CN115252811B - 一种可激活型诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米生物医学材料制备技术领域，公开了一种可激活型诊疗一体化纳米探针制备及其应用。是以牛血清白蛋白(BSA)、无机银源、无机金源、无机铜源、硫化钠为原料，氢氧化钠为处理剂，先制备出在近红外二区有强荧光发射峰的Ag2S:Au@BSA，经混合液配置、水浴加热、离心、冷冻干燥，制成Ag2S:Au‑CuS@BSA‑GOx/Cel。本发明是一种简单、快速、可控、可实现荧光打开和肿瘤治疗的工艺。该纳米探针颗粒半径在6～8nm之间，CuS可使Ag2S:Au@BSA‑GOx/Cel荧光98％猝灭，过氧化氢的刺激响应可促使荧光“打开”，荧光效率为Ag2S:Au@BSA‑GOx/Cel的85％以上，且此刺激响应还会在肿瘤部位实现饥饿治疗并产生高细胞毒性的羟基自由基，对肿瘤也是一种十分理想的治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物医学材料制备技术领域，更具体而言，涉及一种可激活型诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
由于光学成像的高对比度、无创、实时性等优势使其逐渐发展成为一种新兴临床前研究和临床转化的诊断策略。最显著的发展之一是在第二个近红外窗口(NIR-II，1000-1700nm)中引入荧光成像，与传统近红外一区荧光成像(NIR-I,700-900nm)相比，它有更高的组织穿透力和时空分辨率。然而，目前大多数NIR-II荧光纳米探针面临的难题之一，“常亮”的荧光模式。无论纳米探针是否到达肿瘤区域，都存在明显的荧光信号，限制了对肿瘤部位的特异性识别，这种纳米探针的非特异性背景信号严重影响了检测灵敏度和定位分析。与“常亮”的纳米探针相比，可激活NIR-II荧光纳米探针最初处于“关闭”状态，只有在肿瘤相关生物标志物存在的情况下，NIR-II荧光信号特异性“打开”，有效提升疾病诊断的精准性。因此，基于肿瘤微环境诸多特异性物质，开发具备敏感性激活NIR-II荧光成像性能的诊疗一体化纳米探针极具临床应用前景。但到目前为止，国内外有关激活型诊疗一体化纳米探针的专利及相关文献数量较少，且主要局限于肿瘤微环境自身性能，对提升响应敏感性的研究尚处在初级阶段。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种可激活型诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。该激活型纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel利用瘤内H2O2高表达这一特性，在肿瘤区域通过纳米探针内葡萄糖氧化酶与雷公藤红素双重策略进一步放大瘤内H2O2含量，与CuS快速反应释放铜离子，促使Ag2S:Au猝灭的NIR-II荧光恢复，从而实现H2O2激活的NIR-II荧光引导的自我增强的饥饿疗法和化学动力学联合肿瘤治疗。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供了一种可激活型诊疗一体化纳米探针，所述纳米探针为Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel，该探针包括Ag2S:Au纳米颗粒、在Ag2S:Au纳米颗粒表面负载的葡萄糖氧化酶和雷公藤红素以及利用Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒的牛血清白蛋白构筑的CuS。
进一步，所述纳米探针的晶体直径为6～8nm。
本发明还提供了一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，包括以下步骤：先通过牛血清白蛋白生物矿化法制备Ag2S:Au纳米颗粒；然后通过物理吸附和偶联作用在Ag2S:Au纳米颗粒表面负载葡萄糖氧化酶GOx和雷公藤红素；最后利用Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒的牛血清白蛋白构筑CuS，得到最终纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
进一步，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：将牛血清白蛋白加入去离子水中，超声分散后，高速搅拌，形成淡黄色透明溶液，即牛血清白蛋白水溶液；
S2：将无机银源固体加入硝酸溶液中，超声分散均与，加至步骤S1中的牛血清白蛋白溶液中，高速搅拌；
S3：将无机金源加入去离子水中，超声分散后，滴入步骤S2的混合溶液，高速搅拌；
S4：用氢氧化钠溶液调节步骤S3混合溶液的pH值为碱性；
S5：取九水合硫化钠水溶液匀速滴加入步骤S4的混合溶液中，高速搅拌，形成棕黑色溶液；
S6：将步骤S5得到的棕黑色溶液经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹的硫化银纳米颗粒Ag2S:Au@BSA；
S7：将步骤S6得到Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成分散均匀的水溶液，然后缓慢滴加葡萄糖氧化酶水溶液，充分搅拌，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S8：先将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混合，然后将混合后的溶液与步骤S7中Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒的水溶液混合，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S9：将步骤S8中合成的Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒配成50mg/ml的水溶液，将无机铜源固体加入硝酸溶液中，超声分散后，快速加至Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒水溶液中，高速搅拌；
S10：用氢氧化钠溶液调整步骤S9混合溶液的pH值为碱性；
S11：取九水合硫化钠水溶液匀速滴加入步骤S10的混合溶液中，高速搅拌后，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，即得到所述可激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOCel。
更进一步，所述步骤S1中牛血清白蛋白与去离子水的比例为21-27mg：1mL；所述步骤S2中无机银源固体与硝酸溶液的比例为42.45-84.9mg：1mL；所述步骤S3中无机金源与去离子水的比例为88～127mg：1mL；所述步骤S5中九水合硫化钠水溶液的浓度为0.1mol/L，用量为0.1mL；所述步骤S7中Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液与葡萄糖氧化酶水溶液的体积比1mL：0.08～0.15mL；所述步骤S8中雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的摩尔比为1：1：1，Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液与雷公藤红素、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混合溶液的质量浓度比为1mg/mL：0.8～1.2mg/mL；所述步骤S9中无机铜源固体与硝酸溶液的比例为47mg：1mL；所述步骤S11中九水合硫化钠水溶液的浓度为40mg/ml，用量为0.0075mL。
