CN1152945A - 在恒定的高反应物浓度下制备β-内酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

β-内酰胺衍生物可以通过母体氨基β-内酰胺与相应的酰化剂在恒定的高前述反应物浓度下的酶反应而被方便地合成。

Description

在恒定的高反应物浓度下制备β-内酰胺的方法
本发明涉及改进了的通过母体氨基β-内酰胺与酰化剂的酶促酰化反应来制备β-内酰胺衍生物的方法。
现在，半合成的β-内酰胺衍生物如氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄、Cephadroxil及头孢来星都是以工业规模由化学方法制备的，例如将一种氨基β-内酰胺如6-氨基青霉烷酸(其羧基通常是受到保护的)与一种活性侧链衍生物反应，接着通过水解而除去保护基。例如，氨苄青霉素(6-D-α-氨基苯基乙酰氨基青霉烷酸)可通过将6-APA(它带有合适的受保护羧基)与D-苯基甘氨酰氯反应，接着通过水解而除去保护基来制备。这些反应一般涉及费用大的步骤如零摄氏度以下的反应条件及有机溶剂如二氯甲烷与甲硅烷基化试剂。
近几年来，有关通过酰化剂(它以酸的形式或以活化形式(例如，酰胺或酯))与母体氨基β-内酰胺(例如，6-APA或7-ADCA)而酶法制备青霉素和头孢菌素的可能性的出版物日益增多。例如，用6-APA和D-苯基-甘氨酸衍生物(如低级烷基酯)而酶法生产氨苄青霉素可从公开号为2,163,792的西德专利申请、奥地利专利No.243,986，荷兰专利申请No.70-09138、公开号为2,621,618的西德专利申请、公开号为339,751的欧洲专利申请及公开号为92/01061的PCT专利申请得知。
氨基β-内酰胺与酰化剂的酶促酰化反应可在合适的酰胺酶或酰基转移酶存在下进行，由此生成期望的β-内酰胺衍生物。母体氨基β-内酰胺与该β-内酰胺衍生物有相同的β-内酰胺环。在β-内酰胺衍生物终产物中，青霉烯(penem)母体β-内酰胺的6-NH2侧链或头孢烯(cephem)母体β-内酰胺的7-NH2侧链被酰化。
本反应可由下列反应图解I来阐述：
       反应图解I
酰化剂+氨基β-内酰胺→β-内酰胺衍生物
若该方法是间歇地进行的，业已发现在反应初期，生成的β-内酰胺衍生物的量渐增，而一定时间后，反应混合物中存在的β-内酰胺衍生物的量正在减少。生成的β-内酰胺衍生物的分解可能归因于其水解作用而生成氨基β-内酰胺及酸式酰化剂。此外，存在的酶可能分解起始的酰化剂。因此，在这种反应期间至少发生两种分解反应。
本发明的-个目的是提供一种方法，其中可从反应混合物中回收的β-内酰胺衍生物的量与反应期间生成的酸式酰化剂之间的摩尔比与已知方法中的该比值相比增大了。
现在已令人惊奇地发现，若氨基β-内酰胺的酰促酰化反应是在恒定高浓度的母体氨基β-内酰胺及相应的酰化剂的条件下进行的，则可获得改善了的工艺条件。母体氨基β-内酰胺的浓度及相应的酰化剂的浓度优选都高于70％，优选地高于母体氨基β-内酰胺的饱和浓度及相应的酰化剂的饱和浓度二者的最低值的85％。
本发明的优点尤其是如下：
1)可从反应混合物中回收的β-内酰胺衍生物的量与酸式酰化剂的量之间的摩尔比，与已知方法中的该比值相比提高了。这项改进措施对于该方法的经济性有直接影响，归因于降低了酰化剂对可从反应混合物中回收的β-内酰胺衍生物的消耗。这项改进措施还对于该方法的经济性有间接影响，归因于需要从所需β-内酰胺衍生物中除去的、更低量的酸式酰化剂。
2)β-内酰胺衍生物的产率得以提高。
3)β-内酰胺衍生物的生产量得以提高。该生产量定义为可在单位时间内从单位体积的反应混合物中回收的β-内酰胺衍生物的量。
文中，术语“(母体)氨基β-内酰胺”及“酰化剂”被用于两种起始原料。术语“β-内酰胺衍生物”被用于期望的最终产物。
如前所述，在所述方法中发生不希望有的两种分解反应，这些反应可用下列反应图解II来阐述，图解II还显示了从反应图解I的母体反应：
           反应图解II：
Figure A9519420900061
在反应图解II中，V1是反应：酰化剂+氨基β-内酰胺→β-内酰胺衍生物的反应速率；V2是反应：酰化剂→酸式酰化剂的反应速率；而V3是反应：β-内酰胺衍生物→酸式酰化剂+氨基β-内酰胺的反应速率。
