KR20150138998A - 높은 활성의 셀룰로스 분해 효소를 가지는 신규 균주 아칸소피지움 속 kmf001 - Google Patents

높은 활성의 셀룰로스 분해 효소를 가지는 신규 균주 아칸소피지움 속 kmf001 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 셀룰로스 분해 활성을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase) 생성능을 가지는 신규 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주 및 그 배양액에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주는 높은 활성의 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase) 등의 셀룰로스 분해효소를 생산할 수 있어 목질계바이오매스의 당화 뿐 아니라, 펄프·제지 산업, 세제산업, 농산물 가공 등 셀룰로스 분해가 필요한 다양한 산업분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

높은 활성의 셀룰로스 분해 효소를 가지는 신규 균주 아칸소피지움 속 KMF001 {Novel Acanthophysium sp. KMF001 having high cellulase activity}
본 발명은 높은 셀룰로스 분해 활성을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase) 생성능을 가지는 신규 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 및 그 배양액에 관한 것이다.
미국과 EU등 선진국은 향후 2017~2030년까지 휘발유 소비의 20~30%를 줄이고 바이오 연료 사용을 확대하겠다고 발표하였으며 현재 미국, 브라질과 같은 나라에서는 자국의 풍부한 바이오매스인 사탕수수 또는 옥수수를 원료로 한 바이오 에탄올이 이미 상용화되어 수송용 대체연료로 상당량 이용되고 있다.
또한 한국바이오에너지협회에 따르면 바이오디젤 제조에 사용된 폐식용유 양은 2012년 12만 1000t에 달했으며, 2013년에는 15만 3000t의 폐식용유가 바이오디젤 원료로 사용된 것으로 추정되었다. 이에 따라 제2세대 에너지 원료로 목질계 바이오매스가 부상되고 있으며 목질계를 이용한 바이오연료 제조에 관심이 고조되고 있다. 목질계 바이오매스는 한 해 100~500억 톤 정도 발생하고 재생 가능한 자원이라는 장점이 있지만, 성장 속도가 느리고 리그닌과 결합되어 있는 셀룰로스의 분해가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 고효율의 셀룰로스 분해효소 개발연구는 필히 필요하며, 5~10년 내에 상용 가능할 것으로 기대되어 잠재력이 매우 큰 시장이라 할 수 있겠다. 또한 2012년 한국균학회지 발표에 따르면 바이오에너지 생산과정에 사용되는 당화효소는 세계 산업용 효소 시장의 11%를 형성하고 있어 목질 셀룰로스 분해효소의 가치가 새롭게 대두되고 있다.
셀룰로스 분해효소들은 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 페니실리움 퍼니커로섬(Penicillium funiculosum) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)와 같은 균류를 이용한 실증형이나 상용화 규모로 생산되고 있다. 이 외에도 악시도더머스 셀루로이티커스(Acidothermus cellulolyticus), 마이크로 모노스포라 비스포라(Micro monospora bispora), 바실러스(Bacillus) 속, 사이토페가(Cytophaga) 속, 스트렙토미스스 스텔코라리엄(Streptomyces stercorarium), 크로스트리디엄 더모셀럼(Clostridium thermocellum) 및 루미노코커스 앨버스(Ruminococcus albus) 등의 박테리아에서 생산되는 효소들이 이용될 수 있다.
트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)는 매우 성공적 셀룰로스 분해효소로 알려져 있으며 이들 효소는 효소당화조건에서 안정적이고 화학적 억제인자에 대한 저항성이 큰 장점이 있으나 β-glucosidase(BGL)의 활성이 낮은 단점을 가지고 있다(Brian et al, Biotechno. Bioeng. 102:1033-1044, 2009).
이에, 본 발명자들은 높은 활성의 셀룰로스 분해효소 생성능을 가지는 신규 균주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 신규 균주를 분리하고, 상기 균주가 기존 균주 보다 높은 셀룰로스 분해효소를 생산하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 높은 활성의 셀룰로스 분해 효소 생성능을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주 및 그 배양액을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양을 통한 셀룰로스 분해효소의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 균주 유래 셀룰로스 분해효소를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주 배양액을 이용한 셀룰로스의 분해방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 높은 활성의 셀룰로스 분해효소 생성능을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주(기탁번호: KCTC 18282P)를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 균주를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 셀룰로스 분해효소 및 셀룰로스 분해 활성을 가지는, 상기 균주의 배양액을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주의 배양액을 이용하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 분해방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주는 높은 활성의 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase) 등의 셀룰로스 분해 효소를 생산할 수 있어, 목질바이오매스 효소 당화 뿐 아니라, 펄프·제지 산업, 세제공업, 농산물 가공, 섬유 및 반추동물 생산성 등 다양한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주에서 추출한 gDNA를 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동을 통해 band로 나타낸 것이다.
