CN113456837B - 一种尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂及其制备方法，是先以化学刻蚀和超声波辅助剥离技术将MAX相的Ti3AlC2材料刻蚀剥离成大尺寸薄层MXene材料Ti3C2，再通过超声探针破碎仪对Ti3C2的纳米尺寸进行调控，最后以BSA包裹一定纳米尺寸的Ti3C2，改善其生物相容性，得到粒径尺寸在30～200nm范围内可调的MXene@BSA纳米诊疗剂，不仅解决了现有MXene粒径尺寸与肿瘤部位渗透匹配性差，以及生物毒性大的问题，而且具有在穿透深度更深的NIR‑II窗口实现PAI成像和光热治疗诊疗一体化的功能，拓宽了Ti3C2 MXene纳米诊疗剂PAI成像的响应区间。
Description
技术领域
本发明属于生物医学纳米材料技术领域，涉及一种可以用于肿瘤诊疗一体化的纳米诊疗剂，特别是涉及一种尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂及其制备方法。
背景技术
迄今为止，癌症依然是各国死亡的主要原因，也是延长预期寿命最重要的障碍。“预防、早诊、早治”是近40年间癌症发生率和死亡率持续下降的关键(CA-Cancer. J.Clin. 2018, 68: 7-30.)。
然而，目前仍缺乏针对肿瘤的早期诊断治疗临床方法。传统X射线、超声、CT、MRI和PET等成像手段对早期肿瘤的定位、定性难度较大，且现有的临床治疗手段多为毒副作用较大的放、化疗，极大程度上限制了肿瘤的精准诊疗效果。因此，寻找更安全高效的诊断和治疗手段是迫切需要的。
随着纳米影像的持续发展，光声成像(PAI)作为一种无损无创的医学影像技术，综合了光学成像高对比度和声学成像高空间分辨率的优势，已成为当今世界研究的热点之一。
与传统诊疗剂相比，多功能纳米材料具有独特的物理、化学和生理性质，并具有良好的生物相容性和靶向性。而肿瘤组织的血管具有异常增殖的特点：血管密度高而管壁完整性差，间隙宽，对大分子颗粒具有通透性且淋巴回流比较慢，因此，一定大小的纳米粒子可以进入并停留于肿瘤组织，实现在肿瘤组织中高效准确地富集，这种效应被称为“增强渗透滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应”，属于被动靶向效应(ChinaOncology. 2019, 29(5): 328-337.)。
研究表明，纳米诊疗剂的粒径尺寸与肿瘤的匹配性是实现肿瘤部位高聚集、长滞留的重要因素之一(Nat. Rev. Clin. Oncol. 2010, 7: 653-64.；Annu. Rev. Biomed.Eng. 2012, 14: 1-16.)。当纳米颗粒较大时，纳米诊疗剂会被困在细胞间的细胞外基质中，不会渗出血管太远，渗透性较差；而当纳米颗粒较小时，纳米诊疗剂在肿瘤部位的停留短，特异性靶向效果较差。因此，对纳米诊疗剂粒径的精准调控，是使纳米诊疗剂在肿瘤部位实现高聚集深穿透，进而发挥最大作用的关键步骤。
近年来，一种新型的二维纳米材料MXene因较大的表面积、强的NIR吸收性能、优良的亲水性和表面功能可修饰性，在生物医药领域引起了较大的关注。
已有大量研究(Nanoscale. 2017, 9: 17859-17864；Chemistry of Materials.2017, 29: 8637-8652.)表明，Ti3C2 MXene纳米材料具有优异的NIR-I窗口PAI成像性能和光热消除肿瘤功能。但以上研究均不能对Ti3C2 MXene纳米材料的粒径进行精准调控制备，这将大大削弱纳米诊疗剂在肿瘤部位的富集以及后续的诊疗效果。
此外，目前的大多数纳米材料仅能在组织穿透较浅且存在背景吸收干扰的NIR-I窗口(650～900nm)实现光声成像，极大的限制了其在临床上的应用。
为了更好地贯彻“预防、早诊、早治”的理念，开发具有高穿透深度、高信噪比的NIR-II窗口(900～2000nm)成像引导的多手段协同治疗的诊疗一体化研究，已成为当今癌症诊疗研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂及其制备方法，以解决现有MXene粒径尺寸与肿瘤部位渗透匹配性差及生物毒性大的问题。
