CN115261238A - 一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法 - Google Patents

一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法，所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法包括：进行试验菌株采样以及接种培养；进行粗酶液的制备；进行产纤维素酶菌株的筛选；进行产酶条件的优化。本发明提供的高产纤维素酶的菌株的发酵方法，以澜沧江上、中、下游采集得到的120株淡水真菌菌株作为试验材料，通过正交试验设计，筛选出产纤维素酶活性较高的菌株，并对其发酵条件进行探究，确定纤维素分解菌生长最适的碳源、氮源和pH值，最大限度地优化澜沧江流域产酶菌种的培养条件，提高了纤维素酶产量，降低淡水真菌菌株培养的成本，为澜沧江流域淡水真菌资源开发与利用提供一定的理论依据和数据支持。

Description

一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法。
背景技术
目前，水生真菌是指生活在水体中并能完成生活史的真菌。从广义上讲，水生真菌包括淡水水生真菌、污水水生真菌和海洋水生真菌。其中，淡水真菌是指整个生活史或生活史的部分阶段依赖于淡水环境的真菌，它包含有壶菌、卵菌、担子菌、接合菌、子囊菌及其无性型等。我国淡水生真菌资源多样性非常丰富，从2013～2018年仅云南地区就报道了1个新科，9个新属，96个新种，19个新纪录种。
淡水真菌能产生丰富的胞外蛋白酶，例如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶以及木糖苷酶等，这些胞外酶在分解植物材料等方面具有不同的作用。因此，通过研究淡水真菌的代谢产物，特别是这些胞外蛋白酶，对我国酶工业的发展有一定的促进作用。中国现阶段对于淡水真菌的研究主要集中在资源调查与系统分类等层面，而淡水真菌的代谢产物方面的研究普遍较少。由于淡水真菌特殊的生物多样性以及环境导致的生物代谢产能途径的多样性，在探寻和开发产酶活性更高、作用范围更广泛的新菌种方面或许有着更好的表现。
澜沧江流域是我国南北流向最长的的河流，发源于我国青海省南部的唐古拉山脉，于云南省西双版纳州勐腊县出境，流经东南亚缅甸、老挝、泰国、柬埔寨、越南后汇入南海。澜沧江流域全长4909km，在中国境内均属于高山峡谷地貌，水量丰沛、落差集中，水资源优势明显，跨越温带、亚热带、热带，地处全球34个生物多样性热点地区，海拔高差大，水资源丰富，是欧亚大陆生物群落最富集的地区。澜沧江流域由于特殊的地理环境与气候条件，导致该地区的淡水真菌生长条件具有较大的差异性，极有可能蕴藏着具有胞外蛋白酶活性不同的淡水真菌资源。目前，澜沧江流域的真菌资源研究多集中于大型真菌，对于水生真菌的研究较少。保旦凤等对澜沧江水生真菌资源进行调查，结果表明澜沧江水生丝孢菌资源丰富，物种多样性较高。澜沧江流域由于独特的地理环境与气候条件，导致该地区的淡水真菌生长具有差异性，不同的淡水真菌生长条件，如温度、pH等条件不同，因此极有可能蕴藏着具有胞外蛋白酶酶活性不同的淡水真菌资源。
随着世界上对能源的需求量不断增加，资源紧缺的现象日益严重，人们也为了可持续发展开始而对新能源进行探索，其中纤维素酶的酶解产生能源物质无疑是一个良好的实施方案。在整个生物圈纤维素的分布极为广泛，在植物中的含量丰富且属于可再生资源。然而自然环境中，降解纤维素是比较缓慢的，这对环境造成了一定程度影响，如对纤维素垃圾进行焚烧处理，便会产生大量气体危害人体健康，形成雾霾，且极易引起火灾的发生。如果纤维素资源能被有效科学地利用，不仅可以减少秸秆等纤维素材料对环境的影响，也能解决一些能源危机。
在研究纤维素的降解中，通过酶类降解纤维素因其反应条件易于控制，降低有害物质生成而广受研究者们的青睐。所以，筛选高产纤维素酶的菌株及优化其发酵培养条件具有十分重要的意义。其中产纤维素的微生物可以将天然纤维素降解为葡萄糖等可利用能源物质。在微生物中，细菌产纤维素酶的活力相对于真菌来说较弱。所以研究真菌的纤维素酶是非常重要的。而真菌中的淡水真菌能因其生长的环境与陆地环境存在巨大差异，造就了其生长繁殖、新陈代谢等方面的特异性，在这样的特殊生长环境下，极有可能发掘出不同产酶特性菌株。产生纤维素酶的淡水真菌能分解水体中木质素和纤维素，进一步促进碳循环和物质流动，这为环境保护以及纤维素资源的利用带来了极大的便利。而中国现阶段对于淡水真菌的研究主要集中在资源调查与系统分类等方面。淡水真菌由于其特殊的生物多样性以及复杂的生长环境，而导致的其生物代谢产能途径的多样化，在探寻和开发产纤维素酶活性更高、作用范围更广泛的新菌种方面或许有着更好的表现。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)在自然环境中，降解纤维素是比较缓慢的，这对环境造成了一定程度影响，如对纤维素垃圾进行焚烧处理，便会产生大量气体危害人体健康，形成雾霾，且极易引起火灾的发生。
(2)中国现阶段对于淡水真菌的研究主要集中在资源调查与系统分类等层面，而淡水真菌的代谢产物方面的研究普遍较少；同时，目前澜沧江流域的真菌资源研究多集中于大型真菌，对于水生真菌的研究较少。
解决以上问题及缺陷的难度为：在高产纤维素酶的微生物发酵工艺的探究过程中，不仅要科学合理地设计初筛条件，得到产酶活性较高的菌株，同时根据淡水真菌不同于陆生真菌的生物学特性，设置需要优化的环境参数，通过单因素优化实验、多因素多水平正交试验得到实验数据。