도 2는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 gDNA를 PCR로 증폭시킨 후 증폭산물을 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동을 통해 band로 나타낸 것이다.
도 3은 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 rDNA를 이용하여 계통수를 분석한 결과이다.
도 4는 다양한 탄소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 질소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 pH 조건에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해 활성을 나타낸 것이다.
본 발명에서는 목재부후균으로 알려진 균 중 54개의 균 중에서 세가지 셀룰레이즈(EG, BGL, CBH)의 활성 측정을 통해 복합적으로 가장 높은 수준의 역가를 보인 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001를 분리하였다.
상기 분리된 균주의 28S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 확인하였으며, 보고된 균주들과 염기서열을 비교하는 방법으로 동정한 결과, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 균주임을 확인하였으며, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 이라 명명하였고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 2014년 4월 21일 일자로 기탁번호 KCTC 18282P 번호를 부여받았다.
아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001의 28S rRNA 염기서열을 이용하여 유사종과의 유연관계를 분석한 결과, 아칸소피지움 리비도캐루리움(Acanthophysium lividocaeruleum), 아칸소피셀럼 리비도캐루리움(Acanthophysellum lividocaeruleum), 시로보러스 프러스투레이터스(Xylobolus frustulatus) 및 시로보러스 서브피리어터스(Xylobolus subpileatus)와 98%의 상동성을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 높은 활성의 셀룰로스 분해효소 생성능을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주(기탁번호: KCTC 18282P)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주는 서열번호 1의 28S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰로스 분해효소는 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈(Cellobiohydrolase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주를 배양한 결과, 배양에 의해 분비되는 셀룰로스 분해효소 및 상기 균주의 배양액이 기존 균주 보다 높은 활성의 셀룰로스 분해능을 가진다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주(기탁번호: KCTC 18282P)를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스 분해효소의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 셀룰로스 분해효소에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 셀룰로스(Cellulose), 글루코오즈(Glucose), 락토오즈(Lactose), 셀로바이오즈(Cellobiose), 카르복실메틸 셀루로오즈 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC), 자일란(Xylan), 볏짚, 아비셀(Avicel) 및 상수리로 구성된 군에서 선택되는 탄소원; 펩톤(Peptone), 이스트 익스트랙트(Yeast extract), 트립톤(Trypton), 콘 스팁 파우더(Corn steep powder), 요소(Urea), 이스트:펩톤=0.2:0.8 및 트립톤:이스트=0.7:0.3로 구성된 군에서 선택되는 질소원; 인산이수소칼륨(KH2PO4); 인산수소칼륨(K2HPO4); 및 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 배양은 pH 5.5~6.5 및 22~28℃에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 균주 배양액이 높은 활성의 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (Cellobiohydrolase)를 가지면서 셀룰로스를 분해하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 균주, 상기 셀룰로스 분해효소 또는 상기 균주 배양액을 이용하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 분해방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰로스는 셀룰로스 자체 뿐만 아니라, 볏짚, 목질계 바이오매스, 글루코오즈(Glucose), 락토오즈(Lactose), 셀로바이오즈(Cellobiose), 카르복실메틸 셀루로오즈 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC), 자일란(Xylan), 아비셀(Avicel) 및 상수리 등 셀룰로스를 함유하는 물질이나 재료를 포괄하는 의미이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 균주의 분리
열화 목재로부터 목재부후균으로 알려진 54개의 곰팡이 균을 분리하였고, 이들 중에서 고활성의 셀룰레이즈(Cellulase)를 생산하는 균주를 찾기 위해 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase; EG), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase; BG) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase; CBH) activity를 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하여 균주 선발 시험을 진행하였다. 표 3 내지 표 5에 나타난 바와 같이, 셀룰레이즈 활성을 측정한 결과, EG의 경우, T.KONINGII가 5.58 U/L로 가장 높았으며 GAN이 5.46 U/L, TRR 4.70 U/L, LAS 4.60 U/L, SSU 3.82 U/L, TRV-2 3.42 U/L의 순으로 나타났다. 그러나 두 번째로 EG가 높았던 GAN의 경우 BGL, CBH가 현저히 낮았다. BGL에서는 PEC가 11 U/L로 가장 큰 수치를 나타내었으나 EG에서 현저히 낮은 수치를 나타내었고, SSU 10.96 U/L, LAS, TRV-2, T.KONINGII, PPE가 10.7~10.9 U/L로써 높은 수치를 나타내었다. CBH의 경우, SSU, PPE가 11.14, 11.08 U/L로 가장 높았다. 균주 선별 시험에 사용한 54개의 균주 중 SSU, PPE, PAE를 포함한 7개 균주가 복합적으로 높은 수준의 역가를 나타내었다. 그 중 SSU가 가장 높은 효소 역가를 나타내었다. 표 2는 균주 선별 시험을 위해 사용된 54개의 균주 목록이며, 표 1은 54개의 균주 중 셀룰레이즈 활성이 높은 7개의 균주를 선별하여 나타낸 것이다.