按本发明在恒定的高反应物浓度下实施该方法的一个途径是在一定的时间内保持反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物的生成速率(V1)在一定的范围内。在不少于5小时、优选是不少于10小时内，期望的β-内酰胺衍生物的生成速率优选是偏离同时间内期望的β-内酰胺衍生物的平均生成速率不高于±50％、更优选是不高于±20％、最优选是不高于±10％。
例如，若在20小时内阿莫西林的平均生成速率是2.5μmol/min/ml反应混合物，则该时间内阿莫西林的生成速率优选应在1.3到3.9μmol/min/ml的范围内。
按本发明在恒定的高反应物浓度下实施该方法的另一途径是在一定时间内，将反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率(V1-V3)维持在-定的范围内。在不少于5小时，优选是不少于10小时内，期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率优选是偏离同时间内期望的β-内酰胺衍生物的平均净生成速率不高于±50％，更优选是不高于±20％，最优选是不高于±10％。
按本发明在恒定的高反应物浓度下实施该方法的进一步途径是在一定的时间内，将反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率(V1-V3)与反应混合物中酸式酰化剂的总生成速率(V2+V3)之间的比值维持在一定的范围内。于是，该比值是(V1-V3)/(V2+V3)。在不少于5小时，优选是不少于10小时内，期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率与酸式酰化剂的生成速率之间的比值，优选是偏离同时间内期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率与酸式酰化剂的生成速率之间的平均比值不高于±50％，更优选是不高于±20％，最优选是不高于±10％。
生成的β-内酰胺衍生物可在反应期间沉淀出，且酸式酰化剂如D-苯基甘氨酸和D-对羟基苯基甘氨酸也可沉淀出。因此，某些情况下反应期间的反应混合物将是浆液。
在本发明的方法中，反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物在溶解状态和任意的沉淀状态下的总含量，通常最好维持在低于某一浓度。这样做的一个目的是试图防止反应混合物的粘度变得太高。因此，在实施本发明的在恒定的高反应物浓度下的方法期间，最好是期望的β-内酰胺衍生物在溶解状态和任意的沉淀状态下的总含量都不超过350mM/升反应混合物且优选是不超过250mM/升反应混合物。
本发明的方法可在装有搅拌或混合装置及可保持反应温度在一定范围的装置的反应器中实施。还有，推荐将反应器与可保持pH值在一定范围的装置相连。
在连续实施该方法时，氨基β-内酰胺及酰化剂可以连续地或半连续地加入以保持其在反应混合物中所期望的浓度。所得β-内酰胺衍生物及酸式酰化剂可被连续或半连续地从反应器中移出，例如，通过从反应器中移出部分反应混合物来进行，这部分反应混合物中所得β-内酰胺衍生物及，可能的话，酸式酰化剂例如可用离心法或过滤而移出。从该离心法或过滤法得到的母液可返回到反应器中或用于溶解氨基β-内酰胺或酰化剂。
这里，半连续的实施操作是指所述操作在一定的时间内、例如一小时内或一昼夜内分数次进行。
(母体)氨基β-内酰胺具有一个游离的氨基，它被按本发明的反应酰化。合适的氨基β-内酰胺可以是6-APA，7-ADCA，7-ACA或7-ACCC。
用于本发明的方法中的氨基β-内酰胺，例如6-APA或7-ADCA，可通过发酵青霉素或头孢菌素(例如青霉素V，青霉素G或头孢菌素C)或其环扩大了的类似物(例如V-DCA和G-DCA)或其衍生物的酶促水解而获得，如果需要的话，接着除去水解副产物(苯氧基乙酸等等)。有利的是，粗溶液未经进一步纯化或稀释即可直接使用。
酰化剂可以是活性形式的。酰化剂优选是酰胺或酯。酰化剂可以是D-苯基甘氨酸、D-对羟基苯基甘氨酸、D-2，5-二氢苯基甘氨酸或扁桃酸的衍生物，如低级烷基酯(甲基、乙基、正丙基或异丙基酯)或-CONH2基上未取代的或取代的酰胺。酰化剂可以盐的形式使用，例如盐酸盐或H2SO4盐。酰化剂可以活性形式加入或可以原位生成活性形式。
