CN115246958A - 具有与组织、细胞生长相适应的孔壁结构的交联透明质酸凝胶 - Google Patents

Abstract

本申请涉及交联的透明质酸凝胶及其颗粒。本发明还涉及本发明交联透明质酸凝胶的制备方法、包含本发明交联透明质酸凝胶的组合物，及其用途。

Description

具有与组织、细胞生长相适应的孔壁结构的交联透明质酸 凝胶

技术领域：

本发明涉及医用生物材料领域，特别涉及交联的透明质酸凝胶及其颗粒。本发明还涉及本发明交联透明质酸凝胶的制备方法、包含本发明交联透明质酸凝胶的组合物，及其用途。

背景概况：

透明质酸是人体皮肤、软骨组织和关节润滑液的重要成分，它为一链状聚合物，由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位重复连接而成。得益于其高保水性、润滑性、无种属差异性等优点，天然透明质酸被广泛应用于医学填充美容、骨关节炎的治疗以及眼部手术中。

天然透明质酸存在着在组织内半衰期短、易被降解和扩散的缺点，这大大限制了其在医学美容填充等领域的应用。将天然透明质酸经化学交联剂交联修饰再经颗粒化为可注射的凝胶颗粒是目前解决天然透明质酸上述问题的常用方法，其中化学交联修缮是为了提高产品的抗降解性，颗粒化是为了让凝胶可以被从注射针中推出至皮肤内。如CN107223061公开了一种无菌组合物，该组合物包含与1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联的交联透明质酸，可用于下巴区域、下颌外形或鼻子的雕塑、填充或矫正。如CN104072814公开了一种用于制备交联透明质酸的组合物，包含浓度为15-25wt%的透明质酸碱性水溶液和交联剂，所述组合物在频率0.02-1Hz下的Tanδ值为0.5-1.5。如CN1950039公开了一种基于葡萄糖胺聚糖的粒径为1到5mm的可注射凝胶颗粒，其制备方法包括以所需浓度制备粘弹性介质构成的凝胶，并将该凝胶物理破碎，例如剁碎、捣碎或将该凝胶通过具有适当孔径的过滤器。该颗粒可以用于软组织增添的植入物。

得益于其无免疫原性，体积支撑能力强，填充过程可逆，交联透明质酸凝胶被许多人认为是最理想的皮肤填充剂之一。然而，从组织工程的角度考虑，一个好的组织填充剂在提供足够的力学支撑作用的同时，应不影响或支持细胞粘附、生长和分化表型，应不影响或支持营养物质和代谢产物的输送。然而，交联透明质酸凝胶这一类材料是通过高分子溶液交联形成的富水的交联网络结构，在常规的制备方法下（如上述提及CN107223061、CN104072814），由于交联在均匀溶液的分子结构层面发生，形成的交联网络虽然具有空间上的三维结构但孔径极小，当这种致密交联的凝胶颗粒被注射到组织中时，在容积填充的同时也形成了一个惰性物理屏障，阻碍了局部组织的新陈代谢活动，易导致面部僵硬，表情不自然。而若要通过减小凝胶颗粒的粒径来规避这个问题，却又往往导致凝胶缺乏足够的支撑能力，无法达到预期的组织填充效果。

综上所述，常规交联透明质酸凝胶只能实现对组织的惰性填充增容，无法支持局部组织的新陈代谢，也容易导致面部僵硬，表情不自然，在代谢完成后也往往失去全部填充效果，远期效果较差。因此，亟需一种具有与组织、细胞生长相适应的的交联透明质酸凝胶，在维持填充作用的同时，也能支持细胞粘附、生长和分化表型，支持营养物质和代谢产物的输送，注射后面部自然，也能支持远期皮肤容积再生修复。

发明内容：

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有孔壁结构的交联透明质酸凝胶，其用于医学填充美容，填充部位优选在局部的组织需要新陈代谢且需提供足够支撑的部位，包括人体，例如人类中的鼻唇沟、下巴、下颌外形、面颊、颧弓、眼周、眉间、鼻梁、山根等。

本发明所述的凝胶克服了已知交联透明质酸的缺点，所述凝胶与组织细胞生长相适应的孔壁结构特征，在维持填充作用的同时，也能支持细胞粘附、生长和分化表型，支持营养物质和代谢产物的输送，注射后面部自然，在代谢完成后由于自体组织、细胞的再生，也能维持一定的矫正效果。

