입도는 수십 ~ 수백 nm로 조절될 수 있다. 도 1은 100~180도에서 합성된 LDH의 입자들의 크기를 보여주는 전자현미경 사진으로 합성 온도의 증가에 따라 크기가 커짐을 알 수 있다. 본 발명에서는 특히 150 도 온도에서 24시간 숙성시켜 얻게 되는 평균 입자크기 300nm(입도분포 : 50~500 nm) 크기의 LDH 입자를 이하 실시 예에서 사용한다.

[ 실시예 2] 항암제 MTX 의 LDH 나노 담체 내 담지

항암제 MTX는 여러 가지 방법으로 LDH 나노 담체 내에 담지 될 수 있다. 음이온 교 환 반응과 공침 반응이 그 대표적인 예로서, 본 발명에서는 두 가지 방법 모두를 통하여 MTX의 담지에 성공하였다. MTX의 공침 반응은 실시예 1에서 기술한 바와 동일하며 다만 Mg/Al 혼합 용액을 MTX가 녹아 있는 NaOH 용액으로 적정함으로서 얻게 되었다. 이 때 반응에 필요한 MTX의 농도는 다양하게 사용할 수 있으며 농도가 높아짐에 따라서 LDH 내 담지되는 양을 조절할 수 있고, 담지 될 수 있는 최대 양은 전체의 45 질량%까지 가능하다.

이온 교환 반응을 위해서는 실시예 1에서 만들어진 LDH 나노입자를 이용한다. LDH 나노 입자 중 NO3- 이온으로 합성한 LDH 분말 1g을 이산화탄소가 제거된 증류수에 완전히 분산한 뒤, MTX 용액(1 wt %)을 분산액에 첨가하여 2일 이상 상온에서 교반한다. 이렇게 얻어진 MTX/LDH혼성체 내의 MTX의 함량은 원소 분석에 의해 구하여 졌으며그 값은 45%였다. 실제 MTX의 용액내의 MTX 농도에 따라서 LDH/MTX내의 MTX 함량이 달라지게 되며 최대 45 질량 %까지 담지가 가능하다. MTX와 같은 항암제의 LDH내의 담지 여부는 XRD(X-ray diffraction)를 통하여 분석할 수 있으며 본 실시예를 통해 얻어진 MTX/LDH 혼성체의 회절 패턴이 도 2에 나타나 있다.

[ 실시예 3] 형광 표지된 MTX 약물이 담지된 LDH 나노 담체

형광 표지된 MTX 약물의 생체 내 이동 경로가 LDH 담지에 의하여 달라지는 경향을 탐지하기 위하여 약물-형광체 (본 실시예에서는 MTX-FITC에 대하여 언급한다.) 를 LDH 내에 담지하였다. 반응을 위하여는 실시예 2에서 언급한 이온 교환 반응을과 동일하고 다만 MTX대신에 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 부착된 MTX-FITC 용 액을 사용하였다. 마찬가지로 얻어진 분말은 수세한 뒤 건조하고, 다음 단계의 실험을 위하여 다양한 매체에 분산되어 사용될 수 있다.

[ 실시예 4] 종양 모델에서의 치료 효과

MTX/LDH 하이브리드의 종양 치료 효과를 보기 위하여 생체에 종양 모델을 유도한 뒤 MTX와 MTX/LDH 하이브리드를 각각 정맥 주사하여 치료 효과를 비교할 수 있다. 본 실시예에서는 종양 모델이 유도된 누드 마우스에서의 치료 효과에 대하여 언급한다. 6주령의 balb/c 누드 마우스의 등에 1 × 10⁷ 개의 종양 세포(본 실시예에서는 골육종 세포인 MNNG/HOS 세포에 대하여 언급한다.)를 피하 주사하여 4주간 종양 모델을 유도하여 직경이 대략 1 cm 인 종양을 얻는다. 종양이 착상된 누드 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 4주동안 1주일에 한 번씩 각각의 약물 ( MTX, MTX/LDH, saline) 을 주사하고 종양의 크기 변화를 관찰한다. 이 때의 MTX 농도는 50mg/ml로 고정하고 부피를 달리하여 실제 약물 투여량은 <MTX : 30 mg/kg, MTX/LDH : 75 mg/kg, saline : 다른 약물과 동일한 부피> 로 정하여 투여하였다. 이는 MTX/LDH 하이브리드 내에 있는 MTX의 양과 동일한 양을 투여하여 LDH의 전달효과를 보기 위함이다. 투여 농도는 LD-50 (투여시 4주 내에 실험군의 개체 50 %가 죽거나 치명적인 체중 감소를 보이는 투여량) 이하에서 자유롭게 조절 될 수 있으나 실험에서는 LD20을 사용하였다.

