KR20080113473A - 암세포 특이적 리간드가 부착된 하이브리드 약물 전달체,그 제조방법, 및 그것을 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물 및 유전자 전달에 사용될 수 있는 금속 이중층 수산화물의 표면에 암세포 특이적 리간드를 그래프트 방법으로 표지하여 암세포에 대한 표적 지향성을 갖는 하이브리드형 약물 전달체, 그 제조방법 및 그 하이브리드형 약물 전달체를 포함하는 항암 치료에 이용될 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.

표적 지향성 약물 전달체, 금속 이중층 수산화물, 암세포 특이적 리간드

Description

암세포 특이적 리간드가 부착된 하이브리드 약물 전달체, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 약학 조성물{A hybrid drug delivery carrier labeled with cancer cell specific ligand, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition comprising the same}

도 1은 암세포 표적 지향성 리간드에 의한 약물 전달체의 암세포 선택 원리를 나타낸 모식도 이다.

도 2는 약물 전달체인 금속 이중층 수산화물의 표면에 암세포 표적 지향성 리간드를 부착하는 반응의 모식도이다.

도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 각각의 금속 이중층 수산화물 (LDH), 반응 중간체인 금속이중층수산화물-실란 (LDH-silane), 그리고 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA) 나노 물질의 X-선 회절 패턴이다(a: LDH, b: LDH-silane, c: LDH-FA).

도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 각각의 금속 이중층 수산화물 (LDH), 반응 중간체인 금속이중층수산화물-실란 (LDH-silane), 그리고 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA) 나노 물질의 구조 모식도를 나타낸 것이다 (a: LDH, b: LDH-silane, c: LDH-FA).

도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 각각의 금속 이중층 수산화물 (LDH), 반응 중간체인 금속이중층수산화물-실란 (LDH-silane), 그리고 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA) 나노 물질의 적외선 분광분석 스펙트럼이다 (a: LDH, b: LDH-silane, c: LDH-FA).

도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA) 나노 물질의 전계 방사형 주사 전자 현미경 사진이다.

도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 하이브리드형 약물전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트와 금속이중층수산화물의 암세포 지향성의 차이를 보여주는 세포 내포화 비교 결과로서,

도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 각각의 붕소화합물-금속이중층수산화물의 암세포 U-343 세포에 대한 독성 평가 결과를 나타낸 그래프이며,

도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 각각의 붕소화합물-금속이중층수산화물의 암세포 U-87 세포에 대한 독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 항암제를 포함하고 있는 금속이중층수산화물과 금속이중층-수산화물 약물전달체의 암세포 지향성의 차이를 보여는 약물 세포 유입 비교 결과이다.

본 발명은 암세포 표적 지향성 리간드가 부착된 하이브리드 약물 전달체의 제조 및 암세포 선택성 증가 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 금속이중층수산화물과 같은 약물 전달체의 암세포 선택성을 증대시키기 위하여 표면개질 반응을 통하여 얻어지는 하이브리드형 약물 전달체, 그 제조방법, 및 그 하이브리드형 약물 전달체를 포하마는 약학 조성물에 관한 것이다.