根据本发明一实施方案，孔壁结构的孔径中位数在50-1000 um之间，优选为80-500 um，更优选为90-300 um，甚至100-200um；本发明所述凝胶的孔径为反映凝胶孔壁结构的特征值，定义为孔的最远端两点之间的距离。凝胶的孔径可以使用常规方法测量，如通过根据如下方法量化：将凝块在浓度为30、50、70、90、100%的乙醇水溶液中依序浸没20分钟以实现梯度脱水，在硅氮烷中浸没10分钟后真空干燥。将干燥后的样品进行SEM表征，视野下随机选取4个500×500 μm的正方形，随机测量其中20个孔径并进行统计分析，得到孔径的中位数。

根据本发明另一实施方案，凝胶颗粒的粒径中位数D₅₀在50-1000 um之间，优选为100-800 um，更优选为300-700 um，甚至400-600um；本发明所述凝胶颗粒的粒径为反映凝胶颗粒大小的特征值，可以通过配有湿法分散仪的激光粒度仪在0.9%的氯化钠水溶液中测定得到的。

根据本发明另一实施方案，所述的凝胶的颗粒粒径与孔径间存在着相适应关系，孔壁结构的孔径中位数与凝胶颗粒的粒径中位数的比值在0.05-1之间，优选为0.1-0.8，更优选为0.1-0.6，甚至0.15-0.5。

根据本发明另一实施方案，所述凝胶的溶胀度在20-200之间，优选为40-150，更优选为40-100。溶胀度是反应凝胶交联程度的重要参数。同样条件下，凝胶的交联度越大，溶胀度越小。溶胀度可以使用常规方法测量，如通过如下方法量化：将凝胶在0.9%氯化钠溶液中浸没一小时，其重量与其完全干燥后的重量的比值。

根据本发明另一实施方案，不希望受任何理论束缚，申请人发现，所述凝胶在孔径与组织、细胞生长相适应的前提下，凝胶的颗粒粒径越大或溶胀度越低，凝胶孔壁结构的稳定性越好，弹性模量越大，塑性效果越好。但推注难度越高，推出力越大，越不容易注射到皮下，也难以进行精准操作；凝胶颗粒粒径越小或溶胀度越高，凝胶孔壁结构的稳定性越差，凝胶推出力越低，但弹性模量也越低，越容易崩塌，支撑性能和维持时间下降。申请人惊讶地发现，在符合下式的条件下，本发明所述的凝胶颗粒，孔径与组织、细胞生长相适应，也能具有较优的体积填充性能和合适的推出力：

50≤溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)≤600。

根据本发明另一实施方案，所述凝胶的弹性模量在1Hz下为100Pa至1000Pa，优选为200Pa至500 Pa。弹性模量可以使用常规方法测量，如使用TA的DHR旋转流变仪，在间隙高度为1mm时使用40mm的板直径，在25℃恒温下测定的。其中，每次测量在0.8%的应变和1Hz的频率下进行。

根据另一个具体实施方式，所述的交联透明质酸凝胶的推出力在5N到30N之间，更优选为5N到20N之间。不希望受任何理论束缚，申请人发现，本发明所述凝胶的推出力为反映凝胶可注射性的特征值，可以使用常规方法测量，如使用如下方法量化：将1毫升凝胶样品装入一个长80mm、内径为6.4 mm的圆筒内，圆筒的前段接有一根27G的注射针。以30mm/分钟的挤压速率将凝胶从注射针中推出时，所需的力的平均值记为推出力。

根据本发明另一实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，所述凝胶通常包含含有与选自下述交联剂交联的透明质酸(HA)的凝胶，所述交联剂选自缩水甘油醚、双环氧化物、双碳二亚胺、二乙烯基砜、多功能聚乙二醇基交联剂等。所述交联剂例如但不限于1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、1,2-双（2，3-环氧丙氧基）-2,3-乙烯、1,2,7,8-二环氧辛烷、乙二酰肼、己二胺、二乙烯基砜或其组合物。

根据本发明另一实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，其中用于交联的HA的分子量在10-500万之间，也可以是不同分子量的组合物，优选为50-400万之间，更优选为50-200万之间。