실험 결과, MTX를 주사한 누드 마우스 그룹은 saline을 처리한 control 그룹과 비 슷하게 시간에 따른 종양 크기의 증가를 보였으나, MTX/LDH 하이브리드를 주사한 누드 마우스의 종양은 시간이 경과해도 크기의 변화가 거의 없으며, 4주 이후 약간 줄어드는 경향을 보였다. 본 실시예를 통하여 MTX/LDH 하이브리드의 증대된 치료 효율을 알 수 있으며, MTX의 효과에 비교하여 종양 조직으로의 선택적 진입을 예상할 수 있다.

[ 실시예 5] 나노담체의 종양 선택성 효과 확인

나노담체가 갖고 있는 선택성 및 생체 내에서의 배설을 통한 독성 최소화 가능성을 확인하기 위하여 종양이 유도된 누드 마우스에 형광체로 표지된 약물과 담체를 주사함으로서 조직내 분포를 확인하였다.

MTX-FITC와 MTX-FITC를 담지한 LDH를 증류수에 분산 혹은 용해시킨 용액과 증류수를 실시예 4에서 사용한 종양모델을 갖는 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.

주사 후 72시간이 지난 뒤 쥐로부터 종양, 신장, 간 등의 주요 조직을 적출하여 형광 현미경 관찰을 하였고, 이를 통하여 주요 조직 내 형광의 분포 (각 시료의 분표 양상)을 관찰하였으며 그 결과가 도 4에 나타나있다. 실험 결과, 형광이 표지된 약물인 MTX-FITC이 투여된 경우 어느 조직에서도 형광이 검출되지 않았으며, MTX-FITC를 담지한 LDH 시료의 경우 종양 조직에서 강한 형광의 축적을 관찰 할 수 있었다. 이를 통하여 볼 때 LDH 나노담체는 순수한 MTX에 비해 그 체류시간을 증대시키며 또한 체내를 순환하면서 일부 신장의 모세 혈관에 걸릴 수도 있으나, 대부분 최종적으로 신장을 통하여 빠져나감을 예상할 수 있다. 또한 MTX-FITC를 담지한 LDH의 실험 결과로 볼 때 LDH 나노 담체는 체내를 순환하다가 느슨한 암조직의 혈액 침투망을 선택적으로 투과하여 항암제를 종양 조직에 약물을 전달한 후 배출됨을 알 수 있다.

본 발명에 따르면, LDH는 그 크기를 조절하여 항암제를 암조직에 선택적으로 전달하여 항암제의 짧은 체류시간에 의한 효율저하를 극복하며 동시에 낮은 분자량을 갖는 MTX의 높은 생체내 분산성으로 인한 전신침투를 방지하여 부작용을 최소화하면서 동시에 체내 체류시간의 상승을 가져와서 약물의 효과를 극대화시켜 용량감소에도 불구하고 순수한 MTX에 비해 크기가 조절된 LDH에 혼성화시킬 경우 종양을 단시간 내에 치료할 수 있음이 확인되었다.

Claims

항암제 단독으로 투여될 경우보다 체내체류시간의 상승과 암세포에만 전달하여 부작용 없이 효과적으로 암을 치료하는 타겟팅 기능을 갖는 LDH와 항암제의 혼성체 및 그 합성 방법과 이를 이용한 암치료 방법
제1항에 있어서, 암종이 골육종인 암치료 방법
제1항에 있어서, 항암제/LDH 혼성체를 수열반응에 의하여 50-450 nm로 균일하게 제조하는 방법
제1항에 있어서, 항암제가 MTX인 암치료 방법