酰化剂如D-苯基甘氨酸或D-对羟基苯基甘氨酸衍生物的溶解度随衍生物的本性及反应介质的成分而变化。在如实施例中用到的水溶液体系中，D-苯基甘氨酰胺的盐酸盐的溶解度一般约为450mM。但是，该溶解度非常依赖于溶液中的盐成分，以及依赖于pH值和溶液的温度。另外，例如D-苯基甘氨酰胺的硫酸盐的溶解度在2.5至6.5的pH范围内约为3.3M。
如上述解释所示，酰化剂及β-内酰胺衍生物可被分解，还生成酸式酰化剂。酸式酰化剂是对应于所述酰化剂的母体羧酸。
可按本发明的方法制备的β-内酰胺衍生物的实例有氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄、cephadroxil、头孢拉定、依比西林及头孢孟多。
本发明的方法中用到的酶可以是催化所述反应的任意酶。这类酶自以约1961年以来就为人所知。将要使用的酶例如被称为青霉素酰胺酶或青霉素酰基转移酶且归类为E.C.3.5.1.1l。已知一些微生物酶具有这种活性，例如这些酶得自醋酸杆菌属(Acetobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、支动杆菌属(Mycoplana)、精蛋白杆菌属(Protaminobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)(公开号为2,163,792的西德专利申请)，假单胞菌属(Pseudomonas)(奥地利专利No.243986)，黄杆菌属(Flavobacterium)(荷兰专利申请No.70-09138)，Aphanocladium、头孢菌属(Cephalosporium)(公开号为2,621,618的西德专利申请)，巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianum)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citrii)(公开号为339,751的欧洲专利申请)，Kluyvera citrophila(Agr.Biol.Chem.37(1973).2797-2804)及大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(公开号为2,930,794的西德专利申请)。大肠埃希氏菌酶可商购。该酶也可以是所谓的氨苄青霉素水解酶、酰基转移酶或酰胺酶。在这一点上，还可参照Hakko to Kogyo 38(1980)，216以及下列等等，其内容并入此文作参考。
优选使用可重复使用形式的酶，例如以包埋或固定化的形式。可用任何已知方法实现固定化作用。固定化的大肠埃希氏菌酶可从德国的Boehringer Mannheim GmbH商购，其商品名为Enzygel；也可从Recordati商购，其商品名为Super Enzymer。优选是将固定于由凝胶化多糖和含自由氨基的聚合物组成的载体上的青霉素G酰基转移酶用作酶。
本发明的方法通常在含水的体系中实施。如果需要的话，可加入有机溶剂。
通常地，本发明的方法中的反应温度可在0到35℃之间变动，特别是在10到30℃之间。优选20到30℃范围内的温度以便于操作。
适宜的pH值尤其依赖于所用酶的类别。若使用大肠埃希氏菌酶，pH值一般是在5到8的范围内，优选是在6.1到7的范围内。制备阿莫西林时，优选的pH值范围是5.5到6.4。可采用对pH值的控制。
适宜的反应时间在5小时以上。反应时间可以是数天或数周。
适宜的酶浓度可从1到100U/ml(1U＝一个酶活性单位，参见如下)。
在开始操作之前，反应器中可填装所需量的各组分。
利用按本发明的方法，可以得到可回收的β-内酰胺衍生物的量与酸式酰化剂的总量间的特别高的摩尔比。这些高比值是通过利用本发明所述方法并恰当地选择酰化剂的浓度、酰化剂与起始的氨基β-内酰胺的浓度比、pH值及酶而获得的。于是，在下述实施例1中利用按本发明的方法获得了2.4的比值。在对照的间歇式方法中，(参见下述实施例1)，只获得1.4的比值。此外，该实施例中所得分离后产物的产率分别为90和85％。
产物的纯化可按已知的方法例如结晶来实现。