根据另一个具体实施方式，所述凝胶的HA浓度大于16 mg/ml，优选为20-25 mg/ml，更优选为21-23 mg/ml。

根据另一个具体实施方式，所述凝胶的交联度在2-10%之间，优选为4-8%，更优选为5-7%。

根据另一个具体实施方式，根据本发明的交联透明质酸凝胶还可具有下述至少之一：

- 所述的交联透明质酸凝胶的蛋白质含量不大于0.1质量%；

- 所述的交联透明质酸凝胶的重金属含量不大于5 μg/g；

- 所述的交联透明质酸凝胶的交联剂残留量不大于2 μg/g；和/或

- 所述的交联透明质酸凝胶的细菌内毒素含量不大于0.5 EU/mL。

本发明交联透明质酸凝胶具有上述孔壁结构特征，其能通过本发明所提供的交联透明质酸凝胶的制备方法而获得。

本发明还涉及的交联透明质酸凝胶的制备方法，包括（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物在水中均匀溶解。

根据另一个具体实施方式，制备方法包括（2）分散步骤：在溶解步骤获得的溶液中加入醇类物质并搅拌均匀形成混合溶液。

根据另一个具体实施方式，制备方法包括以下步骤：

（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物在水中均匀溶解；

（2）分散步骤：在上述溶液中加入醇类物质并搅拌均匀形成混合溶液；

（3）在混合溶液中加入交联剂并将pH调整至非中性；

（4）将混合溶液降温至-10至-50℃之间并进行交联反应。

（5）完成反应后，任选地中和、纯化和匀化。

根据本发明另一实施方案，所述的透明质酸金属盐，是指由透明质酸与金属离子所形成的的盐，例如但不限于透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐及其组合。

根据本发明另一实施方案，所述的透明质酸衍生物，是指含有羟基的多糖类，例如但不限于羧甲基纤维素、褐藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、鹿角菜胶或瓜尔胶，及其混合物。

根据本发明另一实施方案，所述的醇类物质指的是分子中含有跟烃基或苯环侧链上的碳结合的羟基的化合物，优选与水混溶的醇类物质，醇类物质选自具有1-26个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，特别地如具有1-16个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，甚至具有1-8个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，包括但不限于甲醇、乙醇、苯甲醇、乙二醇等。

根据本发明另一实施方案，所述的交联剂选自缩水甘油醚、双环氧化物、双碳二亚胺、二乙烯基砜、多功能聚乙二醇基交联剂及其混合物。所述交联剂例如但不限于1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、1,2-双（2，3-环氧丙氧基）-2,3-乙烯、1,2,7,8-二环氧辛烷、乙二酰肼、己二胺、二乙烯基砜，及其混合物。

根据本发明另一个实施方案，透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的浓度至少为0.05% w/v且不高于50% w/v，优选为0.1~30% w/v，甚至0.5~10% w/v，特别地2~8% w/v，尤其4%~6% w/v。

根据本发明另一个实施方案，醇类物质的浓度至少为0.05% v/v且不高于50% v/v，优选为0.1~30% v/v，甚至0.5~10% v/v，特别地2~8% v/v，尤其4%~6% v/v。

根据本发明另一个实施方案，交联剂浓度为0.05~20% w/w，优选为0.5~10% w/w，更优选1~8% w/w，更优选2%~6% w/w。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（3）中交联剂与透明质酸质量比为0.05~20% w/w，优选为0.5~10% w/w，更优选1~8% w/w，更优选2%~6% w/w。

根据本发明另一个实施方案，非中性环境可以是酸性环境，pH值为1~6，优选1~4，也可以是碱性条件，pH为9~14，优选11~14。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（4）中交联反应时间为100天以内，优选为1~28天，更优选3~21天，更优选5~14天。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（5）中的中和是指将交联反应中的非中性环境中和为中性环境，例如pH大约为7，如pH为6.5至7.5， 尤其6.8至7.2，特别地6.9至7.1。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（5）中的纯化是指将凝胶内未反应的交联剂残留量降低至2 μg/g以内，例如但不限于，将凝胶在pH为中性的磷酸盐缓冲液中透析至交联剂残留量低于2 μg/g。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（5）中的匀化是指将交联反应中所得的交联透明质酸通过例如但不限于碾碎、压碎、切割的方式均匀分散成颗粒或溶液。

本发明还涉及交联透明质酸凝胶在医疗美容例如但不限于面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正中的应用。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶在外科手术、软组织填充、伤口止血、伤口愈合、抗瘢痕、瘢痕修复、关节润滑、关节保护中的应用。