No. Fungi EG(U/L) BGL(U/L) CBH(U/L)
29 SSU 3.82 10.96 11.14
27 PPE 3.22 10.76 11.08
26 PAE 1.70 3.76 0.24
50 T.KONINGII 5.58 10.8 6.6
30 LAS 4.60 10.94 10.6
49 TRR 4.70 8.5 1.04
28 TRV-2 3.42 10.84 0.34
No. Fungi No. Fungi
1 PAR 28 TRV-2
2 DAD-A 29 SSU
3 GLR 30 LAS
4 DAD-B 31 GAN
5 TRH 32 PRH
6 PEC 33 PLC
7 ASN-2 34 PCT
8 CRB 35 PAT
9 GAL 36 PFA
10 STH 37 STB
11 CRC 38 COP-2
12 ASV 39 Fpi001
13 GRF 40 Fpi002
14 TRV-3 41 CHG
15 CPU 42 ASN-1
16 LEE 43 COP-1
17 GAL 44 PLE
18 SEL-2 45 GAB001
19 LAV 46 SEL-1
20 HEC 47 Fpa
21 POC 48 A.PRAECOX
22 COV 49 TRR
23 FOA 50 T.KONINGII
24 FOP 51 T.OBLO.
25 FOF 52 RHN
26 PAE 53 PEC
27 PPE 54 TRV-1
No. Fungi EG U/L) No. Fungi EG U/L)
50 T.KONINGII 5.58 13 GRF 0.6
31 GAN 5.46 11 CRC 0.58
49 TRR 4.70 40 Fpi002 0.58
30 LAS 4.60 10 STH 0.56
29 SSU 3.82 41 CHG 0.56
28 TRV-2 3.42 9 GAL 0.54
27 PPE 3.22 8 CRB 0.50
26 PAE 1.70 6 PEC 0.48
25 PAE 1.64 38 COP-2 0.48
48 A.PRAECOX 1.00 5 TRH 0.44
24 FOP 0.88 4 DAD-B 0.34
23 FOA 0.86 3 GLR 0.32
46 SEL-1 0.86 2 DAD-A 0.30
47 Fpa 0.86 7 ASN-2 0.24
22 COV 0.84 39 Fpi001 0.20
45 GAB001 0.84 1 PAR 0.20
21 POC 0.82 32 PRH N.D.
19 LAV 0.78 33 PLC N.D.
20 HEC 0.78 34 PCT N.D.
17 GAL 0.76 35 PAT N.D.
18 SEL-2 0.76 36 PFA N.D.
15 CPU 0.74 37 STB N.D.
16 LEE 0.74 42 ASN-1 N.D.
44 PLE 0.72 51 T.OBLO. N.D.
14 TRV-3 0.66 52 RHN N.D.
43 COP-1 0.66 53 PEC N.D.
12 ASV 0.6 54 TRV-1 N.D.
1) N.D. : Not Detected
No. Fungi BGL (U/L) No. Fungi BGL (U/L)
