CN1132627C - 固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固态发酵生产蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)微生态制剂的方法，其特征在于以麸皮和豆饼粉为主要培养料，经灭菌、液体种子接种、周期变压固态发酵和真空冷凝干燥的工艺过程，发酵产品的活孢子数达到500亿个/克以上，比传统的固态发酵法提高2倍以上，且生产成本低，为现有生产技术(液体深层发酵法)的1/3，生产过程无三废产生。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂的生产领域，特别涉及一种固态发酵生产蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)微生态制剂的方法。
背景技术
多年来，在禽畜肠道病的防治上，抗生素与抗菌药物的应用越来越广泛，引起滥用现象；并且在全价配合饲料中长期添加抗生素，使之抗药性剧增。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)是一种优良的微生态制剂。它对畜禽腹泻具有很好的防治作用，可代替抗生素作饲料添加剂。我国农业部生物制品委员会已批准将其列入“兽用生态制剂”[康白等大连医学院学报19846(1)：1-8]。目前工业生产蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)微生态制剂主要采用常规的深层液体发酵法，该法存在着生产成本高，产生大量废水污染环境等缺点；传统的固态发酵方法，即浅盘或通风池式固态发酵法也存在着不易大规模放大、生产不稳定、产品活菌数低等不足，不适合蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)微生态制剂的工业化生产。
本发明目的在于克服现有制备蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus DM423)微生态制剂的方法存在的诸多不足，提供一种固态发酵生产蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus DM423)微生态制剂的方法，即在一种密闭式固态发酵反应器中，固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂，使蜡状芽孢杆菌固态发酵的生产实现了严格意义上的纯种培养，并实现了大规模放大生产，发酵产品的活菌数达500亿个/克以上，比传统的固态发酵提高2倍以上，且生产成本低(为液体深层发酵法的1/3)，无污染。
发明内容
本发明的实施方案如下：
本发明提供的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法，其工艺步骤如下：
1.制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液：
将琼酯斜面上生长良好的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423，加入无菌水，制成菌悬液，接种于种子培养液中，在28-30℃温度下，发酵8--10小时，即得蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液；
所述的种子培养液的组成包括玉米面、豆饼粉和玉米浆和水，其重量份配比为：玉米面∶豆饼粉∶玉米浆∶水＝1.5-2.5∶0.8-1.2∶0.5-1.5∶100，用氢氧化钠溶液将pH值调至6.7-7.0；
2.制备发酵用固体培养基：
发酵用固体培养基由固体料和水组成，固体料和水的重量份配比为1∶0.8-1，固体料包括麸皮、豆饼粉、生石灰，其重量份配比为：麸皮∶豆饼粉∶生石灰＝7--9∶1--2.5∶0.1-0.25，生石灰的加入量视生石灰质量而定，其加入量以使固体料在进行蒸料灭菌后的pH值保持在6.7-7.0为宜；发酵用固体培养基的具体配制方法是：先将生石灰和水均匀混合，再将此含生石灰的水加入到固体料中，混合均匀；
将配制好的发酵用固体培养基进行灭菌，之后，冷却至25--32℃，备用；
3.将步骤1制备的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液，以相当于发酵用固体培养基重量的7-10％的接种量接种于发酵用固体培养基，在密闭式固态发酵反应器中进行发酵，发酵反应器中压力控制在0.05Mpa-0.25Mpa的范围内，并以30分钟-2小时为周期对发酵过程进行周期变压操作，所谓的周期变压操作是指周期性的重复充压、高压维持、泻压和低压维持这一过程，同时，控制发酵温度28--30℃，发酵时间40-50小时，即得发酵产物；
4.将发酵产物进行真空冷凝干燥、然后粉碎，即制得使用本发明方法而制备的蜡状芽孢杆菌微生态制剂；
将上述发酵产物进行真空冷凝干燥，所述的真空冷凝干燥是在控制温度30--50℃，真空度为5000-9000Pa的条件下，干燥后的产物水份含量为1--4％；
将上述真空冷凝干燥后的产物送入粉碎机，粉碎至细度60--80目，即得应用本方法制备的蜡状芽孢杆菌微生态制剂产品。