최근의 항암 요법은 1 세대의 화학 치료 요법의 문제점이 드러남에 따라 새로운 치료요법이나 화학 요법의 단점 극복에 관한 연구 개발을 필요로 하고 있다. 1 세대 화학 치료 요법의 가장 큰 문제점은 화합물의 생체 내 안정성과 세포막 투과 효율이 낮아서 많은 양의 약물 투여가 불가피하다는 점과 일단 안정성과 세포막 투과율이 높아지더라도 암세포와 정상세포를 구별하지 않은 무차별적인 세포 사멸 기작 때문에 정상 조직에까지 잠재적 독성을 나타내는 점의 두가지로 요약될 수 있다. 최초의 약물 전달 시스템 연구는 약물의 체내 불안정성을 줄이고 세포막 투과효율을 높이기 위하여 약물을 제형화하여 투여하는 것으로부터 시작하였으며, 최근에는 나노기술의 발전과 함께 나노 크기의 캡슐에 약물을 담지함으로서 원하는 물성의 증가를 유도하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 금속이중층수산화물(Layered Double Hydroxide: LDH)과 같은 무기 나노입자는 하이드로탈사이트(hydrotalcite) 유사 화합물이라고도 불리며, 층상형 물질인 수산화 마그네슘 (brucite)의 일부 2가 마그네슘 양이온이 3가의 알루미늄 이온으로 동형치환되어 있는 하이드로탈사이트와 유사한 구조를 가진 화합물을 말한다. 이 때의 2가와 3가 양이온은 마그네슘과 알루미늄 외에도 아연 (Zn^{2 +}), 철 (Fe^{2 +} 또 는 Fe3+), 니켈 (Ni^{2 +}), 코발트 (Co^{3 +}), 망간 (Mn^{2 +})등의 다양한 금속 이온으로 구성될 수 있으며, 2가 양이온이 일부 3가 양이온으로 치환되면서 층 자체가 양전하로 하전되게 되므로, 음이온이 층간에 전하를 보상하기 위하여 존재할 수 있다. 층간에 존재하는 음이온은 수산화 금속의 무기물 층에 의하여 물리적으로 보호받을 수 있을 뿐 아니라, 양이온성인 층과 정전기적 인력으로 안정화되어 있기 때문에 화학적인 안정성을 획득하게 된다. 특히, 음이온 성질을 갖는 약물 이온이나 유전자 등을 금속이중층수산화물의 층간에 도입하면 안정성은 물론이고, 세포막 투과 효율까지 증대시킬 수 있다. 문헌에 나타난 바에 의하면 (Oh, J.-M et al., Bioconjug. Chem. (2006) 17: 1411-1417) 메토트렉세이트와 같은 음이온성 항암제를 포함하고 있는 금속이중층수산화물은 클라쓰린 매개 내포화 (clathrin-mediated endocytosis)라는 선택적인 세포 내재화 메카니즘에 의해 쉽게 세포 내로 진입할 수 있다. 이러한 안정성과 세포막 투과 효율 때문에 금속이중층수산화물의 약물 전달체로서의 가능성이 이미 보고된 바 있다 (USP 6,329,515 B1).

약물전달체에 의하여 약물의 안정성이 향상되고 세포막 투과 효율이 높아져서 항암 효과가 높아지더라도 여전히 약물이 정상세포와 암세포의 구분 없이 무차별적으로 세포 사멸을 유도할 수 있다는 문제점은 여전히 남아 있다. 약물 자체가 혹은 약물전달체가 암세포를 선택적으로 구분할 수 있다면 정상세포로 유입되는 약물의 양을 최소화시켜 약물의 독성을 최소화할 수 있으며, 체내로 투여된 약물의 이용율을 극대화시킬 수 있을 것이다.

엽산 (폴릭산: folic acid (FA))는 세포 내에서 유전자를 생산하는 메카니즘인 폴레이트 회로 (folate cycle)에서 중요한 역할을 하는 영양분으로서 특히 세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포는 빠른 세포 분화를 위하여 많은 양의 폴릭산 (혹은 폴레이트)를 필요로 하며, 이를 위하여 세포막에 폴레이트 수용기 (folate receptor)를 과발현하여 대량의 폴릭산을 섭취하려는 경향이 있다. 특히 KB 세포와 같은 일부 유방암 세포에서는 정상 세포에 비하여 폴레이트 수용기가 과발현되어 있어, 폴레이트는 이들 암세포를 인지하는 일종의 리간드 (ligand) 역할을 할 수 있다. 암세포를 인지하는 리간드는 폴레이트와 같은 화학 물질 외에도 항체 (antibody), 압타머 (aptamer)등이 있을 수 있으나 면역 부작용이 없고, 비교적 싼 가격으로 접근할 수 있다는 점에서 폴레이트는 리간드로서의 이점이 크다.