53 PEC 11 14 TRV-3 0.04
29 SSU 10.96 39 Fpi001 0.04
30 LAS 10.94 2 DAD-A 0.02
28 TRV-2 10.84 20 HEC 0.02
50 T.KONINGII 10.8 3 SEL-2 0
27 PPE 10.76 6 CPU 0
1 PAR 9.38 8 STH 0
49 TRR 8.5 10 CRB N.D.
36 PFA 8.42 11 CRC N.D.
35 PAT 8.16 12 ASV N.D.
42 ASN-1 5.74 13 GRF N.D.
54 TRV-1 5.3 15 PEC N.D.
34 PCT 4.86 16 LEE N.D.
26 PAE 3.76 18 GLR N.D.
33 PLC 2.52 21 POC N.D.
52 RHN 1.06 22 COV N.D.
31 GAN 0.56 23 FOA N.D.
5 TRH 0.22 24 FOP N.D.
17 GAL 0.22 25 FOF N.D.
51 T.OBLO. 0.2 37 STB N.D.
19 LAV 0.2 38 COP-2 N.D.
41 CHG 0.1 43 COP-1 N.D.
4 DAD-B 0.1 44 PLE N.D.
9 GAL 0.08 45 GAB001 N.D.
7 ASN-2 0.06 46 SEL-1 N.D.
32 PRH 0.06 47 Fpa N.D.
40 Fpi002 0.04 48 A.PRAECOX N.D.
1) N.D. : Not Detected
No. Fungi CBH (U/L) No. Fungi CBH U/L)
29 SSU 11.14 10 STH 0
27 PPE 11.08 32 PRH 0
30 LAS 10.6 3 GLR N.D.
53 PEC 8.36 6 PEC N.D.
50 T.KONINGII 6.6 8 CRB N.D.
1 PAR 2.92 9 GAL N.D.
36 PFA 2.1 11 CRC N.D.
42 ASN-1 1.5 12 ASV N.D.
49 TRR 1.04 13 GRF N.D.
35 PAT 0.68 15 CPU N.D.
34 PCT 0.4 16 LEE N.D.
54 TRV-1 0.34 17 GAL N.D.
33 PLC 0.28 18 SEL-2 N.D.
41 CHG 0.26 21 POC N.D.
26 PAE 0.24 22 COV N.D.
4 DAD-B 0.08 23 FOA N.D.
31 GAN 0.08 24 FOP N.D.
52 RHN 0.08 25 FOF N.D.
19 LAV 0.06 37 STB N.D.
20 HEC 0.04 38 COP-2 N.D.
40 Fpi002 0.04 39 Fpi001 N.D.
2 DAD-A 0.02 43 COP-1 N.D.
5 TRH 0.02 44 PLE N.D.
7 ASN-2 0.02 45 GAB001 N.D.
14 TRV-3 0.02 46 SEL-1 N.D.
28 TRV-2 0.02 47 Fpa N.D.
51 T.OBLO. 0.02 48 A.PRAECOX N.D.
1) N.D. : Not Detected
실시예 2: 균주의 동정
실시예 1에서 분리된 SSU 균주를 동정하기 위하여, 28S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다.
(1) gDNA 추출 및 PCR
실시예 1에서 분리한 균주로부터 gDNA를 추출한 후, PCR을 진행하였다.
Tissue Lyser를 이용하여 상기 균주의 세포를 파괴한 후, Qiagen DNeasy Plasnt Mini kit를 사용하여 gDNA를 추출하였다. 그 후 sequencing에 필요한 충분한 양의 DNA를 얻기 위해 표 6 Internal transcribed spacer(ITS) primer를 사용하여 PCR 증폭을 진행하였다.
Primer name Sequence(5'->3') 서열번호
ITS4(10 pmole/μl) TCCTCCGCTTATTGATATGC 2
ITS5(10 pmole/μl) GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3
그 결과, gDNA의 경우 10,000bp 조금 위쪽에 희미하게 밴드가 나온 것을 확인할 수 있었으며, PCR의 결과 650bp 정도 위치에서 단일 밴드가 나온 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 이 PCR product를 정제하여 sequencing을 진행하였다.
(2) 동정 및 염기서열 분석
BIOFACT 사에 28S rRNA target으로 sequencing을 의뢰한 결과, 상기 SSU 균주는 아칸소피지움 (Acanthophysium) 속 임을 확인하였다. 상기 균주를 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 이라 명명하였으며, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 2014년 4월 21일 일자로 기탁번호 KCTC 18282P 번호를 부여받았다.
아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001의 28S rRNA 염기서열을 NCBI Blast search한 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 아칸소피지움 리비도캐루리움(Acanthophysium lividocaeruleum, AY039314.1), 아칸소피셀럼 리비도캐루리움(Acanthophysellum lividocaeruleum, AF506400.1), 시로보러스 프러스투레이터스(Xylobolus frustulatus, AF506491.1), 아칸소피지움 리비도캐루리움(Acanthophysium lividocaeruleum, AY039319.1) 및 시로보러스 서브피리어터스(Xylobolus subpileatus, AY039309.1) 이상의 5가지 균주와 상동성이 98%인 것으로 나타났으며, 이에 따라 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주는 아직 보고되지 않은 미확인 균주인 것으로 추정된다.