所述步骤S1中超声分散的频率为50KHz，时间为15min；搅拌温度为室温，搅拌时间为5min；所述步骤S2和S3中超声分散的频率为50KHz，时间为5min；所述步骤S3中搅拌时间为30min；所述步骤S5的搅拌温度为60℃，搅拌时间为0.5～3h；所述步骤S6、S7、S8、S9中离心分离采用超滤分离管，转速为3500r/min，时间为15min；所述步骤S7中搅拌时间为60min；所述步骤S9中搅拌时间为15min；所述步骤S11中搅拌温度为60℃，搅拌时间为0.5～3h。
所述步骤S2、S9中硝酸溶液的浓度为2mol/L；所述步骤S4和S9中氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L；所述步骤S4和S9中氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L，S4调节后的pH值为12；所述步骤S7中Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液的浓度为1mg/mL，葡萄糖氧化酶水溶液的浓度为1mg/mL。
所述无机银源为硝酸银、氯化银、硫酸银、溴化银中的任意一种或几种；无机金源至少为四氯金酸三水合物和溴化金中的一种；所述无机铜源至少为硝酸铜三水合物、硫化铜、草酸铜、氯化铜中的一种。
本发明还提供了一种可激活型诊疗一体化纳米探针的应用，用于制备可在肿瘤微环境特异性响应的试剂。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明以白蛋白生物矿化法合成的牛血清白蛋白包裹的硫化银为基础，通过改变材料电性使其变为正再用静电吸附的方式在外包裹负电荷层的葡萄糖氧化酶，再通过活化的羧基链接雷公藤红素，最后再利用样品中牛血清白蛋白进行二次生物矿化法合成硫化铜，构筑了一种具有肿瘤微环境响应可激活型诊疗一体化纳米探针。
本发明探针可在肿瘤微环境受过氧化氢作用，使得CuS快速降解，暴露出Ag2S:Au实现NIR-II荧光的“打开”，葡萄糖氧化酶和雷公藤红素能够提高肿瘤微环境中过氧化氢含量，有效提升Cu离子介导的化学动力疗法，有效提高纳米探针成像与治疗性能。
本发明制备了一种简单、快速、可控的激活型诊疗一体化纳米探针，该纳米探针晶粒粒径为6～8nm，产物纯度达到99.9％。
附图说明
图1为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的透射电子显微镜图。
图2为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针中的NIR-II荧光光谱图。
图3为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的NIR-II荧光激活性能。
图4为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的随时间降解性能研究及其透射电子显微镜图。
图5为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的Balb/c小鼠NIR-II荧光活体成像图。
图6为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的Balb/c小鼠活体抗肿瘤治疗效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白100mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硝酸银固体5.094mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将1.6mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌0.5h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将0.8mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取0.8mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硝酸铜三水合物加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌0.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例2
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白95mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硝酸银固体4.8mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将1.7mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌1h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将0.8mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取0.8mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硝酸铜三水合物加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌0.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例3
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白90mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硝酸银固体7.641mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将1.8mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌1.5h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取0.9mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硝酸铜三水合物加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌0.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例4
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白98mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硫酸银固体10.188mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将2.3mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌0.5h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1.5mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取1.2mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硫化铜加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/mL的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌3h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例5
