CN115254036A - 具有3d微纳结构表面的毫米级固相微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，为惰性材料固体球，外表面形成若干三维立体凸起和/或凹陷组成的3D堆叠微纳结构，平均粗糙度为10纳米‑10微米，直径0.5‑20mm，其修饰有与靶分子/材料特异性结合的功能配基。本发明以陶瓷或玻璃等惰性固体球为基体，在其表面进行3D堆叠微纳结构改造并连接功能配基，获得一种可取代传统磁珠的检测材料，具有表面活性基团（如氨基、羧基等）丰度高，材料易得、成本低、操作简便、无需长时间集磁、不易漏集等优点,可替代传统磁珠应用在蛋白质纯化、免疫沉淀、核酸提取、细胞分离、高密度贴壁细胞培养等方面。

Description

具有3D微纳结构表面的毫米级固相微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球及其制备方法和应用。

背景技术

在生物医学领域，部分实验需要将蛋白质，核酸等生物分子连接到固相材料上，以达到保留、富集或纯化的作用，使靶体分子与其他物质分离或者提高检测信号。行业应用中，常用的固相材料有聚苯乙烯、磁珠、硝酸纤维素膜等。通过在固相材料表面包被特异性抗体或受体等分子，用于分离纯化样品中的靶体的技术已被广泛应用于体外诊断、蛋白纯化、免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。

目前，生物医学领域最常用的固相材料就是磁珠。生物磁珠是指具有细小粒径的超顺磁珠，一般具有超强的顺磁性。在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。磁珠还具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性（磁力能驱动磁珠移动）又不会在水相中因重力自然沉降。在磁珠表面具有丰富的活性基团，以便和生化分子耦连，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

虽然，微纳磁珠拥有非常大的比表面积，能有效地提高生物配体分子间的结合（如:特异抗原抗体、生物素亲和素、酶底物、适配子(Aptamer)蛋白、核酸互补碱基对）数量，从而提高检测灵敏度，可应用于免疫学、生物化学或分子生物学等，但在实际使用过程中，磁珠必须依赖特殊的富集仪器、试验成本较高，磁珠结合靶体分子后，需要经过长时间的集磁操作后，聚集后的磁珠容易形成团聚复合物，必须在强外力作用下才能再次变成单分散的微球；在工业生产的大容量体系下，小粒径的磁珠需要非常长的时间才能完全集磁（特别是纳米级磁珠，其含磁量少，磁响应性更低），集磁不完全会发生磁珠流失并导致样本损失，检测结果不精密度增大，灵敏度降低，漏检率增加等问题。集磁是否完全直接影响分离样本的回收率，检测精密度，而完全集磁耗时很长，导致生产效率较低，也降低检测速度、通量等。

此外，常见的生物磁珠结构为4%的聚丙烯酰胺，4%的琼脂糖，或4%的聚苯乙烯等和7%-30%包裹在磁珠里面的氧化铁，磁珠表面修饰有特定的功能配基。磁珠制作工艺复杂，成本极高，特别是尺寸均一的微纳米级的磁微粒，难以大规模量产，磁珠生产技术一直是许多本土企业难以跨越的一项技术壁垒。由于固相材料在相同总体积/重量下，粒径越小，比表面积越大，越容易结合更多功能配基，因此人们通常将磁珠的粒径做到非常小。同时，为了保证磁珠具有足够大的比表面积、悬浮性、磁响应性，磁珠粒径一般维持在纳米级或微米级（常用200nm、800nm与 1um-3um）。这类成本高昂、小直径（微米、纳米级别）的磁珠在生物检测、体外诊断、蛋白纯化、免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等方面的应用研究，一直占据着主导地位，而对于大直径固相微球的研究则显得与主流研究或设计方向背道而驰。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，以廉价的陶瓷或玻璃球为基本材料，通过在陶瓷或玻璃球表面进行3D堆叠微纳结构改造并添加功能配基，获得一种可取代生物磁珠的新型材料，具有原材料易得、成本低廉、应用时操作简便、无需等待长时间集磁等优点。此外，本发明还提供了上述毫米级固相微球的制备方法和应用。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，所述固相微球为惰性材料固体球，所述固体球的外表面形成3D堆叠微纳结构，所述3D堆叠微纳结构为若干三维立体凸起和/或凹陷所组成，3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米，使固体微球表面上可结合的活性基团以氨基或羧基计为3D堆叠结构改造前的至少1000倍；所述固体球表面修饰有用于与靶体物质相直接或间接结合的功能配基；所述固体球的直径为0.5mm-20mm。

其中，固体球的尺寸过大时不易搅动，流动性和悬浮性差，结合靶体物质（分子或细胞）的效率低。所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度过大时，相对光面固体球，其对表面积的倍增作用不明显，相对可改造结合的活性基团（如：氨基，羧基等）也不明显；而当平均粗糙度过小时，凸起和/或凹陷结构的尺寸过小，在结合大分子等靶体物质时，会产生一定的空间位阻效应。因此，本发明限定固体球的直径为0.5mm-20mm，3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米。所述功能配基可以是化学基团、小分子、大分子、小分子与大分子的复合物，或大分子的复合物。在本申请中，功能配基可以是任何对生物活性物质（蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物、病毒）或细胞（细菌）进行特异性结合或识别的基团或配体。

根据本发明的较佳实施例，所述惰性材料为玻璃，陶瓷玻璃、陶瓷等含硅或氧化硅的惰性材料。优选地，所述固体球为玻璃微球，陶瓷玻璃微球或陶瓷微球。

根据本发明的较佳实施例，所述固体球的直径为0.5-8mm；更优选是0.5-5mm。

根据本发明的较佳实施案例，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度优选为50-500nm。在不同的应用场合，最优的平均粗糙度Ra不一定相同。

根据本发明的较佳实施例，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为52nm-200nm，优选为65nm-200nm，更优选择为75-100nm。试验数据证明，具有前述特征的3D堆叠结构微球，应用在免疫化学发光检测试剂时，具有最规律的线性关系，较高灵敏度和信号值。

根据本发明的较佳实施案例，所述功能配基为羟基、氨基、羧基、醛基、丙烯酰亚胺基、巯基、双环氧基、Ni-NTA、多聚赖氨酸、蛋白或抗体中的一种，以便于特异性地与生物/化学反应材料耦连，实现生物学、化学功能。靶体物质可为蛋白质、小分子抗原、半抗原、抗体分子、核酸或细胞。

