CN115287220A - 一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的通用增菌剂及其应用 - Google Patents

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丁翔
钱方
牟光庆
姜淑娟
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Abstract

本发明公开了一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的通用增菌剂及其应用，属于生物技术领域。本发明所述增菌剂由以下几个组分及浓度组成：蔗糖20‑35g/L，大豆蛋白胨20‑40g/L，酵母浸粉10‑20g/L，无水乙酸钠5‑8g/L，磷酸氢二钾1‑2g/L，柠檬酸氢二胺1‑2g/L，无水硫酸镁0.3‑0.5g/L，无水硫酸锰0.1‑0.2g/L，吐温‑80 1‑2ml/L。本发明提供的增菌剂，较传统牛肉膏培养相比，原料取材方便，操作简单，能显著地提高植物乳杆菌发酵液中的活菌数。

Description

一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的通用增菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的通用增菌剂及其应用。
背景技术
植物乳杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30～ 37℃，属于兼性厌氧菌，最适pH为6.2左右，菌体形状为直或者弯的杆状，主要存在于奶油、肉类及蔬菜类发酵制品中，大部分菌种从植物原材料中分离得到，因此得名植物乳杆菌。大量的研究证明植物乳杆菌有着良好的益生性能与发酵潜力，如通过调节肠道微生物群来改善肠道炎症和脂质代谢紊乱、抗氧化等功能。植物乳杆菌在实验室的培育中主要使用MRS 肉汤培养基进行培养，使用MRS肉汤琼脂培养基进行倾倒平板计数，不同的菌种培养14～16h后活菌数基本可以达到107～109cfu/mL。
实验室发酵不同于工业发酵，实验室多为小批量、小规模进行菌种培育，基本满足日常科研实验，但工业为大批量发酵进行菌种培育，不仅发酵规模较大，而且对菌种活菌数稳定性有着一定的需求，MRS培养基由于成本较高，且培养获得活菌数与投入不成正比，因此在工业发酵的应用较为困难。目前有研究使用天然绿色材料进行碳源、氮源替换，但是随着季节的更替，天然材料的来源变得不可控，而且发酵制品工厂多远离市区，特别在寒冷的冬季，天然绿色材料的成本过大、来源不充足以及天然制品的贮藏又成为另一个难题。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明对植物乳杆菌培养基的成分进行科学优化，并且实施例使用5株植物乳杆菌进行培养验证，旨在发明一种植物乳杆菌通用的发酵培养基。
本发明提供了一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的增菌剂，所述增菌剂包括氮源、碳源，所述氮源包括酵母浸粉和大豆蛋白胨，所述碳源包括蔗糖。
进一步地，上述技术方案中，所述增菌剂包括缓冲盐及其他组分，所述缓冲盐及其他组分包括无水乙酸钠，磷酸氢二钾，柠檬酸氢二胺，无水硫酸镁，无水硫酸锰，吐温-80。
进一步地，上述技术方案中，所述增菌剂包括：蔗糖20-35g/L，大豆蛋白胨20-40g/L，酵母浸粉10-20g/L，无水乙酸钠5-8g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，柠檬酸氢二胺1-2g/L，无水硫酸镁0.3-0.5g/L，无水硫酸锰0.1-0.2g/L，吐温-80 1.5-2ml/L。
进一步地，上述技术方案中，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌Y44(菌种保藏号为CCTCC NO:M 2018558)、植物乳杆菌Y12(菌种保藏号为 CCTCC NO:M 2018556)、植物乳杆菌DPUL-F50(菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021838)、植物乳杆菌Y42、植物乳杆菌Y16。
植物乳杆菌Y42已发表文章[1]Lijuan Zhang,Yuan Meng,et.al.Lactobacillusplantarum Y42 in biofilm and planktonic states improves intestinal barrier-integrity and modulates gut microbiota of Balb/c mice[J].Foods,2022.[2]宋杏.Lactobacillus plantarum Y42培养上清液抑制Listeria monocytogenes生物膜形成的研究[D].大连工业大学,2019.
植物乳杆菌Y16已发表期刊文章[1]Arong Wang,Kairong Hou, Guangqing Mu,et.al.Antioxidative effect of soybean milk fermented by Lactobacillusplantarum Y16 on 2,2–azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(ABAP)-damaged HepG2 cells[J].Food Bioscience,2021.
进一步地，上述技术方案中，所述高密度富集培养为微生物在液体培养中细胞密度超过常规培养10倍以上时的生长状态的培养技术。
本发明还提供了所述的增菌剂在植物乳杆菌大规模发酵增殖培养中的应用。
本发明对植物乳杆菌培养基利用进行全面优化，其中包括以下步骤：
本发明对植物乳杆菌氮源利用进行优化，通过单因素实验，以菌体密度为响应值，筛选出大豆蛋白胨和酵母浸粉两种氮源(如图3)。
本发明对大豆蛋白胨和酵母浸粉的比例进行优化，通过单因素实验，以菌体密度与活菌数为响应值，最终优化比例结果为大豆蛋白胨和酵母浸粉比例为2:1。
本发明使用法国梅里埃碳水化合物鉴定试剂盒对植物乳杆菌碳源利用进行详细完全的测定，共测定49种碳源。
本发明对49种碳源综合考虑成本、来源等其他因素，最终筛选出9 种糖进行碳源优化实验，其中包括半乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、菊粉、木糖醇。
本发明通过单因素实验，以菌体密度为响应值，对植物乳杆菌碳源利用程度进行测定，最终筛选出蔗糖作为植物乳杆菌发酵培养基碳源(如图 2)。
本发明对碳源和氮源的总量进行优化，最终确定较优碳源和氮源总量为8％～10％。
本发明对碳源和氮源的比例进行优化，最终确定较优碳源和氮源比例为1:2。
本发明对其他缓冲盐组分、生长因子和分散剂进行浓度优化，初步确定无水乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.4％，柠檬酸氢二胺0.2％，无水硫酸镁 0.058％，无水硫酸锰0.05％，吐温-80 0.2％
本发明使用Plackett-Burman和Box-Behnken实验对培养基组分进行科学优化，最终优化植物乳杆菌发酵培养基配方为：蔗糖20-35g/L，大豆蛋白胨20-40g/L，酵母浸粉10-20g/L，无水乙酸钠5-8g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，柠檬酸氢二胺1-2g/L，无水硫酸镁0.3-0.5g/L，无水硫酸锰0.1-0.2g/L，吐温-80 1.5-2ml/L。
本发明所述增菌剂，较传统牛肉膏培养基相比，原料取材方便，操作简单；而且，该增菌剂能显著地提高植物乳杆菌发酵液中的活菌数。
附图说明
图1为优化培养基对不同植物乳杆菌活菌数影响。
图2为不同碳源对植物乳杆菌Y44生长的影响。
图3为不同氮源对植物乳杆菌Y44生长的影响。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018558，保藏日期为2018年8月21日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名称为Y44。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y12保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y12的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018556，保藏日期为2018年8月21日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名称为Y12。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) DPUL-F50的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021838，保藏日期为2021年 7月8日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名称为 DPUL-F50。
实施例1
按以下配方配置培养基：蔗糖35g，大豆蛋白胨40g，酵母浸粉20g，无水乙酸钠8g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，无水硫酸镁0.5g，无水硫酸锰0.2g，吐温-80 2ml，饮用水1L。经过121℃15min灭菌后接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44，接种量为2％(v/v)，37℃培养16h，进行倾注平板法计数。利用优化培养基进行培养，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44活菌数为(3.363±0.35)×1010cfu/mL，是MRS培养基(4.735 ±0.18)×109cfu/mL活菌数的7.1倍。
实施例2
按以下配方配置培养基：蔗糖32g，大豆蛋白胨40g，酵母浸粉20g，无水乙酸钠7g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，无水硫酸镁0.4g，无水硫酸锰0.2g，吐温-80 2ml，饮用水1L。经过121℃15min灭菌后接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y42，接种量为2％(v/v)，37℃培养16h，进行倾注平板法计数。利用优化培养基进行培养，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y42活菌数为(1.062±0.12)×1010cfu/mL，较MRS培养基(4.083 ±0.45)×109cfu/mL活菌数提升2.2倍。
实施例3
按以下配方配置培养基：蔗糖35g，大豆蛋白胨40g，酵母浸粉20g，无水乙酸钠8g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，无水硫酸镁0.5g，无水硫酸锰0.2g，吐温-80 2ml，饮用水1L。经过121℃15min灭菌后接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y12，接种量为2％(v/v)，37℃培养16h，进行倾注平板法计数。利用优化培养基进行培养，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y12活菌数为(3.922±0.27)×1010cfu/mL，是MRS培养基(4.217 ±0.78)×109cfu/mL活菌数的9.3倍。
实施例4
按以下配方配置培养基：蔗糖35g，大豆蛋白胨40g，酵母浸粉20g，无水乙酸钠8g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，无水硫酸镁0.5g，无水硫酸锰0.2g，吐温-80 2ml，饮用水1L。经过121℃15min灭菌后接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y16，接种量为2％(v/v)，37℃培养16h，进行倾注平板法计数。利用优化培养基进行培养，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y16活菌数为(7.967±0.12)×109cfu/mL，是MRS培养基(3.517 ±0.95)×109cfu/mL活菌数的2.3倍。
实施例5
按以下配方配置培养基：蔗糖35g，大豆蛋白胨40g，酵母浸粉20g，无水乙酸钠8g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，无水硫酸镁0.5g，无水硫酸锰0.2g，吐温-80 2ml，饮用水1L。经过121℃15min灭菌后接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50，接种量为2％(v/v)，37℃培养16h，进行倾注平板法计数。利用优化培养基进行培养，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50活菌数为(1.248±0.12)×109cfu/mL，是MRS培养基培养(5.667±0.78)×109cfu/mL活菌数的2.2倍。