本发明的优点是：由于本固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法是在一种密闭式固态发酵反应器中进行的，且整个发酵过程遵循无菌操作规程，从而使蜡状芽孢杆菌的固态发酵生产实现了严格意义上的纯种培养，并实现了大规模放大生产，发酵产品的活菌数达500亿个/克以上，比传统的固态发酵提高2倍以上，且生产成本低(为液体深层发酵法的1/3)，产品质量稳定高效；生产过程无三废产生，属清洁生产工艺。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明：
实施例1：用本发明提供的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法制备蜡状芽孢杆菌微生态制剂，其步骤如下：
1.制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液：
将于琼酯斜面上生长良好的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423，加入无菌水，制成菌悬液，接种于种子培养液中，30℃温度下，发酵8小时，制备蜡状芽孢杆菌种子液；
种子培养液的组成包括玉米面、豆饼粉和玉米浆和水，其重量份配比为：玉米面∶豆饼粉∶玉米浆∶水＝2.0∶1.0∶1.0∶100，用氢氧化钠溶液将pH调至7.0；
2.制备发酵用固体培养基：
发酵用固体培养基由固体料和水组成，固体料和水的重量比为：1∶0.9，固体料包括麸皮、豆饼粉和生石灰，其重量份配比为：麸皮∶豆饼粉∶生石灰∶水＝8∶2∶0.15，生石灰的加入量视生石灰质量而定，本实施例生石灰加入量，使固体料在进行蒸料灭菌后的pH值为7.0。该发酵用固体培养基具体制做方法是：先将生石灰和水混合均匀，再将含生石灰的水加到固体料中，混合均匀；
将配制好的发酵用固体培养基送入蒸料罐灭菌，之后，冷却至25-32℃，备用；
3.固态发酵接种：
将步骤1制备的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液，按相当于发酵用固体培养基重量的10％的接种量接种于上述发酵用固体培养基中，拌匀，然后装入已灭菌的不锈钢盘，送入密闭式固态发酵反应器中进行发酵，在0.05-0.20Mpa的压力范围内，以50min为周期对固态发酵过程进行周期变压操作，同时，控制发酵温度30℃，发酵48小时，即制得发酵产物；
4.将发酵产物进行真空冷凝干燥，然后粉碎：
发酵结束后，将发酵盘送入真空冷凝干燥罐中，控制体系温度30℃，真空度为9000Pa，真空冷凝干燥后的产物水份含量为4％；
将上述真空冷凝干燥后的产物送入粉碎机，粉碎至细度60--80目，即得蜡状芽孢杆菌微生态制剂产品，其活孢子数达到550亿个/克。
本发明方法制备的蜡状芽孢杆菌微生态制剂与其它方法制备的蜡状芽孢杆菌微生态制剂相比较，其结果见表1：
表1 不同发酵方式生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的比较
| 制备方法 | 发酵时间(小时) | 活孢子数(亿个/克(毫升) | 成本(元/吨) |
| 液体深层发酵法 | 24 | 30--50亿个/毫升 | 16000 |
| 本发明的方法 | 48 | 300-500亿个/克 | 5000 |
| 培养箱(三角瓶，常压) | 48 | 120-200亿个/克 | 实验室培养 |
| 发酵间(瓷盘，常压) | 48 | 80-160亿个/克 | 有染菌，难以大规模工业生产 |
实施例2：用本发明提供的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法制备蜡状芽孢杆菌微生态制剂，其步骤如下：
1.制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液：
将于琼脂斜面上生长良好的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423，加入无菌水，制成菌悬液，接种于种子培养液中，28℃温度下，发酵10小时，制备蜡状芽孢杆菌种子液；
种子培养液的组成包括玉米面、豆饼粉和玉米浆和水，其重量份配比为：玉米面∶豆饼粉∶玉米浆∶水＝1.5∶1.2∶1.5∶100，用氢氧化钠溶液将pH调至6.8；
2.制备发酵用固体培养基：
发酵用固体培养基由固体料和水组成，固体料和水的重量比为：1∶0.8，固体料包括麸皮、豆饼粉和生石灰，其重量份配比为：麸皮∶豆饼粉∶生石灰∶＝7∶1∶0.1，生石灰的加入量视生石灰质量而定，本实施例生石灰加入量，使固体料在进行蒸料灭菌后的pH值为6.7。该发酵用固体培养基具体制做方法是：先将生石灰和水混合均匀，再将含生石灰的水加到固体料中，混合均匀；
将配制好的发酵用固体培养基送入蒸料罐灭菌，之后，冷却至25-32℃，备用。
3.固态发酵接种：
将步骤1制备的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液，按相当于发酵用固体培养基重量的7％的接种量接种于上述发酵用固体培养基中，拌匀，然后装入已灭菌的不锈钢盘，送入密闭式固态发酵反应器中进行发酵，在0.05-0.25Mpa的压力范围内，以2小时为周期对固态发酵过程进行周期变压操作，同时，控制发酵温度28℃，发酵50小时，即制得发酵产物；
4.将发酵产物进行真空冷凝干燥，然后粉碎：