第二方面，本发明提供了一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球的制备方法，包括：

S1、以直径0.5mm-20mm的惰性材料固体球为基础材料，在该固体球的表面蚀刻形成3D堆叠微纳结构，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米；

S2、在所述3D堆叠微纳结构上引入能够与靶体物质相结合的功能配基。

根据本发明的较佳实施例，S1中，所述蚀刻方法为化学蚀刻、等离子表面蚀刻或光刻机蚀刻。

利用等离子体生成用的高频电力从含有氢及氟的气体中生成等离子体，利用等离子体对固体球表面的氧化硅进行蚀刻。

根据本发明的较佳实施例，S2中，引入功能配基的方法为：将固体球置于含有浓硫酸和双氧水的改性液中浸泡处理，使固体球表面连接大量羟基；再利用该羟基作为基础基团，在该基础基团上通过改性衍生出具有不同特异性结合/识别作用的功能配基。所述功能配基为氨基、羧基、醛基、丙烯酰亚胺基、巯基、双环氧基、Ni-NTA中的一种。或者直接采用浸泡法在毫米级固相微球表面进行多聚赖氨酸化，用于细胞高密度贴壁培养。

第三方面，本发明提供一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球在体外诊断、蛋白纯化、免疫沉淀、核酸提取、外泌体分离、细胞分离或高密度贴壁细胞培养等生物学医学领域的应用。

（三）有益效果

（1）分离纯化的处理更便利。本发明具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，与目前常用的微纳级磁珠不同，所述固相微球为大直径固相球，在生物实验或检测过程中，洗涤时无需使用专门特殊的磁珠富集装置，仅利用毫米级固相微球自身重力即可在液相中快速自动富集，即非常容易达到生物分离、纯化的目的。相比于磁珠所需的磁场集磁富集磁珠来说，使用所述毫米级固相微球省略了集磁操作的耗时，无需配备昂贵的仪器；所述毫米级固相微球不会被自动化仪器的针头吸入而阻塞液路，可以直接使用针头、移液枪或小孔径负压吸管等移走液体，节省了大量的操作时间，也不会出现样本流失的情况。毫米级固相微球同样具有很好的流动性，容易在搅拌下流动和悬浮，能在液相中翻滚，流动到各处，其每个面和每个功能基团都有机会与液相中所含的靶体分子连接。本发明的微球在自动化免疫化学发光检测系统中不需要磁场富集，洗涤模块简单；而磁珠洗涤过程需要强磁场集磁、富集磁珠，然后才能洗涤。因此磁珠的自动化洗涤模块结构和控制更复杂。

（2）生物载量高。在相同总体积/重量下，大直径微球相对比表面积小，结合靶体的载量也较少，这也是目前大部分分离/纯化材料，如磁珠/微球等不断向小直径化、微纳级方向开发和设计的原因。本发明则采用了完全相反的设计研发思路，使用了直径0.5mm-20mm的毫米级微球，并在该毫米级微球表面通过改造形成特殊立体3D堆叠微纳形貌，实现了在有限体积、面积上构建千、万数量级纳米级3D堆叠微纳结构，大大提高了功能配基和结合靶体的载量的量级，极大地增加了毫米级微球的表面积，彻底解决了毫米级微球生物载量少的缺点。本发明的毫米级固相微球，单个微球表面3D堆叠纳米堆叠微结构的数量以万级计，相对光滑平整表面，单个毫米级微球的比表面积呈几个数量级倍增，这为后续微球表面功能配基的改造、结合量打下了坚实的基础。

（3）可干燥保存，单分散不团聚，避免非特异性吸附干扰。本发明制备的毫米级固相微球，其表面蚀刻了3D堆叠微纳结构后仍保持着完全的单分散状态，并没有增加后续应用中类似纳米/微米级磁珠易团聚而带来的问题。在3D堆叠微纳结构上偶联了抗体等生物活性、配体后仍能够干燥保存，并且干燥后的玻璃微球仍然是单分散的，且偶联在毫米级固相微球表面的抗体等生物活性物质更稳定，可室温保存。反观纳米、微米级的磁珠不能干燥保存，磁珠干燥后易形成团聚状的聚合团，失去单分散的磁珠，导致其非特异性吸附成几何指数增加，对检测和提纯过程带来大量噪音和干扰。因此，当使用的磁珠发生团聚时不得不借助外部强力超声波处理进行单分散。

（4）本发明的毫米级固相微球可以对样品的多个目标物进行联合检测。本发明的一个毫米级固相微球的表面功能配基载量相当于几十万到几百万个微纳磁珠，例如：1颗直径2.5mm的3D堆叠结构的玻璃微球，其抗体偶联结合量大约相当于直径2.7微米的磁微粒0.06mg（大约350万到450万粒磁珠），相当于直径1.0微米的磁微粒0.025mg(约800万到1100万粒磁珠)。换句话说，1颗直径2.5mm的3D堆叠结构的玻璃微球可取代350万到450万个2.7微米的磁珠，进行靶抗体分子的偶联结合实验。毫米级固相微球能以固定的排列顺序保留在特定检测通道（如微流控通道）内，每个单一固相微球都可以固定某种特异的捕获配体，每一粒3D堆叠微纳结构改造的固相微球都可以作为一个独立的反应载体完成对某一个项目的检测，并且多个微球的联用也很容易实现对单一待检样品中多项靶目标进行联合检测。反之，单个现有技术的微纳级磁珠因功能配基载量有限，无法实现样品中某目标物的检测，需要几十万到百万粒微纳级磁珠完成一个目标物的检测，因此无法用单个纳米、微米级的微球实现在一次检测实验中对某样品中的一个或多个待检物进行联合检测，且现有微纳磁珠也容易在集磁时丢失导致检测准确度降低。

（5）本发明的毫米级固相微球用于蛋白纯化时无非特异性吸附干扰，在细胞分离时不造成细胞损伤。在蛋白纯化、细胞分离应用方面，本发明的毫米级固相微球作为分离介质，容易洗涤，无团聚、非特异性吸附少，无需任何辅助工具（如磁铁）。在用于细胞分离时，本发明的毫米级固相微球在分离过程中对细胞无损伤，分离的细胞可保持活度、直接培养；而现有技术的磁珠在分离细胞时，只有直径50nm以下的磁珠对细胞无损伤，直径50nm以上磁珠在磁场中分离细胞时容易对细胞结构造成损伤。