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白90mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硝酸银固体6.1128mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将2mg溴化金加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌3h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1.3mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取1mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硝酸铜三水合物加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌2.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例6
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白85mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取溴化银固体7.1316mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将2.1mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌2.5h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1.2mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取0.8mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg草酸铜加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌1h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例7
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白80mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取硝酸银固体5.094mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将1.8mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌1.2h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取0.8mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg氯化铜加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌0.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
实施例8
一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备：
S1、取牛血白蛋白98mg加入3.68mL去离子水中，置于超声波分散仪内进行溶解分散，频率50KHz，分散时间15min，室温搅拌5min，形成透明溶液的牛血清白蛋白水溶液；
S2、称取氯化银固体10.188mg加入0.12mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min(50KHz)，快速加至S1透明溶液中，强力搅拌5min，溶液变为白色；
S3、将2.2mg四氯金酸三水合物加入0.018mL去离子水中，超声分散5min(50KHz)后，滴入S2溶液中，搅拌30min；加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整混合溶液pH值为12；
S4、取0.1mL浓度为0.1mol/L的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S4中混合溶液，加热至60℃恒温搅拌0.5h，溶液由棕色变为棕黑色，产物经去离子水洗涤，3500r/min超滤离心管分离，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹硫化银纳米颗粒(Ag2S:Au@BSA)；
S5、将Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，通过超声分散将葡萄糖氧化酶GOx粉末配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将1.5mL葡萄糖氧化酶水溶液缓慢滴加入10mL Ag2S:Au@BSA水溶液中，充分搅拌60min，经去离子水洗涤和离心1次，冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S6、将Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒配制成浓度为1mg/mL的水溶液，将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺混按照摩尔比为1:1:1混合，搅拌12h后，取1.2mL加至1mL Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒水溶液中，经去离子水洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S7、将步骤S6所得到的纳米颗粒配成50mg/mL的水溶液，将3.7512mg硫化铜加入0.08mL 2mol/L的硝酸溶液中，超声分散5min后加至水溶液中，搅拌15min后，用5mol/L的氢氧化钠溶液调整混合溶液pH值为12；
S8、取0.0075mL浓度为40mg/ml的九水合硫化钠水溶液匀速滴加入S7的溶液中，60℃下搅拌0.5h，得到激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
本发明将制备得到的诊疗一体化纳米探针溶于PBS缓冲液，通过鼠尾静脉注射进行给药，检测纳米探针的成像性能与治疗效果。
图1为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的透射电子显微镜图，由图可知，所合成诊疗一体化纳米工厂具有核壳结构，同时从图中可看出纳米探针分布均一，直径约6.77nm。
图2为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的NIR-II荧光光谱图，由图可知，随着金源的加入，硫化银的荧光强度大幅度提升，随着硫化铜的合成，该材料的荧光几乎完全掩蔽。
图3为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针在肿瘤微环境中不同时间的荧光打开性能研究，由图可知，诊疗一体化纳米探针在模拟肿瘤微环境过氧化氢溶液中(1mM)中不同时间的近红外二区荧光图显示，纳米探针的荧光在3小时几乎完全打开，12小时完全打开。
图4为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针的降解性能研究，由图可知，诊疗一体化纳米探针随着时间的增加，在模拟肿瘤微环境中粒径逐渐变小，在3小时几乎完全降解，12小时完全降解。
图5为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针Balb/c小鼠活体NIR-Ⅱ荧光成像图。由图可知，在Balb/c小鼠尾静脉给药后8小时肿瘤部位荧光最强，之后随时间增加荧光强度逐渐减弱。