提供所述纳米诊疗剂在PAI上的应用，是本发明的另一发明目的。
本发明所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂是先以化学刻蚀和超声波辅助剥离技术将MAX相的Ti3AlC2材料刻蚀剥离成大尺寸薄层MXene材料Ti3C2，再通过超声探针破碎仪对Ti3C2的纳米尺寸进行调控，最后以BSA包裹一定纳米尺寸的Ti3C2，改善其生物相容性，得到粒径尺寸在30～200nm范围内可调的MXene@BSA纳米诊疗剂。
其中，BSA为牛血清白蛋白的英文缩写。
进一步地，本发明所述尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂是按照下述方法制备得到的：
1）、以MAX相Ti3AlC2为原料，经过自上而下的方法，在含有LiF的浓HCl溶液中进行刻蚀，并经进一步的超声剥离，得到少层或单层的MXene材料Ti3C2；
2）、继续以超声探针破碎仪对上述得到的少层或单层的MXene材料Ti3C2进行破碎处理，得到小尺寸MXene材料Ti3C2；
3）、以BSA对所述小尺寸MXene材料Ti3C2进行包裹，制备得到粒径30～150nm的MXene@BSA纳米诊疗剂。
更进一步地，本发明所述尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂更具体的制备方法为：
1）、以含有LiF的浓HCl溶液作为刻蚀液，将Ti3AlC2置于其中，室温搅拌均匀，升温至40～60℃搅拌反应24～36h，对反应产物进行离心洗涤，收集固体产物并干燥；
2）、将固体产物分散于去离子水中，惰性氛围下超声处理，经离心分离，取上清液得到Ti3C2溶液；
3）、将Ti3C2溶液稀释至浓度1～8mg/mL，置于超声探针破碎仪中，以功率80～110W破碎3～10min，离心取上清液，得到粒径较小的MXene纳米片溶液；
4）、向搅拌下的MXene纳米片溶液中滴加BSA溶液，室温反应30～60min，使用截留分子量30kDa的超滤离心管离心洗涤，冷冻干燥，制备得到粒径30～150nm的MXene@BSA纳米诊疗剂。
优选地，所述步骤1）中，是将LiF溶解在6～12M的浓HCl溶液中，得到LiF质量浓度为2～15%的刻蚀液。
优选地，所述步骤1）中，是在每mL刻蚀液中加入0.01～0.05g Ti3AlC2。
优选地，所述步骤1）中，是将反应产物洗涤至离心后上清液的pH≥6，并将收集的固体于60℃下干燥。
优选地，所述步骤2）中，是将固体产物分散于去离子水中，惰性氛围下，以功率100～200W的超声持续处理3～5h。
优选地，所述步骤4）中，纳米Ti3C2与BSA的质量比为0.1～0.6∶1。
优选地，所述步骤4）中，BSA溶液的浓度为10mg/mL。
优选地，所述步骤4）中，将超滤离心管在转速3500rpm下进行离心洗涤10～30min。
本发明制备的MXene@BSA纳米诊疗剂可以用于制备NIR-II窗口PAI成像诊疗剂应用。
本发明通过采用机械的超声探针破碎技术调控纳米诊疗剂，实现了Ti3C2粒径尺寸大小的调控，从而实现了MXene@BSA纳米诊疗剂与不同肿瘤的匹配性，通过EPR效应被动靶向在不同的肿瘤组织部位内达到最大富集，使纳米诊疗剂在肿瘤组织内高效积累的同时，具有长循环的能力以及更深的穿透深度。
BSA具有良好的生物相容性和精确的几何结构，且易于功能化，在纳米医学领域常被作为提升生物相容性的物质使用。本发明将合适粒径的Ti3C2包裹在BSA中，避免了直接暴露Ti3C2导致血液毒性大的问题，改善了MXene@BSA纳米诊疗剂的生物相容性。