（6）本发明的毫米级固相微球在化学发光免疫检测应用中，经化学发光体外诊断试剂比对实验表明，直径2.5mm、3D堆叠微纳结构的微球1粒大约相当于直径2.7微米的磁微粒0.06mg（大约350万到450万粒磁珠）的抗体偶联结合量（根据靶标分子偶联、结合能力计算得到的等效值）；相当于直径1.0微米的磁微粒0.025mg(约800万到1100万粒磁珠)的抗体偶联结合量(根据靶标分子偶联结合能力计算得到的等效值)。

改造后的3D堆叠微纳结构的微球每一粒都可以单独的对某一个检测靶标进行单独检测，也可以对多种靶标进行联合检测。同时玻璃微球对微弱光无吸收，也无遮挡效应，灵敏度高于磁珠（磁珠含氧化铁为褐色、红褐色，对微弱光有吸收、遮挡作用）。此外，本发明毫米级固相微球可大幅大提高贴壁细胞的培养密度，而磁珠不能用于贴壁细胞培养。

（7）生产工艺难度低，易于规模化生产，成本低。传统微纳级磁珠的生产工艺非常复杂，成品率低，成本高昂，要生产出单分散、颗粒均一、含铁量一致且不漏磁的顺磁珠难度更高，成本远高于本发明的毫米级固相微球。本发明的毫米级固相微球易于制造，原材料（玻璃或陶瓷）易得，成本极其低廉，非常容易大规模化生产，完全可替代现有成本高昂的磁珠在生物分离、蛋白质纯化、临床检测等方面的应用。相比现有技术的聚丙烯酰胺+琼脂糖包裹氧化铁的复合磁珠结构，或聚苯乙烯包裹氧化铁的复合磁珠结构，本发明的固相微球有利于采用宏观生产方式实现纳微观载体的生产过程，大大降低了生产工艺难度，非常容易实现规模化生产。

附图说明

图1为玻璃珠在蚀刻前的光面玻璃珠(a)，和蚀刻后具有3D微纳结构表面的玻璃珠(b)的照片。

图2A、图2B、图2C为AFM分析技术测试本发明采用化学蚀刻方式制备的11种玻璃微球表面的平均粗糙度Ra值。

图3为实施例1中不同3D堆叠微纳结构平均粗糙度（Ra）与免疫化学发光检测灵敏度的定标曲线对比图。

图4为实施例2使用2.7um磁珠和具有3D堆叠微纳结构表面的玻璃微球在免疫化学发光定标曲线斜率上的对比图。

图5为实施例3使用Ni-NTA修饰的3D堆叠微纳结构玻璃微球（φ0.5mm）纯化HIS标签蛋白质的效果对比。

图6为实施例4采用直径0.5mm的玻璃微珠和直径0.5mm的普通光面玻璃微珠用于核酸提取PCR的实验结果。

图7为实施例5采用直径0.5mm、Ra约120nm改性的SMCC玻璃微球进行亲和层析纯化羊抗兔IgG抗体的实验结果。

图8为实施例6采用直径0.5mm，Ra约60nm、120nm、400nm的三种具有3D堆叠微纳结构的氨基化玻璃微球偶联的Protein A进行亲和层析纯化抗体的实验结果。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明通过对玻璃/陶瓷等惰性固体微球表面进行纳米3D堆叠微纳结构的改造、功能基团的添加及改性，得到一种材料广泛易得，成本低廉、可取代目前广泛应用于生物化学研究，制药工程，临床诊断检测等领域的生物磁珠；解决了磁珠原材料成本高昂，制造加工复杂，不易大规模量产的问题。本发明的固体微球有易于制造，原材料易得，成本及其低廉，非常容易大规模化生产，实验过程易于操作，耐高压等诸多优点，可应用到目前磁珠可应用的各个方面，如：蛋白质纯化，免疫沉淀，免疫共沉淀，核酸提取，临床免疫学检测，细胞分离等，还能用于高密度贴壁细胞培养等。每个毫米级固相微球可单独进行定制化改造，特别是在体外诊断试剂应用中，每一个微球都可以单独用于检测一个项目，而多个微球在一定的条件下联合应用即可实现对单一样品中多项目的联合检测。

含有硅、氧化硅元素的玻璃、陶瓷玻璃是一种生物相容性非常好的材料，广泛的应用在日常细胞培养、化学、生物化学反应、检测等的各个环节，对水相、无机溶剂、有机溶剂都非常稳定。相同材质的玻璃微球在各种生物反应中属性相同，其化学性质和物理性质都非常稳定，即使在大多数的有机溶剂中玻璃微球也不会发生膨胀变型，并且机械抗压特性也非常好。同时玻璃中富含二氧化硅，非常易于进行化学改性，提高其生物相容性。改性后的玻璃微球表面的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生结合，可以直接从复杂的生物体系中分离核酸。3D堆叠改造的微纳玻璃微球表面富含的Si-OH，其作为基础基团，可通过改性衍生出多种具有不同特异性结合/识别功能的基团，使多种不同物质结合到3D堆叠微纳结构颗粒表面，从而达到高载量分离纯化的功能；玻璃微球外部所设的3D堆叠微纳结构表面，更易于实现对其高密度，不同化学功能团的修饰，如：羧基、氨基、醛基、巯基、丙烯酰亚胺化、双环氧化、Ni-NTA等，使其表面基团功能化，可以共价结合多种生物分子，如Streptavidin、Avidin、BSA、Protein A、Protein G、Biotin、多肽、抗体、其它各种蛋白质和核酸探针（DNA、RNA探针）等。

本发明所提供的3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，固相微球为惰性材料固体球，所述固体球的外表面形成3D堆叠微纳结构，所述3D堆叠微纳结构为若干三维立体凸起和/或凹陷所组成，3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米；所述固体球表面修饰有用于与靶体物质相结合的功能配基；固体球的直径为0.5mm-20mm。

经测算，3D堆叠微纳结构改造后固体微球表面上可结合的活性基团为的改造前的至少1000倍以上。

单个具有3D微纳堆叠结构表面的微球所固定的功能配基（如氨基或羧基）的数量可通过滴定-电导率进行测算。例如以直径2.5mm的具有3D微纳结构表面的微球为例，测算表面固定的氨基数量，测算仪器为Mettler Toledo T5自动滴定仪，试剂包括0.1M盐酸溶液和0.05M NaOH溶液，测算包括如下步骤：