发酵结束后，将发酵盘送入真空冷凝干燥罐中，控制体系温度50℃，真空度为5000Pa，干燥24小时，真空冷凝干燥后的产物水份含量为3％；
将上述真空冷凝干燥后的产物送入粉碎机，粉碎至细度60--80目，即得蜡状芽孢杆菌微生态制剂产品，其活孢子数达到400亿个/克。
实施例3：用本发明提供的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法制备蜡状芽孢杆菌微生态制剂，其步骤如下：
1.制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液：
将于琼脂斜面上生长良好的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423，加入无菌水，制成菌悬液，接种于种子培养液中，29℃温度下，发酵9小时，制备蜡状芽孢杆菌种子液；
种子培养液的组成包括玉米面、豆饼粉和玉米浆和水，其重量份配比为：玉米面∶豆饼粉∶玉米浆∶水＝2.5∶0.8∶0.5∶100，用氢氧化钠溶液将pH调至6.7；
2.制备发酵用固体培养基：
发酵用固体培养基由固体料和水组成，固体料和水的重量比为：1∶1.0，固体料包括麸皮、豆饼粉和生石灰，其重量份配比为：麸皮∶豆饼粉∶生石灰∶＝9∶2.5∶0.25，生石灰的加入量视生石灰质量而定，本实施例生石灰加入量，使固体料在进行蒸料灭菌后的pH值为6.8。该发酵用固体培养基具体制做方法是：先将生石灰和水混合均匀，再将含生石灰的水加到固体料中，混合均匀；
将配制好的发酵用固体培养基送入蒸料罐灭菌，之后，冷却至25-28℃，备用。
3.固态发酵接种：
将步骤1制备的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液，按相当于发酵用固体培养基重量的8％的接种量接种于上述发酵用固体培养基中，拌匀，然后装入已灭菌的不锈钢盘，送入密闭式固态发酵反应器中进行发酵，在0.05--0.1Mpa的压力范围内，以30min为周期对固态发酵过程进行周期变压操作，同时，控制发酵温度29℃，发酵40小时，即制得发酵产物；
4.将发酵产物进行真空冷凝干燥，然后粉碎：
发酵结束后，将发酵盘送入真空冷凝干燥罐中，控制体系温度40℃，真空度为7000Pa，干燥24小时，真空冷凝干燥后的产物水份含量为4％；
将上述真空冷凝干燥后的产物送入粉碎机，粉碎至细度60--80目，即得蜡状芽孢杆菌微生态制剂产品，其活孢子数达到450亿个/克。
Claims (3)
1.一种固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于：工艺步骤如下：
1)制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液：
将琼酯斜面上生长良好的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423，加入无菌水，制成菌悬液，接种于种子培养液中，在28-30℃温度下，发酵8--10小时，制备蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液；
所述的种子培养液的组成包括玉米面、豆饼粉和玉米浆和水，其重量份配比为：玉米面∶豆饼粉∶玉米浆∶水＝1.5-2.5∶0.8-1.2∶0.5-1.5∶100；用氢氧化钠溶液将pH值调至6.7-7.0；
2)制备发酵用固体培养基：
发酵用固体培养基由固体料和水组成，固体料和水的重量份配比为1∶0.8-1，固体料包括麸皮、豆饼粉、生石灰，其重量份配比为：麸皮∶豆饼粉＝7--9∶1-2.5，生石灰的加入量视生石灰质量而定，其加入量以使固体料在进行蒸料灭菌后的pH值保持在6.7--7.0范围内；
将配制好的发酵用固体培养基进行灭菌，之后，冷却至25--32℃；
3)将步骤1制备的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus DM423种子液，以相当于发酵用固体培养基重量的7-10％的接种量接种于发酵用固体培养基，在密闭式固态发酵反应器中进行发酵，发酵反应器中压力控制在0.05Mpa-0.25Mpa的范围内，并以30分钟-2小时为周期对发酵过程进行周期变压操作，所谓的周期变压操作是指周期性的重复充压、高压维持、泻压和低压维持这一过程，同时，控制发酵温度28--30℃，发酵时间40-48小时，制得发酵产物；
4)将发酵产物进行真空冷凝干燥、然后粉碎，即制得含水量为1-4％的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂。
2.按权利要求1所述的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于：发酵用固体培养基的具体配制方法是：先将生石灰和水均匀混合，再将含生石灰的水加入到固体料中，混合均匀而制成发酵用固体培养基。
3.按权利要求1所述的固态发酵生产蜡状芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于：所述的真空冷凝干燥是指控制体系温度30--50℃，真空度为5000--9000的条件下；真空冷凝干燥后的发酵产物使用常规的设备和工艺进行粉碎，即制得细度0.28--0.18mm的蜡状芽孢杆菌微生态制剂。
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