NIR-II比NIR-I具有更大的穿透深度，能够实现肿瘤早期诊断的精准定位。本发明在调控MXene的粒径大小，制备MXene@BSA纳米诊疗剂的过程中，发现不同于之前文献报道的传统Ti3C2复合纳米诊疗剂仅能在NIR-I窗口实现PAI成像的局限性，本发明制备的MXene@BSA纳米诊疗剂具有在穿透深度更深的NIR-II(1100nm)窗口实现PAI成像和光热治疗诊疗一体化的功能，从而拓宽了Ti3C2 MXene纳米诊疗剂PAI成像的响应区间。这可能是由于BSA包含多种氨基酸，可以与Ti3C2Tx(Tx=-O、-F、 -OH)的表面端基Tx发生键合作用，将两者耦合，一方面提高纳米材料的生物相容性，另一方面可能改变Ti3C2Tx的局部电子结构，促进其对NIR-II窗口响应的协同作用所致。
本发明的纳米诊疗剂不仅可以直接用于NIR-II窗口PAI成像，其具有光热效应的Ti3C2 MXene纳米材料还可以原位杀伤肿瘤细胞，同时可以增加肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，因此可以将化疗、放疗、光疗和免疫治疗等多种治疗手段相结合，达到协同治疗肿瘤的目的。
本发明制备的MXene@BSA纳米诊疗剂还可以用作抗癌药物的运输载体，装载抗肿瘤药物同时实现NIR-II窗口PAI成像以及肿瘤的光热、化学动力学治疗和化疗相结合的联合治疗，在纳米医学肿瘤诊疗一体化领域具有良好的应用前景，尤其是对更深处的病灶诊断方面具有良好的应用前景。
本发明纳米诊疗剂制备原料廉价易得，制备方法简单易行、经济环保，不产生有毒有害副产物，制备条件常温常压、简单安全，易于实现工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的动态光散射(DLS)粒度分析图谱。
图2是本发明实施例2提供的动态光散射(DLS)粒度分析图谱。
图3是本发明实施例3提供的动态光散射(DLS)粒度分析图谱。
图4是小鼠尾静脉注射实施例1诊疗剂(a)和实施例3诊疗剂(b)在相同时间的PAI成像图(红色虚线包围为肿瘤部位)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中所使用的原料或试剂，除非特别说明，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中所涉及到的工艺、仪器及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，且在相关用途领域内均清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
由于合成的Ti3C2是具有一定韧性的纳米薄片，在本发明的实施例中，将其通过机械的超声探针破碎处理，通过改变破碎时间和超声功率实现对其的尺寸调控，以得到不同尺寸的Ti3C2，再向Ti3C2溶液中加入BSA，通过Ti3C2表面-OH基团与BSA中氨基酸反应产生键合作用，极大地提升Ti3C2的生物相容性，制备得到所述纳米诊疗剂。
本发明实施例中制备的纳米诊疗剂是将表面积较大并且具有NIR强吸收能力的Ti3C2包裹在BSA中，避免了直接暴露Ti3C2导致的血液毒性大的问题。因此，本发明实施例制备的纳米诊疗剂不仅可以直接用作NIR-II窗口PAI成像引导的光热诊疗一体化，而且还可以作为药物输运的载体，装载抗肿瘤药物的同时根据NIR-II窗口PAI成像实时监控纳米诊疗剂的去向，实现光热治疗、化学动力治疗及化疗相结合的联合治疗，在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景，尤其是对更深处病灶的诊断方面，具有良好的应用前景。
下述实施例中，为了方便后续对MXene浓度的确定，将制备得到的BTM-1水溶液冷冻干燥得到固体，然后配制成浓度为25、50、75、100、125、150、175、200ppm的MXene标准溶液，采用紫外可见分光光度计在794nm处测定出标准溶液的吸光度，利用朗伯比尔定律对其标定，得到标准溶液浓度与吸光度的函数曲线，以便后续过程中通过测定MXene水溶液的吸光度，采用外标法确定溶液的浓度，并进行准确的稀释。
实施例1。
称取1g LiF，缓慢加入到30mL的9M HCl溶液中，持续搅拌20min，再缓慢加入0.8gTi3AlC2，30℃下持续搅拌30h。