따라서 최근 몇몇 연구에서는 폴레이트를 리간드로 사용하여 약물전달체의 암세포 친화력을 높이려는 노력을 보이고 있다. 특히 리포좀과 같은 약물전달체의 표면에 리간드를 부착하려는 연구 (Gabizon, A. et al., Adv. Drug Delivery Rev. (2004) 56:1177-1192) 라던지 PEG-DSPE (polyethyelenglycol-disterarolyl phosphatidylethanolamine) 과 같은 고분자형 약물전달체의 말단에 리간드를 부착하여 담지된 DNA의 감염효율을 높이려는 연구 (Hattori, Y. et al., J. Contorlled Rel., (2004) 97:173-183) 혹은 pNIPAM (poly(N-isopropylacrylamide)) 과 같은 하이드로젤 형태의 약물 전달체에 폴레이트를 부착하여 세포 타겟팅 하려는 연구 (Nayak, S. et al., J. Am. Chem. Soc., (2004) 126:10258-10259) 등이 대표적인 예이다.

금속이중층수산화물 약물 전달체는 상기에서 기술한 리포좀, 고분자, 하이드로젤에 비교하더라도 약물 안정성이나 약물 방출 조절, 혹은 체내 안전성 등에서 우수한 물성을 갖고 있는 것으로 알려져 있으나 (Oh, J.-M. et al., J. Phys. Chem. Solids, (2006) 67: 1024-1027), 금속이중층수산화물을 약물전달체로 사용함에 있어서 암세포 지향성 리간드를 부착하여 암세포 선택성 증가나 잠재 독성 감소 등에 대한 예는 전혀 없다.

이에 본 발명자들은 치료용 약물 및 유전자의 전달체로 이용되는 금속이중층수산화물이 보다 효과적으로 암세포에 작용하고 정상세포에 작용하지 않는 '표적지향성'을 갖도록 하는 방법에 대하여 연구한 결과, 암세포 지향적인 리간드를 금속이중층수산화물의 표면에 표지하면 암세포를 찾아가는 타겟팅 기능이 향상됨을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암세포에 대한 표적 지향성을 갖는 하이브리드형 금속이중층수산화물 약물전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 암세포 타겟팅 기능을 갖는 하이브리드형 금속이중층수산화물 약물전달체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 암세포에 대한 표적 지향성을 갖는 약물전달체를 이용하여 암세포를 타겟팅할 수 있는 항암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암세포 지향성 리간드가 금속이중층수산화물의 표면에 공유결합을 통하여 결합되어 표지된 하이브리드형 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 금속이중층수산화물의 표면을 아민기를 갖는 실란 (silane)으로 표면개질한 후 카복실기를 갖는 리간드를 아민 말단에 공유결합시키는 것을 포함하는, 하이브리드형 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 하이브리드형 약물전달체를 이용하여 암세포를 타겟팅할 수 있는 항암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명이 제공하는 신규한 하이브리드형 약물전달체는 암세포 지향성 리간드 물질이 금속이중층수산화물의 표면에 공유결합을 통하여 단단히 결합되어 있으며, 이에 따라 약물전달체가 암세포 표적지향성을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 하이브리드형 약물전달체를 구성하는 금속이중층수산화물은 하나 이상의 2 가 금속 및 하나 이상의 3가 금속을 포함하며, 상기 2 가 금속은 마그네슘(Mg²⁺), 칼슘(Ca²⁺), 아연(Zn²⁺), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 상기 3가 금속은 알루미늄(Al³⁺), 철(Fe³⁺), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 약물전달체 제조에 특별한 제 한이 있거나 인체에 독성이 없는 것이라면 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 금속이중층수산화물이 이용될 수 있다.

상기 하이브리드형 약물전달체를 구성하는 암세포 지향성 리간드로는 금속이중층수산화물에 표지된 아미노실란의 아민 말단과 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 카복실 기를 갖는 물질로서 암세포 지향성을 갖고 있다면 임의의 리간드 물질이 이용될 수 있다. 또한, 붕소 중성자 포획 치료에 효과적으로 이용될 수 있기 위해서는 분자당 붕소의 함량이 높은 붕소 화합물을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 리간드 물질로 바람직하게는 암세포에 과발현된 폴레이트 수용기에 선택적으로 감응하면서 카복실 말단을 갖고 있는 폴릭산 (folic acid)이 대표적으로 이용될 수 있다.