Accession Description Query
coverage		 E-value Max
identity
AY039314.1 Acanthophysium lividocaeruleum 99% 0 98%
AF506400.1 Acanthophysellum lividocaeruleum 99% 0 98%
AF506491.1 Xylobolus frustulatus 99% 0 98%
AY039319.1 Acanthophysium lividocaeruleum 99% 0 98%
AY039309.1 Xylobolus subpileatus 99% 0 98%
(3) 계통수 분석
상기 균주의 동정 결과, 현재 알려져 있는 균주들에 대해서 비슷한 균주는 존재하지만 정확하게 일치하는 결과는 얻지 못하였다. 따라서 동정결과에 나온 균주들과의 계통수 분석을 통해서 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 생물 분류학상의 위치를 확인하였다. 분류학적 위치를 파악하기 위해 MEGA4 프로그램을 이용하였으며, 각 균주의 rDNA를 이용하여 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 이 방법은 각 자료들의 유사도에 근거하여 거리로 표현한 것이며 샘플링을 1000번의 반복으로 통계학적 정확성을 나타낸다. 계통수 분석 결과, NCBI blast 검색으로 98.7%의 정확성을 보인 아칸소피지움 리비도캐루리움 stain MB1825와 다른 가지를 뻗고 있는 것으로 보아 현재까지는 등록되지 않은 신규 균주인 것으로 판단된다.
실시예 3: 균주의 배양 및 배양액 채취
실시예 1에서 분리된 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주와 대조군인 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 Potato Dextrose Agar(PDA)배지에서 각각 3~4일간 성숙배양 시킨 후, Potato Dextrose Broth(PDB) 배지 100 ml에 균사체를 접종하여 22~28℃, 100~180 rpm에서 3~7일간 진탕배양하여, 이를 본 배양에 이용하였다.
본 배양에는 구체적으로, 각각의 균주를 5~11 g/L 펩톤(Peptone), 2~8 g/L 인산이수소칼륨(KH2PO4), 2~8 g/L 인산수소칼륨(K2HPO4), 1~5 g/L 황산마그네슘(MgSO4·7H20), 1~3 g/L 이스트 익스트렉트(Yeast extract) 및 15~25 g/L 셀룰로스(Cellulose, Aldrich, ~20 micron) 조성의 액체배지(pH 5.5)에 넣고, 전 배양액 5%(v/v)을 접종하여 22~28℃, 100~200 rpm에서 2~3주간 배양하였다. 2~3주 동안 배양하면서 매일 배양액을 500 μl씩 회수하여 원심분리 후 상층액만 따로 분리하여 효소 활성 측정에 사용하였다.
실시예 4: 셀룰로스 분해 활성 측정
셀룰로스 분해 활성 측정을 위하여, 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase; EG)의 활성은 환원당을 이용한 somogyi-nelson법을 이용하였고, 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase; BG) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase; CBH)는 파라-니트로페닐(p-nitrophenyl, pNP)기가 붙은 기질인 파라-니트로페닐 글루코스(pNPG) 및 파라-니트로페닐 셀로바이오스(pNPC)를 각각 이용하여 측정하였다.
4-1: 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase; EG)
효소의 반응액은 0.1 M NaAC(Sodium acetate) buffer pH 5.0에 녹인 2%(w/v)의 카르복실메틸 셀룰로스 나트륨(Carboxylmethyl cellulose sodium salt;CMC, Sigma-Aldrich Fine Chemicals, Co) 45 μl에 효소액 5 μl를 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시켰다. 효소반응이 끝나면 구리 시약 50 μl를 넣고 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시킨 다음, 생성된 환원당의 양을 somogyi-nelson 방법으로 측정하였다. 효소활성 단위는 일정 조건하에서 30분간 glucose 1 μmol을 방출하는데 필요한 효소의 양을 1 unit(U)으로 나타내었다.
4-2: 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase; BG)
효소반응액(1 ml)은 0.1 M NaAC buffer(pH 5.0) 0.8 ml에, 10 mM p-nitrophenyl-β-D-glycopyranoside(pNPG, Sigma) 0.1 ml과 효소액 0.1 ml을 가하고 50℃에서 15분간 반응시켰다. 그 후 2 M Na2CO3(Sodium carbonate) 용액 0.1 ml을 가하여 반응을 정지시켜 생성된 p-nitrophenol의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성 단위는 일정 조건하에서 15분간 p-nitrophenol 1 μmol을 방출하는데 필요한 효소의 양을 1 unit(U)으로 나타내었다.
4-3: 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase; CBH)
효소반응액(1 ml)은 0.1 M NaAC buffer(pH 5.0) 0.8 ml에, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside(pNPC, Sigma) 0.1 ml과 효소액 0.1 ml을 가하고 50℃에서 15분간 반응시켰다. 그 후 2 M Na2CO3(Sodium carbonate) 용액 0.1 ml을 가하여 반응을 정지시켜 생성된 p-nitrophenol의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성 단위는 일정 조건하에서 15분간 p-nitrophenol 1 μmol을 방출하는데 필요한 효소의 양을 1 unit(U)으로 나타내었다.