解决以上问题及缺陷的意义为：该方法可实现利用微生物高产纤维素酶，为通过酶类降解纤维素提供成本低、环保安全的生产途径，并为淡水真菌的开发与利用提供宝贵的数据支持。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法。
本发明是这样实现的，一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法，所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法包括以下步骤：
步骤一，进行试验菌株采样以及接种培养；
步骤二，进行粗酶液的制备；
步骤三，进行产纤维素酶菌株的筛选；
步骤四，进行产酶条件的优化。
进一步，步骤一中，所述试验菌株采样以及接种培养，包括：
分别从上、中、下游采样得到淡水真菌菌株作为试验菌株；将已保存的试验菌株接种在PDA培养基上，于28℃下进行恒温培养5～7d，备用。
进一步，所述PDA培养基，由马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8.5g以及蒸馏水500ml组成。
进一步，步骤二中，所述粗酶液的制备，包括：
(1)从PDA平板上用接种针挑取活化的淡水真菌菌株无性孢子，在无菌条件下，接种于装有10ml无菌水的三角瓶中，置于摇床振荡，将孢子打散；
(2)在显微镜下用血球计数板计数，用无菌水调整孢子浓度为1×107CFU/ml；将10.0ml孢子悬液液接种于装有90ml纤维素酶液体发酵培养基的锥形瓶中，接种量为10％；
(3)将发酵瓶放置于28℃、200r/min摇床上振荡培养10d；发酵结束后，取发酵液2～5ml，在4℃的低温条件下，1500r/min高速离心，取上清液即为粗酶液。
进一步，所述纤维素酶液体发酵培养基，由羧甲基纤维素钠1.0g，硫酸铵1.0g，硫酸镁0.25g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.25g，刚果红0.2g以及水100ml组成。
进一步，步骤三中，所述产纤维素酶菌株的筛选，包括：
(1)初筛
在无菌操作台上，用直径5mm的打孔器在长势良好的纯培养菌株上取下直径为5mm的活化菌株，接种在纤维素刚果红培养基上，于28℃恒温培养10d，观察菌株周围是否能产生水解圈，若产生水解圈则说明此菌株能分泌纤维素酶；测定菌落直径d和水解圈直径D，单位cm，用HC表示水解能力，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000041
(2)复筛
初筛得到的菌株，进行产酶发酵试验，测定粗酶液中的羧甲基纤维素(CMC)酶活性，筛选出产酶活性较高的菌株。
CMC酶活：1％浓度的CMC-Na溶液1.5ml加入试管中，放置在水浴锅中，设定温度为50℃，预热3min，随后加入0.5ml粗酶液，在50℃条件下酶解1h，后立即加入3ml DNS试剂，沸水浴7min后流动冷水冷却，加蒸馏水10ml，测得520nm处的OD值；设对照组，其他条件不变，酶解温度改为100℃，灭酶活为对照，以产葡萄糖的量为计量单位。
在pH值4.8，温度为50℃条件下时，1ml粗酶液每h酶解底物产生1umol葡萄糖，即为1个酶活力单位，用U来表示，单位umol/(ml.h)，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000051
式中，N表示粗酶液稀释的倍数；G表示依据OD值代入标准方程计算得到的对应葡萄糖量，单位mg；t表示测酶活时酶解反应时间，单位min；n表示反应液中加入的稀释后粗酶液，单位ml；180表示葡萄糖的摩尔质量。
进一步，步骤四中，所述产酶条件优化，包括：
通过单因素预实验进行培养条件的筛选，以效果较好的3种碳源、氮源和3个pH值进行三因素三水平的正交试验，优化产酶条件。
进一步，所述发酵产酶单因素优化试验，包括：
碳源：在纤维素酶培养基上设羧甲基纤维素钠、玉米粉、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为碳源进行筛选；接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种碳源作为正交试验的碳源。
氮源：在纤维素酶培养基上设氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵和尿素作为氮源进行筛选；接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种氮源作为正交试验的氮源。
pH值：调节培养条件的酸碱值，pH分别设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，进行pH值优化试验；在酶活较高的pH之间分别设置3个酸碱度梯度进行正交试验。
进一步，所述发酵产酶正交优化试验，包括：
在复筛结束后，选择酶活性较高的淡水真菌菌株作为试验菌株；通过单因素预实验结果，分别确定3种不同的碳源、氮源和pH值，采用3因素3水平正交试验，接种量为10％。
进一步，所述纤维素酶培养基，由羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g以及水1000ml组成。