본 발명이 제공하는 신규한 하이브리드형 약물전달체에 사용되는 금속이중층 수산화물은 입도가 100 내지 300 nm 인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 100 내지 200 nm 이다. 이는 하이브리드형 약물전달체가 폴레이트 수용기에 선택적으로 감응한 뒤 효과적으로 세포에 내포화되도록 하며, 향후 생체 내에 투여할 시, 모세혈관이 막히지 않고, 세포에 물리적 충격을 가하지 않게 하기 위한 것이다. 본 발명의 하이브리드형 약물전달체가 너무 작아 50 nm에도 미치지 못할 경우에는 세포에 대량 유입되어 물리적 충격을 줄 수도 있다.

상기 본 발명이 제공하는 신규한 하이브리드형 약물전달체의 금속이중층수산화물 부분은 2가 금속염 및 3가 금속염의 수용액으로 pH 8 ~ 10 으로 적정하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 염기 용액은 수산화나트륨 또는 암모니아의 수용액이 이용될 수 있으며, 이러한 염기 용액은 0.1 ~ 0.2 M로 맞추는 것이 바람직하다. 염기 용액의 농도가 너무 진하면 금속이중층수산화물의 침전시 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있으며, 염기 용액이 묽으면 효과적인 금속이중층수산화물의 침전 형성이 힘들 수 있기 때문이다.

상기 2가 금속염은 상기 제조하고자 하는 혼성체를 구성하는 금속 이중층 수산화물을 구성하는 2 가 금속염을 이용하며, 바람직하게는 질산 아연, 염화 아연, 질산 마그네슘, 염화 마그네슘 등이 이용될 수 있다. 상기 3가 금속염 또한 상기 제조하고자 하는 혼성체를 구성하는 금속 이중층 수산화물을 구성하는 3 가 금속염을 이용하며, 바람직하게는 질산 알루미늄, 염화 알루미늄 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

상기 하이브리드형 약물전달체의 금속이중층수산화물 부분을 암세포 표적 지향성 리간드로 표지하기 위하여 우선 금속이중층수산화물의 표면에 아미노실란을 그래프트 방법으로 결합시킨 후 말단에 드러나 있는 아미노기와 리간드의 카복실기 사이에 탈수축합 반응으로 펩티드 결합을 형성하여 금속이중층수산화물과 리간드를 공유결합으로 연결한다.

상기 본 발명이 제공하는 하이브리드형 약물전달체는 기존 금속이중층수산화물만을 약물전달체로 이용하는 경우보다 암세포에 대한 선택성이 현저히 향상되기 때문에 항암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 본 발명의 하이브리드형 약물전달체 내에 항암제를 담지하는 항암 치료용 약학 조성물 을 제공한다.

상기 본 발명이 제공하는 하이브리드형 약물전달체의 암세포 선택성이 작용하는 방식을 도 1에 모식적으로 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 금속이중층수산화물 표면에 공유결합으로 표지된 리간드가 암세포의 세포막에 과발현된 폴레이트 수용체를 인지하여 암세포에 많은 양이 유입될 수 있도록 유도해 준다. 본 발명이 제공하는 하이브리드형 약물전달체가 이와 같이 암세포에 대한 선택성이 높다는 것은 하기 실시예에서 암세포에 대한 세포 투과 실험에 의해 확인되었다.