文中用到下列缩写词：7-ACA是7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid)，7-ACCC是7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸盐，7-ADCA是7-氨基去乙酸基头孢烷酸，6-APA是指6-氨基青霉烷酸，D-HPG是D-对羟基苯基甘氨酸，D-PG是D-苯基甘氨酸，D-PGA是D-苯基甘氨酰胺，D-PGM是D-苯基甘氨酸甲酯，D-HPGM是D-对羟基苯基甘氨酸甲酯，G-DCA是7-苯基乙酰氨基去乙酸基头孢烷酸，D-HPGA是D-对羟基苯基甘氨酰胺，而V-DCA是7-苯氧基乙酰氨基去乙酸基头孢烷酸。
文中所述的任何新的特点或特点的组合对本发明都有重要意义。
本发明通过下列实施例而得以进一步阐述，但是，不能认为限于这些实施例。酶：
按WO申请012782分离的、固定于根据欧洲专利22642由凝胶化多糖与含自由氨基的聚合物构成的载体上的青霉素G酰基转移酶被用作酶。
作为青霉素G酰基转移酶活性的定义要用到：一个单位(U)等于在标准条件(100g.l-1的青霉素G的钾盐，0.05M磷酸钾缓冲溶液，pH值为8.0，28℃)下每分钟水解1μmol青霉素G的酶量。HPLC法分析氨苄青霉素和头孢氨苄：柱：RP LC-18，(250×4.6mm；5μm)洗脱液A：25mM磷酸盐缓冲溶液，pH值为6.5洗脱液B：乙腈梯度：时间，分钟    洗脱液B，％
  0→10           1→20
 10→20           20流速：1ml/min。   检测：215nm。按分钟计的保留时间：4.1(D-PG)；6.3(7-ADCA)；8.1(6-APA)；9.1(D-PGA)；13.4(头孢氨苄)；13.9(氨苄青霉素)；18(D-PGM)。HPLC法分析阿莫西林柱：Chromspher C18，5μm(100×3.0mm)溶剂：溶于12mM磷酸盐缓冲溶液的25％乙腈+0.2％的十二烷基硫酸钠，pH值：2.6。流速：1ml/min。在214nm处UV检测。
按分钟计的保留时间：1.9(D-对羟基苯基甘氨酸)；7.3(D-HPGM)；3.1(D-HPGA)；3.4(6-APA)；4.8(阿莫西林)。
          实施例1
从D-HPGM和6-APA酶法制备阿莫西林
用于本实验的装置(参见图1)由容积为1.5升的恒温反应器构成，其上装有一个三叶式高速搅拌机及一层筛孔大小为180μm(开口面积约为32％)的筛。将反应器连接到一套用4M的硫酸作滴定剂的自动滴定器系统。在反应器出口管上安置一个阀。阀的出口通过泵与装配有密度为1-5μm的聚丙烯袋的篮式离心机相连。离心机的出口通过泵与装有搅拌器和玻璃烧结底的供应槽相连。供应槽的出口通过泵与反应器相连。
将由D-HPGM(36.2g，200mmol)和6-APA(43.2g，200mmo1)溶于800ml水后构成的混合液加入到底阀关闭了的反应器中。开始搅拌。将补充至200ml的固定化青霉素G酰基转移酶(26250U，大小为200-500μm)加入反应器中。将pH值保持在6.1。反应温度约为20℃。在这些条件下，反应混合物几乎被D-HPGM和6-APA饱和。然后打开底阀，使反应混合物从反应器进入离心机中。此后，将得自离心机的母液泵入装有D-HPGM(21.7g，120mmol)和6-APA(20.0g，92.5mmol)的供应槽中。将供应槽中悬浮液的总体积控制在75ml。维持体系的流速约为100ml/min。反应器中、反应器出口管中、离心机出口管中、供应槽中及供应槽出口管中的反应组分的浓度由分析用HPLC监测。
随着反应的进行，生成的阿莫西林及D-HPG开始从溶液中沉淀析出。通过反应器中的底筛将晶体从固定化酶颗粒中分离出来，而晶体悬浮液被送入离心机中，此处晶体从母液中分离。现在欠饱和有D-HPGM及6-APA的母液流经供应槽时，存在的一些固体D-HPGA及6-APA溶解，于是供应槽的出口管中含饱和的D-HPGM及6-APA。当D-HPGM与6-APA的总浓度降至约225mM HPGM和225mM6-APA时，往供应槽中加入更多的固态底物。不时地用水洗涤离心机中的晶体，将洗液加入反应器中。所用水量足以保持反应器中的体积在其起始水平。离心机中的晶体被洗涤后，将离心机放空。
约12小时后，停止投配D-HPGM及6-APA。14小时后，6-APA的浓度达到20mM，此时停止反应。反应组分的量列于下述表1。
                         表1.