①在滴定杯中加入40mL实验室用水，以直测电导的模式测定电导10s，确认电导<4μS。如所测电导高于4μS则用实验室用水润洗测定杯直至所测实验室用水电导<4μS。

②倒掉滴定杯中的水，用吸水纸小心擦干搅拌子和滴定杯，电子天平中去皮，折合固含量后，称量100粒直径2.5mm的3D堆叠改造的氨基微球（2.03g)，加入滴定杯中。

③在电子秤上准确补加实验室用水至体系总水质量40g，注意在加水时用一次性滴管将滴定杯管壁粘附的液滴冲洗到测定液中，并搅拌、浸泡1小时使其达到电导测值稳定的状态。

④将滴定杯装置于滴定仪，用0.05M NaOH进行电导滴定，通过检测电导值判断滴定终点和突变点。

⑤待滴定结束后，输入微球质量并保存，随后根据滴定曲线的三切线交点计算所测氨基微球的表面氨基含量[单位为μmol/g]。

根据氨基摩尔量R(NH₂)=(C×ΔV)。C表示氢氧化钠的摩尔浓度，ΔV表示滴定过程中，前后两次发生电导率突变对应的体积差。R(NH₂)除以微球颗数（或克数），即得到单颗微球表面氨基摩尔量（或每克微球的氨基载量）。按照该方法，2.5mm的具有3D微纳结构表面的微球经氨基修饰后，表面氨基载量约为120-188μmol/g(1g约50-54颗直径2.5mm玻璃微珠)。

而按照单个微珠分子偶联/结合能力计算，直径2.5mm 3D堆叠结构的微球1粒大约相当于直径2.7微米的磁微粒0.06mg（大约350万到450万粒磁珠）的抗体偶联结合量（根据靶标分子偶联、结合能力计算得到的等效值）；氨基含量大约1.5-3.5umol/粒微球（直径2.5mm玻璃微球的百粒重大约为2.0-2.1克）。改造前的氨基含量大约10pmol/粒-100pmol/粒微球（改造前后可用的活性基团-氨基，增加了千万倍）。活性基团含量越高并不意味着在偶联、纯化、检测大分子蛋白等时效果越好，这也与其分子间的空间位阻有一定的关系，因此对微球表面进行3D堆叠微纳结构改造（蚀刻）时需控制适当的改造程度；在不同的应用场合，最佳的活性基团的含量不一定相同，具体可根据实际需求对单个毫米级微球进行定制化蚀刻改造和化学功能配基偶联。

虽然活性功能配基的载量在一定程度上影响着单个微球能够结合的靶标分子数量，但是靶标分子通常为蛋白质、多肽、核酸等较大分子，因此微球表面Ra若过小且活性功能配基的分布过于密集，也会因空间位阻等原因导致一些活性功能配基无法结合靶标分子。本发明的微球为毫米级，相对微米级或纳米级磁珠而言，可大大减少因空间位阻带来的“结合抑制”作用，尽量发挥各功能配基的捕捉能力。

优选地，所述惰性材料含有硅或氧化硅，以便于进行蚀刻和改性修饰，连接各种不同活性功能配基，如羧基、氨基、醛基、巯基、丙烯酰亚胺化、双环氧化、Ni-NTA等，使微球表面功能化。

优选地，所述固体球为玻璃微球，陶瓷玻璃微球或陶瓷微球。

优选地，所述固体球的直径为0.5-8mm；更优选是0.5-5mm；优选的，3D堆叠微纳结构改造后固体微球表面上可结合的活性基团以氨基或羧基计为改造前的至少1000倍。

优选地，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度优选为50-500nm。在不同的应用场合，最优的平均粗糙度Ra不一定相同。

优选地，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为52nm-200nm，优选为65nm-200nm，更优选择为75-100nm。试验数据证明，具有前述特征的3D堆叠微纳结构微球，应用在免疫化学发光检测试剂时，具有最规律的线性关系，较高灵敏度和信号值。

优选地，所述功能配基为羟基、氨基、羧基、醛基、丙烯酰亚胺基、巯基、双环氧基、Ni-NTA、多聚赖氨酸中一种，以便于与生物、化学反应材料耦连，实现生物学、化学功能。

本发明的设计的独特性在于，大直径球体（如毫米级的玻璃微球），由于直径大导致其比表面积小、活性功能配基载量低，几乎没有人关注大尺寸微球在生物分离、纯化、分析检测方面的应用，目前大多分离载体多聚焦于成本高，直径小（微纳级）的磁性微球方面的应用。本发明采用了大直径（毫米级）微球，并对该微球表面进行改造以在微球表面形成3D堆叠微纳结构，呈多个数量级倍增单个微球的比表面积，然后在3D堆叠微纳结构表面修饰活性功能配基，所得微球表面能够偶联足够数量的功能配基，彻底解决了毫米级微球生物结合载量少的缺点。经试验证明，所得毫米级固相微球可广泛地用于生物分离、蛋白质纯化、生物分析检测等各方面。本发明的毫米级固相微球不仅易于制造，原材料易得，成本及其低廉，非常容易大规模化生产，完全可替代现有高成本的磁珠，而且相比较磁珠用于分离纯化或检测实验时，使用本发明毫米级固相微球时，实验更易操作，实验成本低，效率高、避免非特异性吸附干扰，还具有更宽的应用范围。

在制造本发明的毫米级固相微球时，主要包括两步处理：

第一步：以粒径0.5-20mm的毫米级玻璃/陶瓷微球为基础材料，采用蚀刻工艺对玻璃/陶瓷微球进行了3D堆叠微纳结构的改造，以增加其有效表面积，使毫米级微球表面积结合更多的功能配基，提高功能配基的数量和分布密度。改造方法包括但不限于化学蚀刻、等离子表面蚀刻或光刻机蚀刻等。等离子表面蚀刻是利用等离子体生成用的高频电力从含有氢及氟的气体中生成等离子体，利用等离子体对固体球表面的氧化硅进行蚀刻。光刻机蚀刻的方法可参照芯片制造过程中的蚀刻方法。化学蚀刻方法通常会用到HF，根据微球材质不同，蚀刻方法包括：