상기 본 발명의 하이브리드형 약물전달체는 금속이중층수산화물의 내부공간이 양이온성이기 때문에 종래에 알려져 있는 음이온성 항암제를 담지하여 종양의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 하이브리드형 약물전달체는 부착된 리간드가 인지할 수 있는 수용체를 갖는 모든 종류의 악성 종양의 치료에 효과가 있으며, 대표적으로 폴레이트 리간드가 부착된 경우 폴레이트 수용체가 과발현된 KB 세포 (구강암) 등의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 하이브리드형 약물전달체는 금속이중층수산화물의 표면만을 리간드로 표지함으로서 입도나 입형등 약물전달체의 물리적 성질은 변화하지 않으며, 또한 표지되는 리간드의 질량비도 전체의 5 wt% 미만이므로 약물의 담지 용량 또한 기존의 금속이중층수산화물에 비하여 크게 줄어들지 않지만, 암세포 선택성에 의하여 적은 양의 투여로도 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 약물전달체를 이용하지 않는 항암제 자체에 비해서는 물론이고, 금속이중층수산화물과 같은 약물전달체를 이용하는 경우에 비해서도 적은 투여량으로 치료에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하지만, 하기 실시예는 예시적인 것에 지나지 않으며, 결코 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서는 폴레이트 리간드가 표면에 공유결합된 금속이중층수산화물 하이브리드 약물전달체를 본 발명의 일 구현예에 따라 제조하고, 그 물리화학적 구조 분석을 위해 X-선을 이용한 회절분석과 적외선 분광분석을 실시하였으며 주사 전자현미경을 통해 하이브리드형 약물전달체의 입형 및 입도를 분석하였다.

모든 세포 실험은 폴레이트 수용체가 과발현된 세포인 구강암 KB 세포주와 폴레이트 수용체가 최소발현된 세포인 A549 세포에서 이루어졌으며, 세포 내포화 효율은 하이브리드형 약물전달체에 형광을 표지하여 확인하였으며, 또한 하이브리드형 약물전달체 내부에 약물을 담지하여, 그 약물의 세포 내포와 양을 측정함으로서 확인하였다. 세포 내로 유입되는 약물전달체의 양과 그에 의하여 세포 내로 전달되는 약물의 농도는 화학 치료 효율과 비례하기 때문에 세포 투과 정도가 높을수록 우수한 치료제라고 할 수 있다.

실시예 1

금속이중층수산화물 나노 혼성체를 다음과 같이 합성하였다. 마그네슘(II)과 알루미륨(III)의 비가 2:1이 되도록 질산마그네슘과 질산알루미늄 염의 혼합 수용액에 탄산나트륨 수용액을 첨가한 후, pH 9.5가 될 때까지 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 30분~1시간 정도의 시간동안 천천히 적정하였으며 5분간 격렬히 교반하여 반응시킨 뒤 흰색의 침전물을 얻고, 이를 증류수로 세척하고 원심분리 시켜 금속이중층수산화물을 합성하였다. 합성한 금속 이중층 수산화물의 X선 회절 분석 결과는 도 3의 (a)에 나타내었다.

반응 중간체인 금속이중층수산화물-실란(LDH-silane)을 합성하기 위해, 상기 제조된 분말 상태의 금속이중층수산화물(LDH)을 에탄올에 12시간 동안 교반하여 분말의 표면을 에탄올로 처리한다. 에탄올의 처리가 끝난 뒤 반응물을 3회 에탄올로 수세하여 원심분리 시켜 건조하여 금속이중층수산화물의 표면이 에탄올로 완전히 치환된 금속 이중층 수산화물을 얻는다. 이 분말 상태의 에탄올 치환된 금속이중층수산화물을 진공상태, 90 ℃에서 5시간동안 스터링해서 금속이중층수산화물의 표면이나 층간에 남아 있을 수 있는 물분자를 증발시킨다. 그 뒤, 반응기를 질소로 충진하여 대기의 접촉을 차단한 상태에서 유기용매 (톨루엔이나 메틸렌 클로라이드 등이 사용 가능)을 첨가하여, 90 ℃에서 12시간 동안 교반하여 용매에 분산시킨다. 그 후에, 아미노실란 (아미노 프로필 실란)을 분산액에 천천히 가하여준 뒤 90 ℃에서 다시 24시간동안 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응에 사용된 유기용매로 3회에 걸쳐 세척하고 동결건조하였다. 건조 후 얻어진 반응 중간체인 금속이중층수산화물-실란(LDH-silanen)에 대한 X-선 회절분석 패턴과 적외선 분광분석 결과는 도 3a와 도4에 도시하였다.