加入的底物 最后的晶块 最后的溶液中
D-HPGM 606.5g(3351mmol) 2.0g(11mmol) 10.9g(60mmol)
6-APA  523.4g(2423mmol) 9.0g(42mmol) 4.3g(20mmol)
阿莫西林·3H2O  0 909.6g(2171mmol) 8.4g(20mmol)
D-HPG  0 123.7g(741mmol) 30.0g(180mmol)
基于上述结果，可计算出下列产率：
阿莫西林产率(分离出的产物，基于加入的6～APA)：90％。
阿莫西林生产能力：156mmol/小时/升。
下文中，将生成的β-内酰胺衍生物的量与生成的酸式酰化剂的量之间的摩尔比定义为R。本实施例中R＝2.4。
在间歇的条件下进行对比实验，在获得最佳阿莫西林产率时(2小时)停止反应。利用本实施例之前所述的反应条件，即反应温度约为20℃，pH值约为6.1及26250单位的酶。反应混合物的总体积是1升。反应在前面提到的反应器中进行。2小时后打开底阀，通过反应器中的底筛将晶体从固定化酶颗粒中分离出。将晶体的悬浮液过滤。反应组分的量列于下述表2中。
                                  表2.
加入的底物 最后的晶块 最后的溶液中
D-HPGM 90.5g(500mmol) 0.1g(0.6mmol) 34.2g(189mmol)
6-APA 43.2g(200mmol) 0.7g(3mmol) 3.0g(14mmol)
阿莫西林·3H2O 0 70.8g(169mmol) 4.2g(10mmol)
D-HPG 0 0.3g(2mmol) 21.7g(130mmol)
阿莫西林的产率(分离出的产物，基于加入的6-APA)：85％。
阿莫西林生产能力：90mmol/小时/升。
R＝1.4。
           实施例2
从D-HPGA和6-APA酶法制备阿莫西林
用于本实验的设备如实施例1中所述。
将由D-HPGA(20.0g，120mmol)和6-APA溶于800ml水后构成的混合液(其中加入4M氢氧化铵而将pH值调节至6.0)加入底阀关闭的反应器中。开始搅拌。将补充至200ml的固定化青霉素G酰基转移酶(26250U，大小为200-500μm)加入反应器中。将pH值保持在6.0。反应温度约为20℃。在这些反应条件下，反应混合物几乎被D-HPGA和6-APA饱和。然后打开底阀，使反应混合物从反应器进入离心机中。此后，将得自离心机的母液泵入装有D-HPGA(20.0g，120mmol)和6-APA(20.0g，92.5mmol)的供应槽中。将供应槽中悬浮液的总体积控制在约75ml。维持体系中的流速约为100ml/min。反应器中、反应器出口管中、离心机出口管中、供应槽中、及供应槽出口管中反应组分的浓度由分析用HPLC监测。
通过反应器中的底筛将反应器中产生的晶体从固定化酶颗粒中分离出来。晶体悬浮液被送入离心机中，此处晶体从母液中分离出。将母液流经供应槽。当供应槽中的总浓度降至约150mM HPGA和225mM6-APA时，往供应槽中加入更多的固体。不时地用水洗涤离心机中的晶体，将洗液加入反应器中。所用水量以保持反应器中的体积在其起始水平。离心机中的晶体被洗涤后，将离心机放空。
约12小时后，停止向供应槽中投配6-APA，而继续投配D-HPGA以将D-HPGA保持在饱和状态。14小时后，6-APA的浓度达20mM，停止反应。反应组分的量列于下述表3。
                           表3.