4-4: 셀룰로스 활성 측정 결과
본 발명에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주(KCTC 18282P)와 대조군인 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 셀룰로스 활성을 측정한 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 아칸소피지움 (Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 EG 활성은 3,820 U으로 상업적으로 EG를 생산하는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)와 비슷하였다. 그러나 셀룰로스 분해효소의 다른 두 종류인 BGL과 CBH는 상업용 생산 균주 보다 훨씬 높은 활성을 나타내었으며, 특히 CBH의 경우에는 10배 이상의 활성을 나타내었다. 또한 일반적으로 셀룰로스 분해효소를 생산하는 균주로 알려져 있는 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 비해 매우 높은 셀룰로스 분해 활성을 나타내었다.
구분 엔도-베타-1,4-글루카나아제(EG) 베타-글루코시데이즈(BG) 셀로바이오하이드로레이즈(CBH)
아칸소피지움 (Acanthophysium) 속
(KCTC 18282P)		 3,820 U 10,960 U 11,140 U
트리코더마 리세이
(Trichoderma reesei)		 4,700 U 8,500 U 1,040 U
포미톱시스 팔루스트리스
(Fomitopsis palustris)		 860 U 활성측정 안됨 활성측정 안됨
아스퍼질러스 나이거
(Aspergillus niger)		 240 U 5,740 U 1,500 U
실시예 5: 균주의 셀룰로스 분해효소 생산을 위한 배양조건 최적화 실험
모든 곰팡이들은 탄소원, 질소원, 온도 및 pH 등 여러 배양 조건에 따라서, 기질을 분해하기 위한 셀룰로스 분해효소가 각기 다른 비율로 분비된다. 따라서, 균주가 셀룰로스 분해효소를 잘 분비할 수 있는 배양조건을 최적화 하는 단계가 중요하다. 따라서, 실시예 4에서 높은 활성의 셀룰로스 분해능을 나타낸 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 배양조건을 달리하여 셀룰로스 분해효소 생산을 위한 최적 배양 조건을 탐색하였다.
5-1: 탄소원에 따른 효소 활성
다양한 종류의 탄소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해효소 활성을 측정하였다. 탄소원으로 글루코오즈(Glucose, Duksan), 락토오즈(Lactose, Ducksan), 셀로바이오즈(Cellobiose, Alfa Aesa), 카르복실메틸 셀룰로스 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC, Fluka), 자일란(Xylan, Sigma), 아비셀(Avicel, Fluka), 탈지처리하지 않은 50mesh 상수리나무와 리기다소나무 목분 및 볏짚을 사용하였고, 셀룰로스(Cellulose, Aldrich, ~20micron)를 비교기질로 하였다. 각각의 탄소원 2%(w/v)를 기질로 본배양한 다음, 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase), 셀로바이오하이드로레이즈(Cellobiohydrolase) 및 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase) 활성을 측정하고, 단백질을 정량하였다.
Carbon
soruce		 Enzyme activity(U/ml) Protein
(mg/ml)
EG1) BGL2) CBH3) BXL4)
셀루로스 122.31±6.49 5.85±0.55 0.60±0.01 0.11 0.17±0.01
글루코오즈 1.30±0.87 0.40 0.10 0.19 0.59±0.01
락토오즈 13.74 0.33±0.01 0.03±0.01 0.05 0.08±0.01
셀로바이오즈 38.77±0.21 0.24 0.02 0.04 0.07
CMC 75.95±2.09 0.96±0.02 0.17±0.01 0.07 0.22±0.09
자일란 30.93±1.68 0.73±0.03 0.13±0.03 0.09 0.20±0.01
볏짚 214.13±6.91 2.56 0.49±0.05 0.20±0.01 0.34±0.03
아비셀 107.94±12.57 7.42±0.27 0.27 0.12±0.01 0.15±0.01
상수리 64.84±0.21 0.81±0.01 0.17 0.12 0.22±0.03
리기다 0.63±0.04 0.27±0.01 0.02 0.05 0.10
대조군 0.69 0.24 0.02 0.04 0.14±0.05
1) EG: 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)
2) BGL: 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)
3) CBH: 셀로바이오하이드로레이즈 (Cellobiohydrolase)
4) 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase)
표 9 및 도 4는 다양한 탄소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해 활성을 나타내었다. 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)의 경우, 볏짚에서 214.13±6.91 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였으며, 셀룰로스에서 122.31±6.49 U/ml로 비교적 효소활성이 높게 나타난 것을 확인하였다. 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)의 경우, 아비셀에서 7.42±0.27 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였으며, 셀룰로스에서 5.85±0.55 U/ml로 두 번째로 효소활성이 큰 탄소원으로 확인되었다. 셀로바이오하이드로레이즈 (Cellobiohydrolase)의 경우, 셀룰로스에서 0.60±0.01 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였으며, 볏짚에서 0.49 U/ml로 비교적 효소활성이 높게 나타났다. 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase)의 경우, 볏짚과 셀룰로스에서 다른 탄소원에 비해 조금 높은 활성을 보였지만, 다른 효소들에 비해 특이적으로 높은 활성을 지니지 못한 것을 확인하였다.