하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA)를 합성하기 위해, 우선 상기 제조된 중간체인 금속이중층수산화물-실란 (LDH-silane) 을 증류수에 분산시킨다. 반응 촉매제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미 드 (EDC), N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 트리에틸아민 (ET₃N) 을 각각 물에 용해시키고, 리간드 물질인 폴릭산 (폴레이트)은 디메틸술폭사이드 (DMSO) 에 용해시킨다. 금속이중층수산화물-실란 분산액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 수용액과 N-하이드록시숙신이미드 수용액을 천천히 첨가한다. 그 뒤 폴레이트/디메틸술폭사이드 용액을 첨가한다. 마지막으로 트리에틸아민 수용액을 사용하여 pH를 9로 적정한다. 반응물은 38 ℃에서 5시간동안 반응시킨 뒤, 디메틸술폭시드로 2회 이상, 증류수로 2회 이상 세척한 뒤, 동결 건조하였다. 건조 후 얻어진 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물-폴레이트 (LDH-FA)에 대한 X-선 회절 분석과 적외선 분광분석 스팩트럼 결과는 도 3(a) 과 도 4에 나타내었으며, 입형과 입도를 보여주는 전계 방사형 주사 전자 현미경 사진은 도 5에서 도시하였다. 상기의 표면 반응은 도 2의 모식도에서 나타나는 것처럼 1차적으로 금속이중층수산화물의 표면의 M(금속)-OH 결합이 M-O-Si-silane-amine 결합으로 개질되고, 2차적으로 말단의 아민과 리간드의 카복실기가 반응하여 M-O-Si-silane-petide bond-ligand의 결합이 생성된다.

도 3의 도 4의 X-선 회절 패턴과 적외선 분광 분석 결과를 비교해 보면 하이브리드형 약물전달체의 합성과정 중 구조는 일정하게 유지되며 표면만 실란과 폴레이트로 표지되었음을 알 수 있다.

실시예 2

상기 실시예 1에서 제조된 하이브리드형 약물 전달체인 금속이중층수산화물- 폴레이트 (LDH-FA)의 세포 내포화를 측정하기 위하여 형광체인 5'-플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC) 를 부착하였다. 상기 제조된 금속이중층수산화물-폴레이트를 증류수에 분산시킨다. 실시예 1의 폴레이트 부착과정과 마찬가지로 촉매제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드와 N-하이드록시숙신이미드를 사용하되, 5'-플루오레신이소티오시아네이트는 에탄올에 용해시킨 것을 사용한다. 실시예 1에서와 마찬가지로 혼합하여 38 ℃에서 5시간동안 반응시킨 뒤 세척하여 건조시켰다. 이 반응에서는 실란의 아민 말단 중 일부에는 폴레이트를 결합시키고, 남은 아민 자리에 5'-플루오레신이소티오시아네이트의 카복실 기를 부착하는 반응을 이용하였다. 또한 리간드의 부착에 의한 효과를 비교하기 위하여 폴레이트 없이 형광체만 부착된 금속이중층수산화물-형광체도 같은 방법으로 제조되었다.

실시예 3

하이브리드형 약물전달체 내에 항암 약물을 담지하는 것은 우선 금속이중층수산화물의 내부에 약물을 담지한 후 표면에 리간드를 부착하는 방법으로 달성될 수 있다. 약물의 담지는 공침방법이나 이온교환 방법을 통하여 이루어질 수 있는데, 다음과 같은 이온 교환 반응이 사용될 수 있다.

마그네슘(II)과 알루미늄(III)의 비가 2:1이 되도록 질산마그네슘과 질산알루미늄을 혼합한 용액에 0.1 M 수산화나트륨 용액을 적가하여 pH를 ~ 9에 맞춤으로서 공침 침전물을 얻고, 이를 증류수로 세척하고 원심분리시켜 층간에 질산 음이온이 도입된 금속이중층수산화물을 합성하였다. 항암제 (MTX)를 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 용해시킨 후, 상기에서 얻어진 질산이온-금속이중층수산화물을 물에 분산 한 현탁액 (1 mg/1 ml H₂O)에 첨가한다. 그 뒤 60 ℃에서 48시간 반응시킨 후 증류수로 3회 이상 세척하고 원심 분리후 동결건조한다.