方法1：含有硅、氧化硅等的单晶硅或多晶硅，玻璃、陶瓷等都可以在硝酸和HF的混合物中进行3D堆叠结构的蚀刻改造。蚀刻发生的反应为：先是HNO₃在硅上形成一层二氧化硅，然后HF把这一层二氧化硅去掉。总的反应是：Si+HNO₃+6HFH₂→SiF₆+HNO₂+H₂+H₂O。

方法2：对二氧化硅玻璃微球、玻璃陶瓷等材质的微球通常是用不同浓度的HF来进行的。在室温下HF会和二氧化硅反应，而不会和硅反应。刻蚀的方程式如下：SiO₂+6HF→H₂+SiF₆+2H₂O。

如图1所示，为2.5mm玻璃珠在蚀刻前的光面玻璃珠(a)，和蚀刻后具有3D微纳结构表面的玻璃珠(b)的照片。蚀刻前，玻璃珠为透明球体，蚀刻后玻璃珠具有一定雾度，这是因为蚀刻后，玻璃珠表面形成了由若干三维立体凸起和/或凹陷形成的3D堆叠微纳结构，使得光线发生复杂的折射和漫反射，玻璃珠表面为雾面。经过蚀刻后，玻璃珠上可改造结合的活性基团（如：氨基，羧基等）增加了1000倍以上。

采用AFM分析技术测试本发明采用化学蚀刻方式制备的11种玻璃微球表面的平均粗糙度Ra值（如图2A-2C所示），Ra值从几个纳米到几百个纳米范围内分布，大多数分布在几十个纳米。

第二步：在微球的3D堆叠微纳结构表面修饰活性功能配基。修饰方法根据所连接的目标功能配基的不同，修饰方法也不同。在实际生产过程中，既可按照现有常规方法进行修饰，也可参照如下方法进行修饰（以3D堆叠微纳微球的改造以直径2.5mm的玻璃微球为例）：

①羟基化：将上述3D堆叠微纳结构改造的玻璃微球5000粒加入100mL的（98%H₂SO₄:30%H₂O₂=70:30）溶液，室温浸泡120min，玻璃球用大量去离子水漂洗，直至水的pH无变化，用100%酒精脱水，氮气吹干，得到表面修饰有丰富羟基的玻璃微球，干燥保存。

②氨基化：将上述羟基化的玻璃微球5000粒浸入25uM（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）500mL的甲醇溶液中，50℃搅拌反应4h，把温度降至室温搅拌过夜。把上述玻璃微球用500mL的甲醇洗涤3次。氮气中吹干，得到表面修饰有丰富氨基的玻璃微球，氮气中避光保存。

③羧基化：将上述3D堆叠结构改造的氨基化玻璃微球5000粒浸入到400mL的N，N-二甲基酰胺溶液中，再加入终浓度为20%的丁二酸酊；60℃水浴摇床反应18h；弃上清，用乙醇洗净3次，再把微球浸泡在20%的乙酸酐中，30℃条件下反应过夜，封闭掉未反应的氨基；用5%的醋酸对上述3D堆叠结构改造的玻璃微球洗涤2遍，蒸馏水洗涤2遍，再用50℃风干，得到表面修饰有丰富羧基的玻璃微球，避光干燥保存。

④醛基化：将上述3D堆叠结构改造的氨基化玻璃球100粒浸泡在15mM的对苯二甲醛的100mL的丙酮溶液中，室温60min，取出后用去离子水摇床上漂洗2次，然后用氮气吹干室温避光、干燥、保密封存该醛基化的玻璃微球。

⑤丙烯酰亚胺化（-SMCC）：将上述3D堆叠微纳结构改造的氨基化玻璃球100粒浸泡在50mM的PBS，pH8.0，100mL的缓冲液中，加入100毫克的磺胺-SMCC。混合并在室温下反应160min。用100mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液浸泡60min，再用相同的缓冲液洗涤上述玻璃微球3次。氮气吹干，避光干燥保存。

⑥双环氧化合物（-Epoxy）：将上述羟基化的玻璃微球100粒浸泡在含有1.5克硼氢化钠的100mL的0.6N NaOH溶液中，在搅拌中慢慢加入15毫升1，4-丁二醇二甘油醚，25℃，持续搅拌10h，用100mL的水洗涤5遍，用30%的乙醇，100mL洗涤1次，每次10min，用70%的乙醇，100mL洗涤1次，每次10min，用100%的乙醇，100mL洗涤1次，每次10min，用100mL的水洗涤5遍，用氮气吹干室温避光、干燥、保密封存该双环氧化的玻璃微球。

⑦多聚赖氨酸化的表面处理：用于细胞高密度培养。

经过1N盐酸浸泡过夜，彻底清洗烘干的玻璃微球用0.001%多聚赖氨酸浸泡30min，无菌状态下自然干燥待用。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行说明。

实施例1

本实施例研究玻璃微球表面3D堆叠微纳结构平均粗糙度, Ra=83.6nm（3D堆叠改造后活性基团（羧基）含量大约1.5-3.5umol/粒）与免疫化学发光检测灵敏度、线性范围之间的关系。实验采用直径为2.5mm的链酶亲和素玻璃微球，实验涉及的其他信息如表1：

表1：

实验操作过程为：

（1）取第一抗体biotin标记物20uL，加入到10mL抗体稀释液中，混匀后得到应用Biotin-抗体1；取第二抗体吖啶酯标记物20uL，加入到10mL抗体稀释液中，混匀后得到试剂-2（R2）；

（2）向每个链酶亲和素玻璃微球(璃微球直径2.5mm,Ra分别为： 3.5nm、52.1nm、53.4nm、67nm、68.7nm、72.4nm、79.1nm、83.6nm、91.2nm、167.0nm)加入100uL应用Biotin-抗体1，室温孵育20min，弃上清，并洗涤3次，得到试剂-1（R1：微球-抗体1）；

（3）向步骤（2）所得的试剂-1，R1（微球中）加入20uL样本和100uL R2，37℃孵育20min，弃上清；

（4）使用洗涤液（PBST）洗涤3遍，弃上清；

（5）使用smart6500仪器，向反应杯中加入100uL底物A（0.1M硝酸、0.05%双氧水），随后加入100uL底物B（0.25M NaOH、0.1%曲拉通-100）并读取发光值，记录发光值如表2所示。