在促产酶发酵培养基的设计与优化过程中，除了要考虑微生物生长所需的基本营养要素外，还要从水生真菌生长条件出发，合理设计发酵环境参数。由于进行发酵的菌株不同、生长阶段不同，并且所使用的发酵工艺的差异，导致发酵所选择的培养基不尽相同，但一般都含有碳(C)、氮(N)这两种基本元素。C、N为水生真菌的生长以及产酶提供了物质和能量基础。碳源主要为细胞提供能源，组成菌体细胞成分的碳架(蛋白质、糖类、脂类、核酸等)，构成代谢产物。在水生真菌发酵过程中，本实验选择麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和乳糖作为碳源物质。氮源的主要作用是维持胞内需氮化合物的合成，比如氨基酸、蛋白质和核酸等。因无机氮源发挥作用快，可迅速被细胞分解吸收，称为速效氮源，可满足微生物生长初期的氮源需求，包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等。有机氮源包括玉米浆、各种有机粉饼等物质。有机氮源只有被细胞水解后才会发挥作用，水解过程比较缓慢，细胞对蛋白的利用速度也比较慢，所以这类氮源常被称为迟效氮源。本试验主要选用无机氮源进行筛选，探究到底哪种氮源最适合水生真菌发酵产酶，以达到纤维素酶生产的最好经济效益。
pH值的稳定是在菌株进行发酵中保持最佳状态的必要条件。pH值与细胞的生理状态息息相关，能够影响微生物的生长繁殖及新陈代谢活动，调节其产酶活性。因此，pH值是影响菌株生长、纤维素酶生产的关键因素之一。本实验根据水生真菌原生境的pH条件，设置4.0、5.0、6.0、7.0、8.0这5个pH值进行筛选实验，探究适合水生真菌产纤维素酶最适的酸碱环境。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的高产纤维素酶的菌株的发酵方法，以澜沧江上、中、下游采集得到的120株淡水真菌菌株作为试验材料，通过正交试验设计，筛选出产纤维素酶活性较高的菌株，并对其发酵条件进行探究，确定纤维素分解菌生长最适的碳源、氮源和pH值，最大限度地优化澜沧江流域产酶菌种的培养条件，进一步提高纤维素酶产量，降低淡水真菌菌株培养的成本，为澜沧江流域淡水真菌资源开发与利用提供一定的理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的高产纤维素酶的菌株的发酵方法流程图。
图2是本发明实施例提供的高产纤维素酶的菌株的发酵方法原理图。
图3是本发明实施例2提供的葡萄糖浓度(mg/ml)标准曲线示意图。
图4是本发明实施例2提供的能产纤维素酶的淡水真菌菌株示意图；
图中：a.3LC7-10-2；b.3LA7-20-1；c.3LH8-4-1；d.2XZH1-7-1；e.XZH1-9-1；f.XZA22-10-1；g.2LH6-1-1；h.2LA4-20-1；i.2LA4-29-1。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的高产纤维素酶的菌株的发酵方法包括以下步骤：
S101，进行水生真菌的采集、分离培养与纯化；
S102，进行产纤维素酶菌株的初筛(水解圈法)；
S103，进行产纤维素酶菌株的复筛(紫外可见分光光度法)；
S104，进行产酶条件的优化。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：淡水真菌产酶特性及发酵条件优化研究
1、发明概述
以澜沧江上、中、下游采集得到的120株淡水真菌菌株作为试验材料，首先是单因素试验，筛选出菌株能生长且以纤维素酶为目标物质的碳源、氮源、pH值这3个基本的环境参数。再根据不同环境参数对于目标物质产量影响的大小，确定显著因素，通过3因素3水平正交试验，以期筛选出摇瓶发酵的最佳培养参数，使纤维素酶的产量达到最高，同时为以后的工厂化液体发酵生产提供理论依据。
淡水真菌菌株来自国家自然科学基金面上项目“横断山南段三江并流区水生真菌地理分布格局及形成机制NSFC31970021”的采样、保存的淡水真菌菌种。
2、研究内容
(1)水生真菌样品采集、分离培养与纯化保存
在澜沧江上、中、下游不同河段进行采样。将采集到的样品在实验室条件下进行镜检，并利用PDA培养基进行分离培与纯化，低温保存备用。
(2)筛选产纤维素酶活性高的淡水真菌菌株
通过透明圈法进行产纤维素酶菌株的初筛，然后将菌株接入液体发酵培养基，提取粗酶液，利用紫外可见分光光度计测定酶活进行复筛，筛选出相对高效的产酶菌株。
(3)探究液体发酵产酶的最适培养条件
通过单因素预实验进行培养条件的筛选，以效果较好的3种碳源、氮源以及pH值进行三因素三水平的正交试验，进一步优化产酶条件。
3、研究方案
3.1试验材料
3.1.1试验菌株
澜沧江从河道源头到昌都为上游(海拔高度≥2500m)，从昌都到功果桥为中游(海拔高度1500～2500m)，从功果桥到勐腊为下游(海拔高度≤1500m)。在澜沧江上、中、下游不同河段进行采样，沿溪流采集中直径约1～5cm、长20～30cm的水生腐木样品，放入自封袋内，并在袋子上标记采集地点，经纬度、海拔、温度以及pH值。
在实验室条件下，利用保湿培养法将样品常温(25℃)保存1周后，在GL-99BI连续变倍体视镜下，用接种针将腐木上的菌体挑出，做成水封片进行镜检。在OLYMPUSBX51显微镜下观察并记录其菌丝体、孢子梗形态(或子囊形态，侧丝等)、产孢结构以及分生孢子形态。在无菌条件下，利用单孢挑取法在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上划数条线，使孢子尽量分散，置于25℃培养1d后，将平皿置于双目解剖镜下找到单孢菌落，用无菌移菌环挑取单孢菌落，移到PDA培养基斜面上培养7-10d，即形成新的单孢菌株，再低温保存备用。