图6为本发明实施例1所合成的诊疗一体化纳米探针Balb/c小鼠活体抗肿瘤治疗效果图。如图所示，对裸鼠进行化学动力治疗治疗，给Balb/c小鼠鼠尾静脉分别注射诊疗一体化纳米探针与PBS，注射16d后，纳米探针组Balb/c小鼠肿瘤远小于注射PBS对照组，治疗效果好。
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种可激活型诊疗一体化纳米探针，其特征在于：所述纳米探针为Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel，该探针包括Ag2S:Au纳米颗粒、在Ag2S:Au纳米颗粒表面负载的葡萄糖氧化酶和雷公藤红素以及利用Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒的牛血清白蛋白构筑的CuS；
所述Ag2S:Au纳米颗粒的制备方法如下：
S1：将牛血清白蛋白加入去离子水中，超声分散后，高速搅拌，形成淡黄色透明溶液，即牛血清白蛋白水溶液；
S2：将无机银源固体加入硝酸溶液中，超声分散均匀，加至步骤S1中的牛血清白蛋白溶液中，高速搅拌；
S3：将无机金源加入去离子水中，超声分散后，滴入步骤S2的混合溶液，高速搅拌；
S4：用氢氧化钠溶液调节步骤S3混合溶液的pH值为碱性；
S5：取九水合硫化钠水溶液匀速滴加入步骤S4的混合溶液中，高速搅拌，形成棕黑色溶液；
S6：将步骤S5得到的棕黑色溶液经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹的硫化银纳米颗粒Ag2S:Au@BSA。
2.根据权利要求1所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针，其特征在于：所述纳米探针的晶体直径为6~8nm。
3.一种权利要求1或2所述的可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：先通过牛血清白蛋白生物矿化法制备Ag2S:Au纳米颗粒；然后通过物理吸附和偶联作用在Ag2S:Au纳米颗粒表面负载葡萄糖氧化酶GOx和雷公藤红素；最后利用Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒的牛血清白蛋白构筑CuS，得到最终纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
4.根据权利要求3所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：将牛血清白蛋白加入去离子水中，超声分散后，高速搅拌，形成淡黄色透明溶液，即牛血清白蛋白水溶液；
S2：将无机银源固体加入硝酸溶液中，超声分散均匀，加至步骤S1中的牛血清白蛋白溶液中，高速搅拌；
S3：将无机金源加入去离子水中，超声分散后，滴入步骤S2的混合溶液，高速搅拌；
S4：用氢氧化钠溶液调节步骤S3混合溶液的pH值为碱性；
S5：取九水合硫化钠水溶液匀速滴加入步骤S4的混合溶液中，高速搅拌，形成棕黑色溶液；
S6：将步骤S5得到的棕黑色溶液经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包裹的硫化银纳米颗粒Ag2S:Au@BSA；
S7：将步骤S6得到Ag2S:Au@BSA纳米颗粒配制成分散均匀的水溶液，然后缓慢滴加葡萄糖氧化酶水溶液，充分搅拌，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒；
S8：先将雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺混合，然后将混合后的溶液与步骤S7中Ag2S:Au@BSA-GOx纳米颗粒的水溶液混合，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，得到Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒；
S9：将步骤S8中合成的Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒配成50 mg/ml的水溶液，将无机铜源固体加入硝酸溶液中，超声分散后，快速加至Ag2S:Au@BSA-GOx/Cel纳米颗粒水溶液中，高速搅拌；
S10：用氢氧化钠溶液调整步骤S9混合溶液的pH值为碱性；
S11：取九水合硫化钠水溶液匀速滴加入步骤S10的混合溶液中，高速搅拌后，经洗涤、离心分离、冷冻干燥，即得到所述可激活型诊疗一体化纳米探针Ag2S:Au-CuS@BSA-GOx/Cel。
5.根据权利要求4所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中牛血清白蛋白与去离子水的比例为21-27 mg：1 mL；所述步骤S2中无机银源固体与硝酸溶液的比例为42.45-84.9 mg：1mL；所述步骤S3中无机金源与去离子水的比例为88~127mg：1mL；所述步骤S5中九水合硫化钠水溶液的浓度为0.1 mol/L，用量为0.1 mL；所述步骤S7中Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液与葡萄糖氧化酶水溶液的体积比1 mL：0.08~0.15 mL；所述步骤S8中雷公藤红素与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺的摩尔比为1：1：1，Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液与雷公藤红素、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺混合溶液的质量浓度比为1mg/mL：0.8~1.2mg/ml；所述步骤S9中无机铜源固体与硝酸溶液的比例为47mg：1mL；所述步骤S11中九水合硫化钠水溶液的浓度为40 mg/mL，用量为0.0075 mL。
6.根据权利要求4所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中超声分散的频率为50 KHz，时间为15 min；搅拌温度为室温，搅拌时间为5min；所述步骤S2和S3中超声分散的频率为50 KHz，时间为5 min；所述步骤S3中搅拌时间为30 min；所述步骤S5的搅拌温度为60 ℃，搅拌时间为0.5~3 h；所述步骤S6、S7、S8、S9中离心分离采用超滤分离管，转速为3500 r/min，时间为15 min；所述步骤S7中搅拌时间为60min；所述步骤S9中搅拌时间为15 min；所述步骤S11中搅拌温度为60℃，搅拌时间为0.5~3h。
7.根据权利要求4所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2、S9中硝酸溶液的浓度为2 mol/L；所述步骤S4和S9中氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L；所述步骤S4和S10调节后的pH值为12；所述步骤S7中Ag2S:Au@BSA纳米颗粒水溶液的浓度为1 mg/mL，葡萄糖氧化酶水溶液的浓度为1 mg/mL。
8.根据权利要求4所述的一种可激活型诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于：所述无机银源为硝酸银、氯化银、硫酸银、溴化银中的任意一种或几种；无机金源至少为四氯金酸三水合物和溴化金的一种；所述无机铜源至少为硝酸铜三水合物、硫化铜、草酸铜、氯化铜中的一种。
9.一种权利要求1所述的可激活型诊疗一体化纳米探针的应用，其特征在于：用于制备在肿瘤微环境中对过氧化氢特异性响应的试剂。
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