表2：

如表2所示，其中浓度值是被检样品（PCT）抗原的浓度值，S01-S11代表图2A-2C所示的11种不同平均粗糙度Ra的3D堆叠微纳结构表面链酶亲和素玻璃球在用于检测PCT抗原标准品浓度曲线时的反应度。根据以上实验结果制作定标曲线对比图（如图3所示，其中S01-S11代表图2A-2C所示11种不同平均粗糙度Ra的3D微纳结构表面链酶亲和素玻璃球，横坐标ng/mL是被检抗原PCT标准品的浓度单位：ng/mL=纳克/毫升）。由图3可知，玻璃球平均粗糙度（Ra）在S08-S10时，有较好的线性关系，表现出最好的信噪比和高灵敏度及较高的信号值。因此，应用在免疫化学发光检测试剂时，玻璃微球表面3D堆叠结构平均粗糙度（Ra）选择在52nm-200nm之间，优选是65nm-200nm，更优选为75-100nm；（3D堆叠改造后，直径2.5mm的微球表面活性基团（羧基）含量选择大于1umol/粒微球。

实施例2

基于本发明的构思，本实施例将毫米级的玻璃微球用于临床诊断IVD免疫化学发光诊断试剂，同时使用2.7um传统磁珠与直径2.5mm的3D微纳结构改造的玻璃珠定标曲线的比较。实验方法为：

（1）制备链酶亲和素与羧基化3D堆叠微纳结构改造的羧基玻璃微球

①取直径2.5mm的羧基化玻璃微球100粒浸泡在50mM MES pH 6.0，10mL的缓冲液中，室温30min。其中，玻璃微球的表面3D堆叠微纳结构的微球，Ra=83.6nm，表面活性基团（羧基）含量：1.5umol/粒-3.0umol/粒。

②加入新配置的10mg/mLEDC 0.5mL，充分混匀。室温反应60min。

③用50mM PB pH 7.0的缓冲液，50mL洗涤1次。

④把选定的链酶亲和素（streptavidin）溶解在50mM PB pH7.0 的缓冲液中，终浓度100ug/mL。室温混匀反应过夜。

⑤把上述偶联有链酶亲和素的玻璃微球用1×PBS缓冲液洗涤一次。

⑥把上述玻璃微球用1%BSA-PBS缓冲液室温封闭过夜。

⑦把上述玻璃微球用PBS洗涤两次，并在37℃负压抽干，干燥保存备用。

（2）制备PCT抗体1的生物素标记纯化及试剂-1（R1）

①取400uL标记缓冲液（50mM PB，pH7.5）；1.0mg的抗体(5mg/mL)200uL于2mLEP管中混匀。

②混匀10min之后加入20 uL的Biotin-PEG4-NHS（5mg/mL）室温，继续混匀2h。

③取脱盐离心柱（5 mL柱床体积），将柱子置于一个收集管中。

④以100×g的离心力离心1min去除储存液。

⑤向柱子中缓慢加入2mL，标记缓冲液50mM PB，pH7.5，以100 ×g的离心力离心1min，并重复两次。

⑥将柱子置于一个新的收集管中，去掉盖子并缓慢的将EP管中的样品加到压实的树脂中心。

⑦以100×g的离心力离心2min收集样品。

⑧将收集的样品转移至15mLEP管中，加入200uL丙三醇，并迅速混匀，-20℃保存备用。

⑨把上述标记了Biotin的PCT抗体-1稀释到应用浓度，与上述“一”中制备的3D堆叠结构玻璃微球-链酶亲和素混匀反应1h，经PBS洗涤、干燥制得试剂-1，(微球-联酶亲和素-生物素-抗体1)（R1）。

（3）制备PCT抗体2-吖啶酯的标记纯化及试剂-2（R2）

①取400uL标记缓冲液（50mM PB，pH7.5）；1.0mg的抗体(5mg/mL)200uL于2mLEP管中混匀。

②混匀10min之后加入80uL的吖啶酯-NHS 5mg/mL室温，继续混匀2h。

③取脱盐离心柱（5mL柱床体积），将柱子置于一个收集管中。

④以100×g的离心力离心1min去除储存液。

⑤向柱子中缓慢加入2mL，标记缓冲液50mM PB，pH7.5，以100×g的离心力离心1min，并重复两次。

⑥将柱子置于一个新的收集管中，去掉盖子并缓慢的将EP管中的样品加到压实的树脂中心。

⑦以100×g的离心力离心2min收集样品。

⑧将收集的样品转移至15mLEP管中，加入200uL丙三醇，并迅速混匀，-20度保存备用。

⑨把上述标记了吖啶酯PCT抗体-2稀释到应用浓度。

（4）PCT化学发光反应检测：

①加试剂-1（2.5mm的微球）1粒、样品20uL、试剂-2（R2）100uL；彻底混匀，37℃不断混匀反应10min。

②弃上清，用PBS缓冲液洗涤5次，每次400uL。

③底物1（预激发液）100uL并与玻璃微球混匀，放入PMT化学发光读取仪中，仪器自动加底物2（激发液）100uL并读取发光值。

本实施例的相关实验资料如表3：

表3：

记录相同浓度值下分别使用直径1.0um的磁珠（用量：0.025毫克/反应），2.7um磁珠（用量：0.06毫克/反应）和2.5mm的3D堆叠微纳玻璃微球制备的PCT试剂的发光值，如表4：

表4：

结果表明，改造后的，直径2.5mm，3D堆叠微纳结构的微球，1粒相当于直径2.7微米的磁微粒0.06mg（大约350万到450万粒磁珠）的抗体偶联结合量（根据靶标分子偶联、结合能力计算得到的等效值）；相当于直径1.0微米的磁微粒0.025mg(约800万到1100万粒磁珠)的抗体偶联结合量(根据靶标分子偶联、结合能力计算得到的等效值)；改造后直径2.5mm具有3D堆叠微纳结构的微球，一粒微球的活性功能配基的载量足以单独地对某一个靶标进行定量检测。

根据上述实验结果，整理1.0um，2.7um磁珠和具有3D堆叠微纳结构表面的玻璃微球在免疫化学发光定标曲线斜率上的对比，如图4所示。由实验结果可知，具有3D堆叠微纳结构表面的玻璃微球信号值高于传统磁珠定标的信号值；玻璃微球信号值低端信噪比优于传统磁珠；玻璃微球高端斜率比优于传统磁珠，使用玻璃微球有更好的灵敏度和线性范围。