将上述反应得到的固体进行反复离心、水洗，洗至离心后上清液的pH≥6，收集固体于真空干燥箱中，60℃下干燥24h，得到多层Ti3C2材料固体。
在150mL水中加入0.8g多层Ti3C2材料，置于JT-240T超声波清洗器(40KHz，150W)中，氩气保护下超声处理4h后，以3000r/min的转速离心1.5h，收集深色上清液，得到薄层MXene(Ti3C2)溶液，记为TM-1，测定溶液的浓度为6mg/mL。
量取6mL薄层MXene(Ti3C2)溶液，使用SONICS VCX130PB/VCX130超声探针破碎仪，以功率80W破碎3min，破碎过程中超声7s、停3s。随后在8000r/min的转速下离心5min，取上层清液，得到尺寸较小的MXene纳米片溶液，记为BTM-1。
测定并调节所述BTM-1溶液的浓度为1mg/mL，吸取2mL溶液于15mL样品瓶中，搅拌下逐滴加入2mL浓度10mg/mL的BSA水溶液，室温下搅拌30min。
最后将得到的溶液置于截留分子量为30kDa的超滤离心管中，在转速3500r/min下离心10min，冷冻干燥，制备得到生物相容性较好的BTM-1@BSA纳米诊疗剂。
分别检测上述制备TM-1、BTM-1和BTM-1@BSA溶液的粒径，其动态光散射(DLS)粒度分析谱图如图1所示。
图中显示TM-1、BTM-1和BTM-1@BSA的粒径范围分别为90～500nm、45～95nm和65～210nm，平均粒径分别为148.7nm、49.5nm和130.9nm。
实施例2。
称取1.6g LiF，缓慢加入到20mL的9M HCl溶液中，持续搅拌30min，再缓慢加入1.0g Ti3AlC2，45℃下持续搅拌24h。
将上述反应得到的固体进行反复离心、水洗，洗至离心后上清液的pH≥6，收集固体于真空干燥箱中，60℃下干燥24h，得到多层Ti3C2材料固体。
在200mL水中加入0.8g多层Ti3C2材料，置于JT-240T超声波清洗器(40KHz，150W)中，氩气保护下超声处理3h后，以3500r/min的转速离心1h，收集深色上清液，得到薄层MXene(Ti3C2)溶液，记为TM-2，测定溶液的浓度为5mg/mL。
量取5mL薄层MXene(Ti3C2)溶液，使用SONICS VCX130PB/VCX130超声探针破碎仪，以功率100W破碎5min，破碎过程中超声7s、停3s。随后在10000r/min的转速下离心8min，取上层清液，得到尺寸较小的MXene纳米片溶液，记为BTM-2。
测定并调节所述BTM-2溶液的浓度为3mg/mL，吸取4mL溶液于15mL样品瓶中，搅拌下逐滴加入2mL浓度10mg/mL的BSA水溶液，室温下搅拌30min。
最后将得到的溶液置于截留分子量为30kDa的超滤离心管中，在转速3500r/min下离心10min，冷冻干燥，制备得到生物相容性较好的BTM-2@BSA纳米诊疗剂。
分别检测上述制备TM-2、BTM-2和BTM-2@BSA溶液的粒径，其动态光散射(DLS)粒度分析谱图如图2所示。
图中显示，TM-2、BTM-2和BTM-2@BSA的粒径范围分别为100～500nm、15～40nm和30～150nm，平均粒径分别为169.72nm、21.5nm和74.6nm。
实施例3。
称取0.8g LiF，缓慢加入到10mL的9M HCl溶液中，持续搅拌10min，再缓慢加入0.5Ti3AlC2，50℃下持续搅拌30h。
将上述反应得到的固体进行反复离心、水洗，洗至离心后上清液的pH≥6，收集固体于真空干燥箱中，60℃下干燥36h，得到多层Ti3C2材料固体。
在100mL水中加入0.4g多层Ti3C2材料，置于JT-240T超声波清洗器(40KHz，150W)中，氩气保护下超声处理5h后，以3500r/min的转速离心1h，收集深色上清液，得到薄层MXene(Ti3C2)溶液，记为TM-3，测定溶液的浓度为3mg/mL。
量取3mL薄层MXene(Ti3C2)溶液，使用SONICS VCX130PB/VCX130超声探针破碎仪，以功率100W破碎10min，破碎过程中超声7s、停3s。随后在12000r/min的转速下离心3min，取上层清液，得到尺寸较小的MXene纳米片溶液，记为BTM-3。