결과적으로 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해효소 생산에 이용되는 탄소원으로는 4가지 효소 모두에서 높은 활성을 지니는 셀룰로스가 적합하다고 판단된다.
5-2: 질소원에 따른 효소 활성
다양한 종류의 질소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해효소 활성을 측정하였다. 질소원으로 이스트 익스트랙트(Yeast extract, Duksan), 펩톤(Peptone, Bacto), 트립톤(Trypton, Bacto), 콘 스팁 파우더(Corn steep powder, Sigma), 요소(Urea, Duksan), 황산암모늄(Ammonium sulfate, Duksan), 질산칼륨(Potassium nitrate, Duksan), 질산나트륨(Sodium nitrate, Duksan), 이스트 익스트랙트와 펩톤을 2:8비율로 섞은 것, 이스트 익스트랙와 트립톤을 7:3 비율로 섞은 것을 사용하였다. 탄소원으로는 셀룰로스(Cellulose, Aldrich, ~20micron) 2%(w/v)를 사용하였으며, 질소원을 각각 1%(w/v) 첨가하여 본배양한 다음, 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase), 셀로바이오하이드로레이즈 (Cellobiohydrolase) 및 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase) 활성을 측정하였고, 단백질을 정량하였다.
Carbon
soruce		 Enzyme activity(U/ml) Protein
(mg/ml)
EG1) BGL2) CBH3) BXL4)
이스트 익스트랙트 65.28±9.64 5.54±0.16 0.39±0.01 0.15 0.48±0.06
펩톤 47.95±1.89 6.28±0.09 0.30±0.01 0.12 0.29±0.03
트립톤 45.44±3.35 3.27±0.07 0.20±0.01 0.14 0.36±0.05
콘 스팁 3.20±0.07 0.03 0.03 0.03 0.21
요소 0.54±0.02 0.02 0.01 0.01 0.03
황산 암모늄 2.49±0.14 0.01 0.01 0.01 0.03
질산 칼륨 3.72±0.04 0.01 0.01 0.00 0.03
질산 나트륨 1.21±0.07 0.12 0.02 0.02 0.03
이스트/펩톤
0.2/0.8		 66.17±4.19 7.64±0.08 0.44±0.02 0.16±0.01 0.42
트립톤/이스트
0.7/0.3		 107.49±9.84 12.89±0.18 1.15±0.05 0.33 0.36
1) EG: 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)
2) BGL: 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)
3) CBH: 셀로바이오하이드로레이즈 (Cellobiohydrolase)
4) 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase)
표 10 및 도 5는 다양한 질소원에 따른 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해 활성을 나타내었다. 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)의 경우, 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 트립톤(Tryptone)을 7:3 비율로 섞은 것이 107.49 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였으며, 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 펩톤(Peptone)을 2:8 비율로 섞은 것과 이스트 익스트랙트(Yeast extract)가 각각 66.17 U/ml, 65.28 U/ml로 비교적 효소활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)의 경우, 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)와 마찬가지로 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 트립톤(Tryptone)을 7:3 비율로 섞은 것이 12.89 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였으며, 이스트 익스트랙트(Yeast extract)가 5.54 U/ml로 두 번째로 효소활성이 큰 질소원으로 확인되었다. 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase)의 경우, 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 트립톤(Tryptone)을 7:3 비율로 섞은 것이 1.15 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였다. 베타-1,4-자일로시다제(β-1,4- xylosidase)의 경우, 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 트립톤(Tryptone)을 7:3 비율로 섞은 것이 0.33 U/ml로 가장 큰 효소활성을 보였다.
결과적으로 요소(Urea), 황산암모늄(Ammonium Sulfate), 질산칼륨(Potassium Nitrate) 및 질산나트륨(Sodium Nitrate)을 이용했을 경우, 효소의 활성이 나타나지 않았으며, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주의 셀룰로스 분해효소 생산에 이용되는 질소원으로는 4가지 효소에서 모두 높은 활성을 지니는 이스트 익스트랙트(Yeast extract)와 트립톤(Tryptone)을 7:3 비율로 섞은 질소원이 적합하다고 판단된다.