实施例3

本实施例将具有3D微纳结构表面的玻璃微球用于纯化标签蛋白6×（HIS）镍柱，实验方法如下：

（1）制作Ni-NTA-玻璃微球

①上述改性的直径0.5mm、Ra=57nm，表面活性基团含量：280-390umol/克，约5000粒，加入NTA配体（N-(5-氨基-1-car-boxypentyl)iminodiacetic酸）20毫升，室温反应过夜；

②上述5000粒的玻璃微球用50mM2-（N-morpholino）乙烷磺酸缓冲液（pH值6.5）洗涤3次，每次20mL；

③把上述玻璃微球5000粒浸泡在50mM2-（N-morpholino）乙烷磺酸缓冲液（pH值6.5）20mL中，添加1mg NHS和1mg EDC，迅速混匀，30℃震荡混匀反应5h。

④把上述玻璃微球5000粒用20mL的50mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液洗涤2次，每次10min。

⑤把上述玻璃微球5000粒用20mL磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）再洗涤两次，每次10min。

⑥上述玻璃微球弃上清，浸入500mM NiCl溶液中，25℃、2h，4℃ 过夜。

⑦把上述玻璃微球5000粒用20mL磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4）再洗涤三次，每次10min，并保存在PBS缓冲液中待用。

（2）使用Ni-NTA修饰的3D堆叠微纳结构玻璃微球纯化蛋白质的效果，如图5所示。由图可知，使用Ni-NTA修饰的3D微纳结构玻璃微球可以很好地纯化蛋白质，并能够用适量浓度的咪唑进行洗脱。

实施例4

本实施例采用直径0.5mm、平均粗糙度Ra约52nm的玻璃微珠和直径0.5mm的光面玻璃微珠（玻璃珠为二氧化硅，对核酸有天然的物理吸附作用，比表面积大就可以吸附更多的核酸，3D堆叠改造后比表面积增大，结合核酸的总量也增加）用于核酸提取PCR产物。

实验步骤：

1、100微升的PCR产物平均分为两管，每管50ul.

2、在上述50ul的PCR产物中加入150 ul, 8M NaClO₄混匀。

3、在上述步骤“2”中分别加入30粒3D堆叠微纳结构改造和未改造的玻璃微球，并混匀反应2分钟。的溶液洗涤玻璃微球3次。

4、用500ul,6M NaClO₄的溶液洗涤玻璃微球3次。

5、用95%的酒精洗涤上述玻璃微球一次，放置室温干燥5分钟。

6、加30ul的DNA洗脱缓冲液（10mM Tris-HCL,2mM EDTA,pH8.0）室温分钟2分钟，吸取上清，跑agarose凝胶电泳。

实验结果如图6所示。其中，具有3D堆叠微纳结构表面的玻璃微珠有很强的核酸检测信号，而普通光面玻璃微珠只有较弱的核酸信号。由此可见，对玻璃微珠进行3D堆叠结构改造后，可以显著增强核酸吸附结合量的作用。

实施例5

本实施例采用直径0.5mm、平均粗糙度Ra约90nm改性的SMCC玻璃微球进行亲和层析纯化羊抗兔IgG抗体。SMCC是指一类含有N—羟基琥珀酰亚胺（NHS）活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。实验操作方法如下：

①直径0.5mm，Ra约90nm改性的SMCC玻璃微球500粒浸在10mL，50mM PBS pH7.2的缓冲液中；

②加10mg 经过DTT还原处理的兔IgG，彻底混匀，30℃震荡反应2h，然后4℃冰箱过夜。

③用20mL50mM PBS洗涤3次。4℃保存待用。

④用上述兔IgG亲和层析填料纯化羊抗兔IgG：

取羊抗兔抗血清10mL，用PBS缓冲液1：2蛋白溶液稀释，加入直径0.5mm约50粒玻璃微球-兔IgG，混匀30min，弃去上清，使用20mL 0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤固相材料(玻璃微球-兔IgG)三次，加入0.5mL pH为2.7的甘氨酸-盐酸溶液，混匀3min，取上清得到抗体溶液。在抗体溶液中加入0.05mL，1.5mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行中和，分装-20℃保存。如图7所示，为使用SMCC修饰的玻璃微球SMCC-兔IgG亲和层析纯化羊抗兔IgG，在12%SDS-PAGE的电泳图。由图7可知，具有3D堆叠微纳结构的SMCC活化玻璃微球能用于亲和层析纯化羊抗兔IgG。

实施例6

本实施例采用直径0.5mm，Ra约60nm、120nm、400nm的三种具有3D微纳结构的氨基化玻璃微球进行Protein-A-偶联，亲和层析抗体。实验方法如下：

①直径0.5mm改性的氨基玻璃微球大约100粒，浸在20mL，50mM PBS，pH8.0的缓冲液中。

②将上述氨基化玻璃微球（微珠-NH₂）加入1mg NHS-PEG5-NHS迅速混匀溶解，室温反应10分钟。

③加入10mg/mL的protein A（蛋白A），1mL，混匀反应2h。

④用50mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液50mL，洗涤上述玻璃微球3次。

⑤使用上述（玻璃微球-Protein A）进行抗体纯化：

取D二聚体小鼠腹水10mL，用PBS缓冲液1：2蛋白溶液稀释，加入直径0.5mm大约100粒的protein A-玻璃微球，混匀30min，弃去液体，使用20mL浓度0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤固相玻璃微球三次，加入1.0mLpH为2.7的甘氨酸-盐酸溶液，混匀3min，取上清得到抗体溶液。在抗体溶液中加入0.11mL，1.5mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行中和，分装-20℃保存。

如图8所示可知，使用直径0.5mm的玻璃微球时，3D微纳结构的Ra为120nm或400nm，相比Ra为60nm时，前者得到抗体信号更强，尤其是Ra为400nm更好。说明，玻璃微球表面的3D堆叠微纳结构Ra纳米值并非越小越好。

实施例7

本例对直径2mm具有3D微纳结构表面（Ra为3.5nm）的玻璃微球进行多聚赖氨酸化处理，用于细胞高密度培养，实验方法如下：

①5×E5 SP20细胞/毫升，悬浮在DMEM，含有10%胎牛血清的培养基中。

②把上述细胞15mL分别加到两个T75的培养瓶中:

