CN115261270A - 巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用；所述应用的方法步骤如下：S1、生产用液体菌种的制备：以巨大芽胞杆菌FJAT‑54986为菌种，以LB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；S2、巨大芽孢杆菌制剂的制备：以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种S1制得的液体菌种，制得巨大芽孢杆菌液体发酵产物。该应用方法以工业上生产木板的废弃物巨菌草汁为培养基，能够使得培养的巨大芽孢杆菌活菌数≧7.53×108cfu/ml；本发明应用方法简单、成本低，发酵后得到的巨大芽孢杆菌含量显著高于常用的LB培养基发酵效果。
Description
技术领域
本发明涉及细菌培养基技术领域，尤其是涉及巨菌草汁作为巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用。
背景技术
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是芽胞杆菌属的1种，属于好氧革兰氏阳性杆菌，是一种有益菌，具有对环境和人畜无害等特点而受到人们的关注与研究(陈玉粮，2019.不同条件下巨大芽孢杆菌BM1259的生长特性研究.中兽医学杂志,7:29-31.)。1935年苏联科学家孟吉娜从土壤里分离到了一株可以解磷的巨大芽孢杆菌并开始投入生产与继续的深入研究(朱长俊，潘彦平.2005.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)解磷机理的研究(1)--解磷能力与磷素影响.嘉兴学院学报,3:60-62.)。实验证明，巨大芽胞杆菌对土壤中的磷循环具有重要意义(王珍等，2016.巨大芽胞杆菌WY4的GFP标记及其在小白菜上的定殖.农业生物技术学报,24(12):1925-1934.)。巨大芽孢杆菌在水产上可以起到净化水体的作用，主要体现在对水体中的有机物和磷降解、改善水体的富营养化以及水产养殖的应用(李忠徽等，2019.一株异养硝化巨大芽胞杆菌的分离鉴定及其脱氮性能研究.农业生物技术学报,27(8):1331-1340.)。有鉴于此，巨大芽孢杆菌的生物培养具有重要的意义；目前，巨大芽孢杆菌的培养主要使用的是常用的LB培养基。但是，该培养基培养的巨大芽孢杆菌只能达到5.80×107cuf/mL左右，且成本较高。
巨菌草是系多年生禾本科直立丛生型植物，根系发达，生长迅速，已知其富含有机酸、多酚类、蛋白质、纤维素、糖类等生物物质。巨菌草适应能力强，在我国各地区被广泛种植。目前巨菌草多用于饲料、沼气发酵生产、燃烧发电、生物质乙醇制造等传统领域上。
目前，还未见过利用巨菌草汁作为巨大芽孢杆菌的培养基的报道，对于巨菌草的高附加值利用也具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用。该应用方法以工业上生产木板的废弃物巨菌草汁为培养基，能够使得培养的巨大芽孢杆菌活菌数≧7.53×108cfu/mL；本发明应用方法简单、成本低，发酵后得到的巨大芽孢杆菌含量显著高于常用的LB培养基发酵效果。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用。
作为一种实施方式，所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌FJAT-54986。
作为一个优选的实施方式，所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)FJAT-54986为菌种，以LB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、巨大芽孢杆菌制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种S1制得的液体菌种，制得巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
作为一个实施方式，步骤S2中，所述接种是在28-32℃条件下，170-190r/min培养45-50h。
作为一个实施方式，步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置LB固体培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌株于LB培养基平板上划线培养，30℃恒温培养2天；直到培养基平板中出现巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌落；
S12、制备生产用液体菌种
配置LB液体培养基，挑取步骤S11中菌落接种于LB液体培养基中，在30℃，180r/min条件下培养48h，即得生产用液体菌种。
作为一种实施方式，步骤S11中，所述LB固体培养基中包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂18g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用。
作为一种实施方式，步骤S12中，所述LB液体培养基中包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用。
作为一个的实施方式，步骤S2中，所述巨大芽孢杆菌制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；过滤废渣可以作为工业上生产木板的主原料；
S22、以巨菌草汁为液体培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min培养48h，即巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
本发明的有益效果
本发明的应用方法以巨菌草汁为培养基，能够使得直接培养的巨大芽孢杆菌活菌数≧7.53×108cfu/mL。本发明应用方法简单、成本低，发酵后得到的巨大芽孢杆菌含量显著高于真菌常用的LB培养基发酵效果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
除非另有说明，本文中所用的所有百分比和比率均以总组合物重量计。除非另有说明，本文提及的所有成分的百分数、比例和含量均基于该成分的实际含量，并不包括在市售产品找那个可以与这些成分组合的溶剂、填料或其它物质。
本文中的术语“包含/包括”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。
本文中的术语“优选地”和它的变体是指在特定环境下能够提供特定有益效果的本发明的实施方案。然而，其它的实施方案在相同或其它的环境下也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详细描述并不表示其它实施方案是无用的，并且不旨在本发明的范畴中排除其它的实施方案。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
作为本发明的一个方面，本发明巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用。
作为一个的实施例，所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌FJAT-54986。
作为一个的实施例，所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)FJAT-54986为菌种，以LB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、巨大芽孢杆菌制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种S1制得的液体菌种，制得巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
作为一个的实施例，步骤S2中，所述接种是在28-32℃条件下，170-190r/min培养45-50h。
作为一个实施方式，步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置LB固体培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌株于LB培养基平板上划线培养，30℃恒温培养2天；直到培养基平板中出现巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌落；
S12、制备生产用液体菌种
配置LB液体培养基，挑取步骤S11中菌落接种于LB液体培养基中，在30℃，180r/min条件下培养48h，即得生产用液体菌种。
作为一个的实施例，步骤S11中，所述LB固体培养基中包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂18g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用。
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作为一个的实施例，步骤S2中，所述巨大芽孢杆菌制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；过滤废渣可以作为工业上生产木板的主原料；
S22、以巨菌草汁为液体培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min培养48h，即巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
实施例1
巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用，步骤如下：
1)试验材料的准备
菌草汁：以新鲜巨菌草汁为材料，采用榨汁机压榨后过滤废渣得巨菌草汁；
主要菌种：巨大芽孢杆菌FJAT-54986，来自福建省农业科学院生物资源所菌种库保存；
LB液体培养基配方(g/L)：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH＝7.0，分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用；
LB固体培养基平板：在LB液体培养基配方中加入18g/L琼脂，pH＝7.0，121℃，20min高压灭菌；
2)试验方法
2.1)巨大芽孢杆菌的活化：配置LB培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的巨大芽胞杆菌FJAT-54986菌株于LB培养基平板上划线培养，30℃恒温培养48h；
2.2)巨大芽孢杆菌种子液的制备：挑取已活化的菌落接种于LB培养液中，30℃，180r/min培养48h，即为生产用液体菌种；
2.3)巨菌草液体培养基的配制：将巨菌草汁调至pH＝7.0，分装于250mL三角瓶中，每只三角瓶装液量50mL，121℃灭菌20min；每个处理3个重复；
2.4)巨大芽孢杆菌植物疫苗菌剂的制备：以1％接种量接种步骤2.2)制得的巨大芽胞杆菌生产用液体菌种于巨菌草液体培养基中，30℃恒温下，180r/min培养48h，即巨大芽胞杆菌液体发酵产物；
2.5)发酵产物活菌数检测：将巨大芽孢杆菌液体发酵产物按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列稀释后，涂布于LB固体培养基平板，于37℃培养30h，统计活菌数量；
3)试验结果
参见表1所示：巨大芽孢杆菌FJAT-54986可在含有菌草汁的培养基中发酵生长，本实施例处理组发酵的活菌含量为7.53×108cuf/mL，显著高于LB培养基对照组，用100％巨菌草汁作为巨大芽孢杆菌FJAT-54986的发酵培养基是合适的。
对比例1
重复实施例1，其不同之处仅在于：
步骤2.3)中，用LB液体培养基来代替100％巨菌草汁作为培养基。
经检测，本对比例的活菌数量见表1。
表1：
| 处理组 | 活菌数 |
| LB培养基 | 5.80×10<sup>7</sup>cfu/mL |
| 纯菌草汁培养基 | 7.53×10<sup>8</sup>cfu/mL |
本发明意外地发现，以100％巨菌草汁为培养基，能够使得直接培养的巨大芽孢杆菌活菌数达到7.53×108cfu/mL。本发明应用方法简单、成本低，发酵后得到的巨大芽孢杆菌含量显著高于常用的LB培养基发酵得到5.80×107cfu/mL的效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.巨菌草汁作为植物促长菌巨大芽胞杆菌发酵培养基的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌FJAT-54986。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用的方法步骤如下：
S1、生产用液体菌种的制备：
以巨大芽胞杆菌FJAT-54986为菌种，以LB培养基为菌种用培养基，制备生产用液体菌种；
S2、巨大芽孢杆菌制剂的制备：
以巨菌草汁为液体培养基，灭菌后，接种S1制得的液体菌种，制得巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤S2中，所述接种是在28-32℃条件下，170-190r/min培养45-50h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤S1中，所述生产用液体菌种的制备的具体步骤如下：
S11、菌种的活化：
配置LB固体培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌株于LB培养基平板上划线培养，30℃恒温培养2d；直到培养基平板中出现巨大芽孢杆菌FJAT-54986菌落；
S12、制备生产用液体菌种
配置LB液体培养基，挑取步骤S11中菌落接种于LB液体培养基中，在30℃，180r/min条件下培养48h，即得生产用液体菌种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤S11中，所述LB固体培养基中包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂18g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤S12中，所述LB液体培养基中包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH＝7.0；分装于250mL三角瓶，每瓶装培养基50mL，121℃，20min高压灭菌，冷却，待使用。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤S2中，所述巨大芽孢杆菌制剂的制备的具体步骤如下：
S21、以新鲜巨菌草为材料，采用榨汁机压榨后出汁液，过滤废渣后得巨菌草汁；过滤废渣可以作为工业上生产木板的主原料；
S22、以巨菌草汁为液体培养基，调整pH值为7.0，121℃灭菌20min；
S23、向灭菌后的液体培养基中按接种量1％接种步骤S1中得到的生产用液体菌种，在30℃恒温下，180r/min培养48h，即巨大芽孢杆菌液体发酵产物。
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