通过获得的菌株照片，对其孢子梗形态(或子囊形态，侧丝等)、产孢结构，分生孢子形态进行测量和形态学的初步鉴定(待后期分子生物学鉴定)。
3.1.2培养基
(1)PDA培养基：马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8.5g，蒸馏水500ml，121℃灭菌30min。
(2)纤维素酶初筛培养基(又称纤维素刚果红培养基)：羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30min。
(3)液体发酵培养基：羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，水1000ml，121℃灭菌30min。
3.2试验方法
3.2.1产纤维素酶菌株的初筛
在无菌操作台上，用直径5mm的打孔器在长势良好的纯培养菌株上取下直径为5mm的活化菌株，接种在纤维素刚果红培养基上，于28℃恒温培养10d，观察菌株周围是否能产生水解圈，若产生水解圈则说明此菌株能分泌纤维素酶；测定菌落直径d和水解圈直径D，单位cm，用HC表示水解能力，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000101
3.2.2产纤维素酶菌株的复筛
(1)粗酶液制备
从PDA平板上用接种针挑取活化的淡水真菌菌株无性孢子，在无菌条件下，接种于装有10ml无菌水的三角瓶中，置于摇床振荡，将孢子打散。在显微镜下用血球计数板计数，并用无菌水调整孢子浓度为1×107CFU/ml；将10.0ml孢子悬液液接种于装有90ml液体发酵培养基的锥形瓶中，接种量为10％。将发酵瓶放置于28℃、200r/min摇床上振荡培养10d；发酵结束后，取发酵液2～5ml，在4℃的低温条件下，1500r/min高速离心，取上清液即为粗酶液。
(2)纤维素酶活性测定
初筛得到的菌株，进行产酶发酵试验，利用紫外分光光度计，测定粗酶液中的羧甲基纤维素(CMC)酶活性，筛选出产酶活性较高的菌株。
CMC酶活：1％浓度的CMC-Na溶液1.5ml加入试管中，放置在水浴锅中，设定温度为50℃，预热3min，随后加入0.5ml粗酶液，在50℃条件下酶解1h，后立即加入3mlDNS试剂，沸水浴7min后流动冷水冷却，加蒸馏水10ml，测得520nm处的OD值；设对照组，其他条件不变，酶解温度改为100℃，灭酶活为对照，以产葡萄糖的量为计量单位。
在pH值4.8，温度为50℃条件下时，1ml粗酶液每h酶解底物产生1umol葡萄糖，即为1个酶活力单位，用U来表示，单位umol/(ml.h)，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000111
式中，N表示粗酶液稀释的倍数；G表示依据OD值代入标准方程计算得到的对应葡萄糖量，单位mg；t表示测酶活时酶解反应时间，单位min；n表示反应液中加入的稀释后粗酶液，单位ml；180表示葡萄糖的摩尔质量。
3.2.3产酶条件优化
在复筛结束后，本发明选择酶活性较高的淡水真菌菌株作为试验菌株。
(1)单因素优化试验
碳源：以硫酸铵为氮源，分别以0.2％羧甲基纤维素钠、玉米粉、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为发酵培养基的碳源。将水生真菌菌落接种于发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种碳源作为正交实验的碳源。
氮源：以羧甲基纤维素钠为碳源，分别以0.2％氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵和尿素作为氮源进行筛选。接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种氮源作为正交试验的氮源。
pH值：以发酵培养基为基础培养条件，分别调节pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，将水生真菌菌落接种于发酵培养基上，培养10d，测定酶活，在酶活较高的pH值区间内分别设置3个pH值进行正交实验。
(2)正交优化试验
通过单因素实验结果，分别确定3种不同的碳源、氮源和pH值，采用3因素3水平正交试验(接种量为10％)。
4、技术路线(见图2)
实施例2：澜沧江产纤维素酶淡水真菌筛选及发酵条件优化
1、发明概述
目的：从澜沧江流域采集到的120株淡水真菌中筛选具有产纤维酶能力的菌株，并对高产纤维素酶菌株进行发酵条件优化，以期为澜沧江流域淡水真菌资源开发与利用提供一定的理论依据。方法：通过水解圈法进行产酶菌株的初筛，采用紫外可见分光光度法测定纤维素酶活性进行高产酶菌株的复筛，通过正交实验对发酵培养条件进行优化探究。结果：在澜沧江流域的120株淡水真菌中筛选出选出56株能产纤维素酶的淡水真菌，且筛选出来的产纤维素酶的菌株数量由大到小依次为下游段>中游段>上游段；复筛得到具有高产酶能力的3株淡水真菌编号分别为3LC7-10-2、3LA7-20-1和3LH8-4-1，针对这3株菌进行产酶发酵条件优化。结果表明，菌株3LA7-20-1与3LC7-10-2产纤维素酶的最适培养条件一致：碳源为麦芽糖，氮源为硝酸钠，初始pH值为8.0；菌株3LH8-4-1产纤维素酶的最适培养条件：碳源为玉米粉，氮源为硫酸铵，初始pH值为7.0。
结论：澜沧江流域的淡水真菌中筛选出56株能产纤维素酶的菌株，3株高产酶菌株(3LA7-20-1、3LC7-10-2和3LH8-4-1)的最适发酵培养条件中，碳源分别为麦芽糖与玉米粉，氮源分别为硝酸钠和硫酸铵，培养环境为中性至微碱环境(7.0～8.0)。