5-3: pH에 따른 효소 활성
각 효소의 생산성에 미치는 pH 의 영향을 알아보기 위하여 pH 테스트를 pH 4.0~7.0 범위에서 본 배양을 실시하였고, 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈(Cellobiohydrolase) 효소활성을 비교, 분석하였다.
그 결과, pH 6.0에서 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase) 65.08 U/ml, 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 11.73 U/ml 및 셀로바이오하이드로레이즈(Cellobiohydrolase) 3.51 U/ml로 다른 pH 조건 중 효소활성이 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. pH 7.0 에서는 pH 6.0 조건에 비교했을 때, 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase)가 pH 6.0 조건의 71%, 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)는 64% 및 셀로바이오하이드로레이즈(Cellobiohydrolase)는 52% 정도의 활성을 나타내었다. pH가 6.0 보다 감소하는 범위에서는 효소활성이 급격하게 감소하는 추세를 보였으며, 세 가지 효소 모두 급격하게 활성이 낮아져 pH 4.0 조건에서는 90% 이상 감소하는 것을 확인하였다. 그 결과, 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주 배양의 최적 pH 조건은 pH 6.0 이라 판단된다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18282P 20140421
<110> Kookmin university Industry academic cooperation foundation <120> Novel Acanthophysium sp. KMF001 having high cellulase activity <130> P14-B144 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acanthophysium sp. KMF001 <400> 1 agcggaggaa aagaaactaa caaggattcc cctagtaact gcgagtgaag cgggaaaagc 60 tcaaatttaa aatctggcgg cctctggtcg tccgagttgt agtctggaga agcgttttcc 120 gcgttggacc gtgtacaagt ttcctggaac ggagcgtcat agagggtgag aatcccgtct 180 ttgacacgga tcccaatgct ttgtgatgcg ctctcaaaga gtcgagttgt ttgggaatgc 240 agctcaaaat gggtggtgaa ttccatctaa agctaaatat tggcgagaga ccgatagcga 300 acaagtaccg tgagggaaag atgaaaagca ctttggaaag agagttaaac agtacgtgaa 360 attgttgaaa gggaaacgct tgaagtcagt cgcgtcggcc gggactcagc cttgcattcg 420 cttggtgtac tttccggtcg acgggccagc atcagttttg atcgcgggat aaaggcggag 480 ggaatgtggc tctttcggga gtgttatagc cctctgtcgg atgccgtggt tgggactgag 540 gaactcagca cgcctttatg gccggggttc gcccacgtac ctgcttagga tgctggcgta 600 atggctttaa acgacccgtc ttga 624 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS5 primer <400> 3 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (9)

  1. 높은 활성의 셀룰로스 분해효소 생성능을 가지는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주(기탁번호: KCTC 18282P).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 28S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 셀룰로스 분해효소는 엔도-베타-1,4-글루카나아제(Endo-β-1,4-glucanase), 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 및 셀로바이오하이드로레이즈 (cellobiohydrolase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 균주.
  4. 다음 단계를 포함하는 셀룰로스 분해효소의 제조방법:
    (a) 제1항의 아칸소피지움(Acanthophysium) 속 KMF001 균주를 배양하여 셀룰로스 분해효소를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 셀룰로스 분해효소를 회수하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배양은 셀룰로스(Cellulose), 글루코오즈(Glucose), 락토오즈(Lactose), 셀로바이오즈(Cellobiose), 카르복실메틸 셀루로오즈 나트륨(Carboxymethyl cellulose sodium salt; CMC), 자일란(Xylan), 볏짚, 아비셀(Avicel) 및 상수리로 구성된 군에서 선택되는 탄소원; 펩톤(Peptone), 이스트 익스트랙트(Yeast extract), 트립톤(Trypton), 콘 스팁 파우더(Corn steep powder), 요소(Urea), 이스트:펩톤=0.2:0.8 및 트립톤:이스트=0.7:0.3로 구성된 군에서 선택되는 질소원; 인산이수소칼륨(KH2PO4); 인산수소칼륨(K2HPO4); 및 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 배양은 pH 5.5~6.5 및 22~28℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항의 방법에 의해 제조된 셀룰로스 분해효소.
  8. 셀룰로스 분해 활성을 가지는, 제1항 균주의 배양액.
  9. 제1항의 균주, 제7항의 셀룰로스 분해효소 또는 제8항의 배양액을 이용하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 분해방법.
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