이렇게 마련된 항암제-금속이중층수산화물은 실시예 1에서 기술한 바와 마찬가지로 에탄올 치환과정과 실란, 폴레이트 그래프트 반응을 거쳐서 리간드가 부착된 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트의 하이브리드형 약물 전달 시스템으로 제조되었다.

실시예 4

상기 실시예 2에서와 같이 금속이중층수산화물과 금속이중층수산화물-폴레이트를 형광물질로 표지하여 세포 투과 실험을 하였다. 구강암 세포인 KB는 폴레이트 수용체가 과발현 된 세포로 이의 최대 발현을 유도하기 위하여 폴레이트가 없는 배양액에서 최소 2주 이상 37℃ CO₂ 배양기에서 배양 후 사용하였다. 폐암 세포인 A549는 폴레이트 수용기가 최소 발현되어 있는 세포로 이의 발현을 최대로 억제하기 위하여 2.5 μM의 폴릭산을 첨가한 배양액에서 최소 2주 이상 배양하였다.

KB와 A549 세포를 각각 5 x 10⁵/2ml로 분주하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양한 뒤 실시예 1에서 제조된 형광물질이 표지된 금속이중층수산화물과 금속이중층수산화물-폴레이트를 50, 100, 200 μg/ml의 농도로 처리하여 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 남아있는 나노물질을 제거하기 위하여 PBS 완충액으로 씻어낸 후 유체 세포측정법 (flow cytometry)을 이용하여 10000개 세포에서의 형광 세기를 측정함으로써 세포내 금속이중층 수산화물 투과량을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었으며, 도 6a는 폴레이트 수용체가 과발현 된 KB 세포에서의 결과이며, 도 6b는 폴레이트 수용체가 최소 발현된 A549 세포에서의 결과이다.

세포 투과 농도 분석 결과 KB 세포에서 금속이중층 수산화물을 처리한 경우보다 금속이중층 수산화물-폴레이트를 처리한 경우 모든 농도에서 세포 내 투과 농도가 약 2배에서 3배까지 높았으며, 50 μg/ml의 농도에서 약 3배의 최대 투과 농도차이를 보이는 것으로 나타났다. 한편, A549 세포에서는 금속이중층 수산화물을 처리한 경우와 금속이중층 수산화물-FA를 처리한 경우가 모두 세포 투과 농도에 있어서 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다. 이로써 금속이중층 수산화물-폴레이트가 폴레이트 수용체가 과발현 된 세포에서 폴레이트 수용체를 통하여 세포 내로 투과되며, 따라서 금속이중층 수산화물을 사용한 경우보다 많은 양이 선택적으로 세포 내로 들어갈 수 있음을 알 수 있다. 이 결과는 금속이중층 수산화물-폴레이트가 암세포 선택적 약물전달 매개체로서 역할을 할 수 있음을 제시한다.

실시예 5

상기 실시예 3에서 제조된 항암제-금속이중층수산화물과 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트 약물 전달 시스템에 대한 항암제 세포 투과 실험을 실시하였다. 실시예 4에서와 같이 폴레이트 수용체가 과발현된 KB 세포를 폴레이트가 없는 배양액에서, 폴레이트 수용체가 최소로 발현된 A549 세포를 2.5 μM 폴레이트가 첨가된 배양액에서 37℃ CO₂ 배양기에서 2주간 배양하여 본 실험에 사용하였다.