本发明通过对澜沧江流域淡水真菌产纤维素酶的菌株进行筛选，旨在发掘具有高产纤维素酶活性的淡水真菌资源，并进一步优化发酵培养条件，以期为淡水真菌资源开发与利用提供一定的理论依据。
2、材料与方法
2.1材料
2.1.1试验菌株
实验菌株均由大理大学水生真菌实验室提供。澜沧江从河道源头到昌都为上游段(海拔高度≥2500m)，从昌都到功果桥为中游段(海拔高度1500～2500m)，从功果桥到勐腊为下游段(海拔高度≤1500m)。本实验按照海拔高度不同，分别从澜沧江上游段、中游段、下游段采样，各得到40株淡水真菌菌株，共120株作为实验菌株(见表1)。
表1供试菌株编号
Figure BDA0003745916390000131
Figure BDA0003745916390000141
2.1.2培养基
(1)PDA培养基：马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8.5g，蒸馏水500ml，121℃灭菌30min。
(2)纤维素酶初筛培养基(又称纤维素刚果红培养基)：羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30min。
(3)液体发酵培养基：羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，水1000ml，121℃灭菌30min。
2.2方法
2.2.1产纤维素酶菌株的初筛
在无菌操作台上，用直径5mm的打孔器在长势良好的纯培养菌株上取下直径为5mm的活化菌株，接种在纤维素刚果红培养基上，于28℃恒温培养10d，观察菌株周围是否能产生水解圈，若产生水解圈则说明此菌株能分泌纤维素酶；测定菌落直径d和水解圈直径D，单位cm，用HC表示水解能力，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000151
2.2.2产纤维素酶菌株的复筛
(1)粗酶液制备
从PDA平板上用接种针挑取活化的淡水真菌菌株无性孢子，在无菌条件下，接种于装有10ml无菌水的三角瓶中，置于摇床振荡，将孢子打散。在显微镜下用血球计数板计数，并用无菌水调整孢子浓度为1×107CFU/ml；将10.0ml孢子悬液液接种于装有90ml液体发酵培养基的锥形瓶中，接种量为10％。将发酵瓶放置于28℃、200r/min摇床上振荡培养10d；发酵结束后，取发酵液2～5ml，在4℃的低温条件下，1500r/min高速离心，取上清液即为粗酶液。
(2)纤维素酶活性测定
利用紫外分光光度计，测定粗酶液中的羧甲基纤维素(CMC)酶活性，具体操作步骤如下：
测定葡萄糖标准曲线：分别取0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL葡萄糖标准溶液(mg·ml-1)于试管中，加蒸馏水至2ml，随后加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂2ml，沸水中煮沸5min，冷却后加蒸馏水定容至20ml。空白以0ml为调零点，在紫外可见分光光度计540nm波长下测吸光值，根据其结果绘制葡萄糖标准曲线(见附图3)。葡萄糖浓度标准曲线回归方程为y＝0.3827x+0.0464(R2＝0.9762)。
CMC酶活：1％浓度的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1.5ml加入试管中，放置在水浴锅中，设定温度为50℃，预热3min，随后加入0.5ml粗酶液，在50℃条件下酶解1h，后立即加入3mlDNS试剂，沸水浴7min后流动冷水冷却，加蒸馏水10ml，测得520nm处的OD值；设对照组，其他条件不变，酶解温度改为100℃，灭酶活为对照，以产葡萄糖的量为计量单位。
在pH值4.8，温度为50℃条件下时，1ml粗酶液每h酶解底物产生1umol葡萄糖，即为1个酶活力单位，用U来表示，单位μmol·ml-1·h-1，计算公式如下：
Figure BDA0003745916390000161
式中，N表示粗酶液稀释的倍数；G表示依据OD值代入标准方程计算得到的对应葡萄糖量，单位mg；t表示测酶活时酶解反应时间，单位min；n表示反应液中加入的稀释后粗酶液，单位ml；180表示葡萄糖的摩尔质量。
2.2.3产酶条件优化
在复筛结束后，本发明选择酶活性较高的淡水真菌菌株作为试验菌株。
(1)单因素优化试验
碳源：以硫酸铵为氮源，分别以0.2％羧甲基纤维素钠、玉米粉、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为发酵培养基的碳源。将水生真菌菌落接种于发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种碳源作为正交实验的碳源。
氮源：以CMC-Na为碳源，分别以0.2％氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵和尿素作为氮源进行筛选。接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种氮源作为正交试验的氮源。
pH值：以发酵培养基为基础培养条件，分别调节pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，将水生真菌菌落接种于发酵培养基上，培养10d，测定酶活，在酶活较高的pH值区间内分别设置3个pH值进行正交实验。