加入的底物   最后的晶块 最后的溶液中
D-HPGA 483.9g(2915mmol) 1.3g(8mmol) 22.4g(135mmo1)
6-APA 443.0g(2051mmol) 8.0g(37mmol) 4.3g(20mmol)
阿莫西林·3H2O 0 758.4g(1810mmol) 8.4g(20mmol)
D-HPG 0 103.2g(618mmol) 29.7g(178mmol)
阿莫西林产率(分离出的产物，基于加入的6-APA)：88％。阿莫西林的生产能力：131mmol/小时/升。R＝2.3。

Claims (17)

1.通过母体氨基β-内酰胺与相应的酰化剂的酶促反应制备β-内酰胺衍生物的方法，其特征在于该反应是在恒定高浓度的母体氨基β-内酰胺及相应的酰化剂的条件下进行的。
2.根据权利要求1的方法，其中氨基β-内酰胺及酰化剂二者既可连续地也可半连续地加入。
3.根据权利要求1的方法，其中反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率(V1-V3)与反应混合物中酸式酰化剂的总生成速率(V2+V3)之间的比值，在约5小时、优选是约10小时期间，偏离相同的时间内期望的β-内酰胺衍生物的净生成速率与酸式酰化剂的总生成速率之间的平均比值不高于约±50％，更优选不高于约±20％，最优选不高于约±10％。
4.根据权利要求1的方法，其中反应混合物中期望的β-内酰胺衍生物的生成速率(V1)，在约5小时、优选约10小时期间，偏离相同时间内期望的β-内酰胺衍生物的平均生成速率不高于约±50％，更优选不高于约±20％，最优选不高于约±10％。
5.根据前述权利要求的任一项的方法，其中β-内酰胺衍生物及任选的酸式酰化剂在反应期间被连续地或半连续地移出。
6.根据前述权利要求的任一项的方法，其中溶解的和任选沉淀的β-内酰胺衍生物的总含量不超过350mMol/升反应混合物的量。
7.根据前述权利要求的任一项的方法，其中母体氨基β-内酰胺选自：6-氨基青霉烷酸、7-氨基去乙酸基头孢烷酸、7-氨基头孢烷酸、7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸盐及7-氨基-3-〔〔(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫代〕甲基〕-3-头孢烯-4-羧酸盐。
8.根据权利要求1-7的任一项的方法，其中酰化剂选自：D-苯基甘氨酸的衍生物、D-对羟基苯基甘氨酸的衍生物、D-2，5-二氢苯基甘氨酸的衍生物或扁桃酸的衍生物。
9.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中所得的β-内酰胺衍生物选自：氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄、cephadroxil、头孢拉定、依比西林及头孢孟多。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中反应是在约0到约35℃的范围内、优选是高于约10℃的温度下进行的。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中反应是在约5以上到约8的pH值范围内进行的。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中起始的氨基β-内酰胺是通过青霉素V、青霉素G、7-苯氧基乙酰氨基去乙酸基头孢烷酸、7-苯基乙酰氨基去乙酸基头孢烷酸或头孢菌素C或其衍生物的水解作用，以及任选地除去水解释放的侧链来制备的。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中酰化剂是一种酰胺，优选是其中的-CONH2基未被取代的酰胺，或酯的部分含1-3个碳原子的一种酯。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所用的酶得自：大肠埃希氏菌、巴氏醋杆菌、柑桔黄单胞菌、Kluyvera citrophila、巨大芽孢杆菌或粪产碱菌。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中采用有酶活性的可重复使用的原料。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所用的酶是固定化的酶。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中酶促反应是在任选地与有机溶剂一起的含水体系中进行的。
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