Claims (6)

1.一种用于植物乳杆菌高密度富集培养的增菌剂，其特征在于，所述增菌剂包括氮源、碳源，所述氮源包括酵母浸粉和大豆蛋白胨，所述碳源包括蔗糖。
2.根据权利要求1所述的增菌剂，其特征在于，所述增菌剂包括缓冲盐及其他组分，所述缓冲盐及其他组分包括无水乙酸钠，磷酸氢二钾，柠檬酸氢二胺，无水硫酸镁，无水硫酸锰，吐温-80。
3.根据权利要求1或2所述的增菌剂，其特征在于，所述增菌剂包括：蔗糖20-35g/L，大豆蛋白胨20-40g/L，酵母浸粉10-20g/L，无水乙酸钠5-8g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，柠檬酸氢二胺1-2g/L，无水硫酸镁0.3-0.5g/L，无水硫酸锰0.1-0.2g/L，吐温-80 1.5-2ml/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的增菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y42、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y12、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y16、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50。
5.根据权利要求1所述的增菌剂，其特征在于，所述高密度富集培养为微生物在液体培养中细胞密度超过常规培养10倍以上时的生长状态的培养技术。
6.权利要求1-5中任一项所述的增菌剂在植物乳杆菌发酵增殖培养中的应用。
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