(2)正交优化试验
根据单因素筛选的结果，选择碳源、氮源和pH作为正交试验的3因素，并选定对酶活影响较大的每个因素中的3组数据作进行3因素3水平的正交优化试验(L933)(见表2)，每个处理10个重复。
表2正交实验表
Figure BDA0003745916390000171
2.3数据处理
使用Adobe Photoshop CS6对图片进行裁剪、拼图处理，Microsoft Excel 2010对数据进行统计分析，利用SPSS(22.0)软件进行数据的显著性差异分析(卡方检验，Duncan-t检验，p<0.05)。
3、结果与分析
3.1产纤维素酶菌株的初筛
通过水解圈法对120株淡水真菌菌株进行能产纤维素酶菌株的初步筛选。如表3所示，共筛选出56株能产纤维素的淡水真菌，其余64株在纤维素培养基上无明显透明圈。产酶菌株较多的是澜沧江下游区段采集得到的样本。
表3产纤维素酶的淡水真菌菌株初筛结果
Figure BDA0003745916390000181
Figure BDA0003745916390000191
注：HC≥25(高酶活)；HC：15-25(中酶活)；HC≦15(低酶活)。
如附图4所示，编号为3LC7-10-2、3LA7-20-1、3LH8-4-1、2XZH1-7-1、XZH1-9-1、XZA22-10-1、2LH6-1-1、2LA4-20-1、2LA4-29-1这9株菌株具有较明显的纤维素酶水解圈。
透明圈的大小在一定程度上可以反映酶活性的高低，但是却不能完全代表菌株产酶能力的强弱。因此，在选择菌株时不能以透明圈的大小作为唯一标准。因此，要筛选出产酶能力较强的菌株还需要用液体发酵培养法结合紫外可见分光光度法测定菌株产酶活力大小，以选出最终的目的菌株。
3.2高产纤维素酶菌株复筛
根据初筛结果，分别在澜沧江上、中、下游各选出酶活较高的3株菌，3LC7-10-2、3LA7-20-1、3LH8-4-1、2XZH1-7-1、XZH1-9-1、XZA22-10-1、2LH6-1-1、2LA4-20-1、2LA4-29-1这9株菌株进行高产纤维素酶淡水真菌的复筛。表4为产纤维素酶酶的淡水真菌复筛结果。
结果表明，9株淡水真菌的纤维素酶活性在0.244～1.031之间，3LC7-10-2、3LA7-20-1和3LH8-4-1这3株菌的纤维素酶活性显著高于其它菌株(p<0.05)。本试验综合考虑水解能力的大小及产酶能力的高低，最终选择下游段3LC7-10-2、3LA7-20-1和3LH8-4-1这3株菌株作为目的菌株。
表4复筛菌株的纤维素酶活性
Figure BDA0003745916390000201
注：不同字母代表显著性差异水平(p<0.05)，n＝3。
3.3培养基成分单因素筛选
如表5所示，产纤维素酶菌株的单因素筛选结果如下：
3.3.1菌株3LA7-20-1
碳源：以麦芽糖为唯一碳源时，菌株3LA7-20-1的酶活最高，其次是羧甲基纤维素钠和玉米粉。因此选择麦芽糖、羧甲基纤维素钠和玉米粉作为菌株3LA7-20-1进行正交试验的碳源。
氮源：以硝酸钠为唯一氮源时其产纤维素酶的活力最高，其次是硝酸铵和硫酸铵。因此选择硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵作为菌株3LA7-20-1进行正交试验的氮源。
pH值：当pH值在4.0～8.0之间时，菌株3LA7-20-1的酶活呈上升趋势，在pH值为8.0时的酶活最高，其次是pH值为7.0和6.0时，所以选择菌株3LA7-20-1正交实验时的pH值为6.0、7.0、8.0。
3.3.2菌株3LC7-10-2
碳源：以羧甲基纤维素钠为唯一碳源时，菌株3LA7-20-1的酶活最高，其次是麦芽糖和葡萄糖，所以在进行正交实验时，选择了羧甲基纤维素钠、麦芽糖及葡萄糖作为碳源。
氮源：以氯化铵为唯一氮源时，菌株3LA7-20-1酶活最高，其次是硝酸铵和硫酸铵，所以在进行正交实验时，选择了氯化铵、硝酸铵和硫酸铵作为菌株3LA7-20-1的氮源。
pH值：当pH值在4.0～8.0之间时，菌株3LC7-10-2的酶活呈上升趋势，在pH值为8.0时其产酶活性最高，其次是pH值为6.0和7.0时，所以选择菌株3LC7-10-2正交实验时的pH值为6.0、7.0、8.0。
3.3.3菌株3LH8-4-1
碳源：以麦芽糖为唯一碳源时，菌株3LH8-4-1的酶活最高，其次是羧甲基纤维素钠和玉米粉，所以在进行正交实验时，选择了麦芽糖、羧甲基纤维素钠和玉米粉作为碳源。
氮源：以硝酸钠为唯一氮源时其酶活最高，其次是硫酸铵和硝酸铵，所以在进行正交实验时，选择了硝酸钠、硫酸铵和硝酸铵作为菌株3LH8-4-1氮源。
pH值：当pH值在4.0～8.0之间时，菌株3LH8-4-1的酶活呈上升趋势，在pH值为8.0时其产酶活性最高，其次是在pH值为6.0和7.0时，所以选择菌株3LH8-4-1正交实验时的pH值为6.0、7.0、8.0。
表5高产纤维素酶菌株的液体发酵培养基成分单因素筛选
Figure BDA0003745916390000221
3.4正交优化试验
根据单因素预实验的结果，采用对纤维素酶活性影响较大的3个变量进行L933正交实验，设置9种处理，每个处理3个重复，并计算平均值，确定最佳的高产酶培养基成分组合。
3.4.1菌株3LA7-20-1产酶培养基筛选的正交试验结果
根据发酵培养基成分单因素筛选结果，以麦芽糖、羧甲基纤维素钠和玉米粉作为碳源，以硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵作为氮源，6.0、7.0、8.0作为pH值筛选条件，进行三因素三水平L9(33)正交实验(见表6)，每个处理重复三次。