KB와 A549 세포를 각각 1 x 10⁶/4ml로 분주하여 37℃ CO₂ 배양기에서 배양한 뒤 실시예 3에서 제조된 항암제-금속이중층수산화물과 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트를 항암제의 농도가 25 μg/mL가 되도록 세포에 처리하여 1시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 남아있는 나노 혼성체를 제거하기 위하여 PBS 완충액으로 씻어낸 후, 세포 용해 완충액을 넣고 얼음 위에서 30분 동안 반응 시킨 후 초음파로 20초 처리 하였다. 원심분리하여 상등액만 취한 후 상등액 부피 2배의 아세토니트릴 (acetonitrile)을 첨가하여 골고루 섞어 단백질을 침전시켰다. 이것을 다시 원심분리 후 상등액 부피 4배의 클로로포름 (chloroform)을 첨가하여 지방을 제거하였다. 최종적으로 원심분리하여 상등액만 취한 후 항암제 함량을 고효율액체크로마토그램 (HPLC) 를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 C18 컬럼 (250 x 4.6 mm)과 0.05 M KH₂PO₄, 10% 아세토니트릴, pH 6.6을 이동상으로 사용하였고, 유속은 1 ml/min, 주입 부피를 30 μl로 하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었으며, 도 7a는 폴레이트 수용체가 과발현 된 KB 세포에서의 결과이며, 도 7b는 폴레이트 수용체가 최소 발현된 A549 세포에서의 결과이다.

항암제의 세포 내 투과 농도 분석결과 KB 세포에서 항암제-금속이중층수산화물을 처리한 경우보다 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트를 처리한 경우 세포 내 항암제의 농도가 약 1.5배 증가하였다. 이 결과는 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트가 폴레이트 수용체가 과발현 되어있는 KB 세포에서 폴레이트 수용체를 통하여 세포 내로 투과하므로 더 많은 양의 항암제를 세포 내로 전달할 수 있음을 제시한 다. 한편, 항암제-금속이중층수산화물을 처리한 경우도 상대적으로 고농도의 항암제가 세포 내 정량되었는데, 이는 금속이중층 수산화물 자체의 효율적 세포내 전달 매개체로서의 특성으로부터 기인하는 것으로 보인다. 반면 A549 세포에서는 항암제-금속이중층수사화물과 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트를 각각 처리한 경우 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다. 이 결과는 항암제-금속이중층수산화물-폴레이트가 선택적으로 폴레이트 수용체가 과발현된 암세포만을 인식할 수 있어 표적 지향적 약물 전달이 가능함을 제시한다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 하이브리드형 약물 전달체는 특히 많은 암세포에서 과발현되는 폴레이트 수용체와 같은 특정 수용체를 인식하여 암세포에 대한 선택성이 현저히 향상되어 정상 세포에 대한 세포 독성을 현저히 감소시키면서 약효가 극대화 될 수 있으므로 항암 화학 요법에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 암세포 특이적 리간드가 금속이중층수산화물의 표면에 공유결합을 통하여 강하게 부착되어 있는 하이브리드형 약물전달체.
2. 제1항에 있어서, 상기 금속이중층수산화물을 구성하는 2 가의 금속은 마그네슘(Mg²⁺), 칼슘(Ca²⁺), 아연(Zn²⁺), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 금속 이중층 수산화물을 구성하는 3가의 금속은 알루미늄(Al³⁺), 철(Fe³⁺), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체
3. 제1항에 있어서, 상기 암세포 특이적 리간드는 카복시 말단을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
4. 제3항에 있어서, 상기 암세포 특이적 리간드는 폴레이트 (folate) 또는 폴릭산 (folic acid)인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
5. 제1항에 있어서, 입도가 100 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
6. 금속 이중층 수산화물의 표면에 실란 유도체를 공유결합시키는 단계;

   금속 이중층 수산화물의 표면에 결합된 실란 유도체를 통해 암세포 특이적 리간드를 공유결합시키는 단계를 포함하는,

   제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달체를 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 금속 이중층 수산화물의 표면에 실란 유도체를 공유결합시키는 단계에서 용매로서 톨루엔 또는 메틸렌클로라이드를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달체의 내부에 음이온성 약물을 담지함으로써, 약물의 암세포로의 전달 효율 및 선택성을 증가시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 암세포는 폴레이트가 과발현된 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달체의 내부에 약물이 담지된, 암 치료용 약학 조성물.

Images