A：T75培养瓶-1：加入Hela细胞3×E5/mL，15mL在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5% CO2培养箱中培养72h。

B：T75培养瓶-2：先加入直径2mm的多聚赖氨酸预处理的无菌玻璃微球100粒，再加入Hela细胞5×E5/mL，15mL在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5% CO2培养箱中培养72h。

③分别把A瓶、B瓶中的细胞取出计数；A瓶细胞总数6.2×E8；B瓶细胞总数4.8×E9；B瓶细胞总数大约是A瓶细胞总数的6-8倍。

④放置有玻璃微球的培养瓶中可倍细胞利用的贴壁面积大幅提高，大大促进了贴壁细胞的生存生长空间，节约了培养基、培养空间、培养时间，提高了贴壁细胞的生产效率。

综上所述，在培养瓶面积、培养基体积相同的培养条件下，加入多聚赖氨酸预处理的玻璃微球，培养72h后得到的细胞数远大于对照组，节省了培养瓶、培养基、培养空间、时间，大大的提高了科研、生产效率。

实施例8

本实施采用直径0.5mm,具有3D堆叠微纳结构表面（Ra为67nm）的玻璃微球进行外泌体分离纯化。本实施例中用到的材料主要包括：CD63抗体；CD81抗体；CD9抗体（杭州博岳生物赠予）。实验方法为：

（1）参照实施例5、实施例6的方法将CD63抗体、CD81抗体、CD9抗体连接到直径0.5mm改性的3D堆叠微纳氨基玻璃微球上，得到CD63-3D堆叠微纳玻璃微球、CD81-3D堆叠微纳玻璃微球、CD9-3D堆叠微纳玻璃微球。

（2）提取外泌体，提取方法如下：

①取新鲜血清置于离心机中，室温以2000×g离心力离心30分钟，弃细胞碎片沉淀，取离心上清液。

②在上清液中，直接投入外泌体提取材料CD63-3D堆叠微纳玻璃微球/CD81-3D堆叠微纳玻璃微球/CD9-3D堆叠微纳玻璃微球各30-50粒及适量Tris-HCl缓冲液。

③置于上下旋转混匀仪上以20rpm的转速，室温混匀30min。

④用PBS冲洗三次，使用洗脱液将外泌体洗脱下来，即得到纯化后的外泌体。

实施例9

本实施采用直径0.5mm,具有3D堆叠微纳结构表面（Ra为86nm）的玻璃微球进行细胞分选（以小鼠CD45分选为例）。本实施例中用到的材料主要包括：CD45抗体（购自苏州恩泽曼生物）。实验方法如下：

（1）将小鼠CD45连接到3D堆叠微纳结构微球上

用传统方法，将生物素标记到CD45抗体1上，每1mg抗体标记Biotin-PEG4-NHS5mg/mL，10uL，在PBS中反应60分钟，制备CD45-Biotin标记复合物。

在1mL上述标记液中，投入50颗，直径为1mm链霉亲和素处理的表面为3D微纳结构的玻璃微珠，均匀混合30min。制备[CD45-biotin生物素-Streptavidin链霉亲和素-微珠]复合物。

（2）提取小鼠肺部细胞

①混悬在100mM HEPES pH7.5缓冲液里的，小鼠肺部组织单细胞悬液2.5×10E6/mL，5mL，加10粒直径1mm的[CD45-biotin生物素-Streptavidin链霉亲和素-微珠]，室温混匀30min。

②把上述{细胞-[CD45-biotin生物素-Streptavidin链霉亲和素-微珠]}复合物用50mM HEPES pH8.0的缓冲液洗涤两次。

③Western Blot鉴定，分离纯化得小鼠肺部CD45阳性细胞。

综上所述，本发明具有3D堆叠微纳结构表面的玻璃微球具有足够的生物功能培基载量，可广泛应用于生物分析、分离、蛋白质纯化、核酸分离纯化、生化检测、细胞培养、临床检验学分析等领域。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球，其特征在于，所述固相微球为惰性材料固体球，所述固体球的外表面形成3D堆叠微纳结构，所述3D堆叠微纳结构为若干三维立体凸起和/或凹陷所组成，3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米，使固体微球表面上可结合的活性基团以氨基或羧基计为3D堆叠结构改造前的至少1000倍；所述固体球表面修饰有用于与靶体物质相直接或间接结合的功能配基；所述固体球的直径为0.5mm-20mm。

2.根据权利要求1所述的毫米级固相微球，其特征在于，所述惰性材料为玻璃或陶瓷等含硅或氧化硅的惰性材料。

3.根据权利要求1所述的毫米级固相微球，其特征在于，所述固体球的直径为0.5-8mm。

4.根据权利要求1所述的毫米级固相微球，其特征在于，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度优选为50-500nm。

5.根据权利要求1所述的毫米级固相微球，其特征在于，所述3D微纳结构的平均粗糙度为52nm-200nm。

6.根据权利要求1所述的毫米级固相微球，其特征在于，所述功能配基为羟基、氨基、羧基、醛基、丙烯酰亚胺基、巯基、双环氧基、Ni-NTA、多聚赖氨酸、蛋白或抗体中一种。

7.一种具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球的制备方法，其特征在于，其包括：

S1、以直径0.5mm-20mm的惰性材料固体球为基础材料，在该固体球的表面蚀刻形成3D堆叠微纳结构，所述3D堆叠微纳结构的平均粗糙度为10nm-10微米，固体微球表面上可结合的活性基团为3D堆叠微纳结构改造前的至少1000倍；

S2、在所述3D堆叠微纳结构上引入能够与靶体物质相结合的功能配基。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述蚀刻方法为化学蚀刻、等离子表面蚀刻或光刻机蚀刻。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S2中，引入功能配基的方法为：将固体球置于含有浓硫酸和双氧水的改性液中浸泡处理，使固体球表面连接大量羟基；再利用该羟基作为基础基团，在该基础基团上通过改性衍生出具有不同特异性结合/识别作用的功能配基。

10.权利要求1-6任一项所述的具有3D堆叠微纳结构表面的毫米级固相微球在蛋白纯化、免疫沉淀、核酸提取、外泌体分离、细胞分离或高密度贴壁细胞培养中的应用。

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