表63LA7-20-1产酶培养基的正交试验因素
Figure BDA0003745916390000231
正交试验极差(R)分析可知，R(碳源)＞R(氮源)＞R(pH)，影响3LA7-20-1菌株纤维素酶活的最大因素是碳源类型，其次是氮源类型、初始pH值(表7)。根据K值可知，菌株3LA7-20-1产纤维素酶的最适培养条件为碳源为麦芽糖，氮源为硝酸铵，初始pH值为8.0，此条件在正交表内，为处理5。在处理5条件下，菌株3LA7-20-1产纤维素酶活性最高，为5.843U/ml，显著高于其它处理(p<0.05)。结果表明，菌株3LA7-20-1产纤维素酶的最适培养条件：碳源为麦芽糖，氮源为硝酸铵，初始pH值为8.0。
表7菌株3LA7-20-1产酶培养基的正交试验结果
Figure BDA0003745916390000232
注：Ki值表示第i列因素m水平所对应的试验指标之和，R表示第i列因素的极差，酶活水平的不同字母代表显著性差异水平(p<0.05)，n＝3，下同。
3.4.2菌株3LC7-10-2产酶培养基筛选的正交试验结果
根据发酵培养基成分单因素筛选结果，以羧甲基纤维素钠、麦芽糖及葡萄糖作为碳源，以氯化铵、硝酸铵和硫酸铵作为氮源，6.0、7.0、8.0作为pH值筛选条件，进行三因素三水平L9(33)正交试验(表8)，每个处理重复三次。
表8菌株3LC7-10-2产酶培养基的正交试验因素
Figure BDA0003745916390000241
由表9中的R值可知，R(碳源)＞R(氮源)＞R(pH)，影响菌株3LC7-10-2纤维素酶活的最大因素是碳源类型，其次是氮源类型、初始pH值。根据K值可知，菌株3LC7-10-2产纤维素酶的最适培养条件：碳源为麦芽糖，氮源为硝酸铵，初始pH值为8.0，此条件在正交表内(处理7)。如表9所示，在处理7条件下，菌株3LC7-10-2的纤维素酶活性最高，为4.974U/ml，显著高于其它处理(p<0.05)。结果表明，菌株3LC7-10-2产纤维素酶的最适培养条件：碳源为麦芽糖，氮源为硝酸铵，初始pH值为8.0。
表9菌株3LC7-10-2产酶培养基的正交试验结果
Figure BDA0003745916390000251
3.4.3菌株3LH8-4-1产酶培养基筛选的正交试验结果
根据发酵培养基成分单因素筛选结果，以麦芽糖、羧甲基纤维素钠和玉米粉作为碳源，以硝酸钠、硫酸铵和硝酸铵作为氮源，6.0、7.0、8.0作为pH值筛选条件，进行三因素三水平L9(33)正交实验(见表10)，每个处理重复三次。
表10菌株3LH8-4-1产酶培养基的正交试验因素
Figure BDA0003745916390000252
由表11中的R值可知，R(碳源)＞R(氮源)＞R(pH)，影响菌株3LH8-4-1纤维素酶活的最大因素是碳源类型，其次是氮源类型、初始pH值。根据K值可知，菌株3LH8-4-1产纤维素酶的最适培养条件为碳源为玉米粉，氮源为硫酸铵，初始pH值为7.0，此条件在正交表内(处理9)。如表11所示，在处理9条件下，菌株3LH8-4-1的纤维素酶活性最高，为5.264U/ml，显著高于其它处理(p<0.05)。结果表明，菌株3LH8-4-1产纤维素酶的最适培养条件：碳源为玉米粉，氮源为硫酸铵，初始pH值为7.0。
表11菌株3LH8-4-1产酶培养基的正交试验结果
Figure BDA0003745916390000261
淡水真菌因为其生长的水生生态环境与其他生态环境不同，所以其代谢途径也和其他生物具有很大不同，这便让尚未大规模发掘的淡水真菌成为重要的可开发利用的生物资源。在前期研究中，本发明就已发现在澜沧江流域中淡水真菌的种类与数量非常丰富，是开展水生真菌开发与利用研究的理想样地。通过对澜沧江流域上、中、下游地区产纤维素酶淡水真菌菌株进行筛选，比较其产纤维素酶能力强弱，结果表明120株菌株中有56株能产纤维素酶，且筛选出来的产纤维素酶的菌株数量为下游段>中游段>上游段。在初筛结果中产酶能力较强的菌株在复筛结果中其产酶能力也较强，且复筛得到的3株高产酶菌株均为澜沧江下游段采集得到。由于不同流域的海拔、气候以及人类干扰等因素，导致水体环境条件存在差异，下游水环境较为复杂，淡水真菌的生物多样性更加丰富，其代谢途径、产能途径也呈多样化。
正交试验结果表明，3株高产酶菌株(3LA7-20-1、3LC7-10-2和3LH8-4-1)的最适发酵培养条件中，碳源分别为麦芽糖与玉米粉，氮源分别为硝酸钠和硫酸铵，培养环境为中性至微碱环境(7.0～8.0)。在淡水真菌的生长环境中，含碳、氮丰富的营养物质是其主要的食物来源，水生环境中氮、碳以及酸碱值的变化会对淡水真菌的生理代谢水平产生显著影响，因而影响其产纤维素酶的能力。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述高产纤维素酶的菌株发酵方法包括以下步骤：
步骤一，进行试验菌株采样以及接种培养；
步骤二，进行粗酶液的制备；
步骤三，进行产纤维素酶菌株的筛选；
步骤四，进行产酶条件的优化。
2.如权利要求1所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，步骤一中，所述试验菌株采样以及接种培养，包括：
分别从上、中、下游采样得到淡水真菌菌株作为试验菌株；将已保存的试验菌株接种在PDA培养基上，于28℃下进行恒温培养5～7d，备用。