测定并调节所述BTM-3溶液的浓度为1mg/mL，吸取3mL溶液于15mL样品瓶中，搅拌下逐滴加入1mL浓度10mg/mL的BSA水溶液，室温下搅拌30min。
最后将得到的溶液置于截留分子量为30kDa的超滤离心管中，在转速3500r/min下离心30min，冷冻干燥，制备得到生物相容性较好的BTM-3@BSA纳米诊疗剂。
分别检测上述制备TM-3、BTM-3和BTM-3@BSA溶液的粒径，其动态光散射(DLS)粒度分析谱图如图3所示。
图中显示，TM-3、BTM-3和BTM-3@BSA的粒径范围分别为90～500nm、8～30nm和20～70nm，平均粒径分别为142.0nm、13.5nm和43.8nm。
构建Hep2肿瘤模型小鼠，尾静脉注射本发明制备的纳米诊疗剂，选择规律性时间节点分别进行PAI成像扫描。
试验结果显示，未处理的MXene无法直接注射到小鼠体内，会导致小鼠死亡或无法成像。
图4是使用实施例1平均粒径130.9nm的诊疗剂与实施例3平均粒径43.8nm的诊疗剂的成像效果对比。可以看出，实施例3诊疗剂在肿瘤部位(图中红色虚线椭圆部位)有大量的富集，能达到PAI成像对肿瘤的示踪效果，也即可以达到诊断Hep2肿瘤的效果。而实施例1诊疗剂在Hep2肿瘤部位几乎没有富集，也就无法成像，说明实施例1诊疗剂对于Hep2肿瘤模型小鼠是没有效果的。
对于不同的肿瘤模型，对纳米诊疗剂的粒径大小要求不同，比如膀胱癌细胞要求的粒径更小，因此对诊疗剂的粒径要求没有统一标准，本发明提供的制备方法可以制备不同粒径的诊疗剂，以针对不同的肿瘤诊断。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是：
1）、以含有LiF的浓HCl溶液作为刻蚀液，将Ti3AlC2置于其中，室温搅拌均匀，升温至40～60℃搅拌反应24～36h，对反应产物进行离心洗涤，收集固体产物并干燥；
2）、将固体产物分散于去离子水中，惰性氛围下超声处理，经离心分离，取上清液得到Ti3C2溶液；
3）、将Ti3C2溶液稀释至浓度3mg/mL，置于超声探针破碎仪中，以功率100W破碎10min，破碎过程中超声7s、停3s；离心取上清液，得到粒径8～30nm的MXene纳米片溶液；
4）、向搅拌下的浓度1mg/mL的MXene纳米片溶液中滴加浓度10mg/mL的BSA溶液，室温反应30min，使用截留分子量30kDa的超滤离心管离心洗涤，冷冻干燥，制备得到粒径20～70nm的MXene@BSA纳米诊疗剂。
2.根据权利要求1所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是将LiF溶解在6～12M的浓HCl溶液中得到LiF质量浓度为2～15%的刻蚀液。
3.根据权利要求1所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是在每1mL刻蚀液中加入0.01～0.05g Ti3AlC2。
4.根据权利要求1所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是所述步骤1）中，是将反应产物洗涤至离心后上清液的pH≥6，并将收集的固体于60℃下干燥。
5.根据权利要求1所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是所述步骤2）中是以功率100～200W的超声持续处理3～5h。
6.根据权利要求1所述的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂的制备方法，其特征是纳米Ti3C2与BSA的质量比为0.1～0.6∶1。
7.以权利要求1所述制备方法制备得到的尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂。
8.权利要求7所述尺寸可控的MXene@BSA纳米诊疗剂在制备PAI成像诊疗剂中的应用。
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