3.如权利要求2所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述PDA培养基，由马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8.5g以及蒸馏水500ml组成。
4.如权利要求1所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，步骤二中，所述粗酶液的制备，包括：
(1)从PDA平板上用接种针挑取活化的淡水真菌菌株无性孢子，在无菌条件下，接种于装有10ml无菌水的三角瓶中，置于摇床振荡，将孢子打散；
(2)在显微镜下用血球计数板计数，并用无菌水调整孢子浓度为1×107CFU/ml；将10.0ml孢子悬液液接种于装有90ml液体发酵培养基的锥形瓶中，接种量为10％；
(3)将发酵瓶放置于28℃、200r/min摇床上振荡培养10d；发酵结束后，取发酵液2～5ml，在4℃的低温条件下，1500r/min高速离心，取上清液即为粗酶液。
5.如权利要求4所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述纤维素酶初筛培养基(又称纤维素刚果红培养基)，配方为羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌30min。
6.如权利要求1所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，步骤三中，所述产纤维素酶菌株的筛选，包括：
(1)初筛
在无菌操作台上，用直径5mm的打孔器在长势良好的纯培养菌落上取下5mm的菌饼，接种在纤维素刚果红培养基上，于28℃恒温培养10d，观察菌株周围是否能产生水解圈，若产生水解圈则说明此菌株能分泌纤维素酶；测定菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，用HC表示水解能力，计算公式如下：
Figure FDA0003745916380000021
(2)复筛
初筛得到的菌株，进行产酶发酵试验，测定粗酶液中的羧甲基纤维素(CMC)酶活性，筛选出产酶活性较高的菌株；
CMC酶活：1％浓度的CMC-Na溶液1.5ml加入试管中，放置在水浴锅中，设定温度为50℃，预热3min，随后加入0.5ml粗酶液，在50℃条件下酶解1h，后立即加入3ml3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，沸水浴7min后流动冷水冷却，加蒸馏水10ml，测得520nm处的OD值；设对照组，其他条件不变，酶解温度改为100℃，灭酶活为对照，以产葡萄糖的量为计量单位；
在pH值4.8，温度为50℃条件下时，1ml粗酶液每h酶解底物产生1umol葡萄糖，即为1个酶活力单位，用U来表示，单位umol/(ml.h)，计算公式如下：
Figure FDA0003745916380000022
式中，N表示粗酶液稀释的倍数；G表示依据OD值代入标准方程计算得到的对应葡萄糖量，单位mg；t表示测酶活时酶解反应时间，单位min；n表示反应液中加入的稀释后粗酶液，单位ml；180表示葡萄糖的摩尔质量。
7.如权利要求1所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，步骤四中，所述产酶条件优化，包括：
通过单因素预实验进行培养条件的筛选，以效果较好的3种碳源、3种氮源以及3个pH值进行三因素三水平的正交试验(33)，优化产酶条件。
8.如权利要求7所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述发酵产酶单因素优化试验，包括：
碳源：设羧甲基纤维素钠、玉米粉、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖这5种化合物作为液体发酵培养基配方中的碳源进行筛选；将初筛得到的高产酶菌株接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种碳源作为正交试验的碳源；
氮源：设氯化铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵和尿素这5种化合物作为液体发酵培养基配方中的氮源进行筛选；将初筛得到的高产酶菌株接种于液体发酵培养基上，培养10d，测定酶活，选择酶活较高的3种氮源作为正交试验的氮源；
pH值：调节培养基的酸碱值，分别设pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，进行pH值优化筛选；在酶活较高的pH之间分别设置3个酸碱度梯度进行正交试验。
9.如权利要求8所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述纤维素酶培养基，由羧甲基纤维素钠2.0g，硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1.0g，氯化钠0.5g，刚果红0.4g，琼脂20g以及水1000ml组成。
10.如权利要求7所述高产纤维素酶的菌株的发酵方法，其特征在于，所述发酵产酶正交优化试验，包括：
在复筛结束后，选择酶活性较高的淡水真菌菌株作为发酵条件优化的试验菌株；通过单因素预实验结果，分别确定3种不同的碳源、氮源和pH值，采用3因素3水平正交试验(33)，接种量为10％，每个处理3个重复。
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