本发明还涉及本发明交联透明质酸凝胶、含本发明交联透明质酸凝胶的组合物或含本发明交联透明质酸凝胶的医疗设备在医疗美容例如面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正、外科手术或外科治疗如防粘连和抗瘢痕中的应用。尤其在软组织填充、伤口止血、伤口愈合、抗瘢痕、瘢痕修复、关节润滑、关节保护中的应用。

根据本发明的一个具体实施方式，本发明交联透明质酸凝胶在真皮层和皮下的应用。

本发明所述的凝胶克服了已知交联透明质酸的缺点，所述凝胶与组织细胞生长相适应的孔壁结构特征，在维持填充作用的同时，也能支持细胞粘附、生长和分化表型，支持营养物质和代谢产物的输送，注射后面部自然，在代谢完成后由于自体组织、细胞的再生，也能维持一定的矫正效果。

本发明所述的交联透明质酸凝胶，颗粒粒径与孔径相适应，也具有合适的推注力和优的体积填充性能。

本申请还包括下述技术方案及其组合：

1. 交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒具有多孔结构，孔径中位数在50-1000 um之间，优选为80-500 um，更优选为90-300 um，甚至100-200um。

2. 根据项1所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的粒径中位数D₅₀在50-1000 um之间，优选为100-800 um，更优选为300-700 um，甚至400-600um。

3. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的孔径的中位数与凝胶颗粒的粒径的中位数D₅₀的比值在0.05-1之间，优选为0.1-0.8，更优选为0.1-0.6，甚至0.15-0.5。

4. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的溶胀度在20-200之间，优选为40-150，更优选为40-100。

5. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中使得交联透明质酸凝胶颗粒符合下式：

50≤溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)≤600。

6. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的弹性模量在1Hz下为100Pa至1000Pa，优选为200Pa至500 Pa。

7. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶的推出力在5N到30N之间，更优选为5N到20N之间，甚至为10-15N之间。

8. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒包含含有与选自下述交联剂交联的透明质酸(HA)的凝胶，所述交联剂选自缩水甘油醚、双环氧化物、双碳二亚胺、二乙烯基砜、多功能聚乙二醇基交联剂等。所述交联剂例如但不限于1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、1,2-双（2，3-环氧丙氧基）-2,3-乙烯、1,2,7,8-二环氧辛烷、乙二酰肼、己二胺、二乙烯基砜或其组合物。

9. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒中HA浓度大于16 mg/ml，优选为20-25 mg/ml，更优选为21-23 mg/ml。

10. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其交联度在2-10%之间，优选为4-8%，更优选为5-7%。

11. 根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其具有下述至少之一：

-所述凝胶包含与1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联的交联透明质酸（HA）；

- 所述的交联透明质酸凝胶的蛋白质含量不大于0.1质量%；

- 所述的交联透明质酸凝胶的重金属含量不大于5 μg/g；

- 所述的交联透明质酸凝胶的交联剂残留量不大于2 μg/g；和/或

- 所述的交联透明质酸凝胶的细菌内毒素含量不大于0.5 EU/mL。

12. 制备交联透明质酸凝胶颗粒的方法，特别地根据前述项任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，包括以下步骤：

（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物溶解形成溶液；

（2）分散步骤：在上述溶液中加入醇类物质形成分散的混合溶液。

13. 根据前述项12的方法，包括以下步骤：

（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物在水中均匀溶解形成溶液。

14. 根据前述项12的方法，包括以下步骤：

（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物在水中均匀溶解形成溶液；

（2）分散步骤：在上述溶液中加入醇类物质并搅拌均匀形成分散的混合溶液；

（3）在混合溶液中加入交联剂并将pH调整至非中性；

（4）将混合溶液降温至-10至-50℃之间并进行交联反应。

（5）完成反应后，任选地中和、纯化和匀化。

15. 根据前述项12的方法，其中醇类物质选自具有1-26个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，特别地如具有1-16个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，甚至具有1-8个碳原子的一元醇、二元醇或多元醇，如甲醇、乙醇、苯甲醇、乙二醇。

16. 根据前述项任一项1-11所述交联透明质酸凝胶颗粒在制备医疗美容例如面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正、外科手术或外科治疗如防粘连和抗瘢痕的产品中的应用。

17. 根据前述项1-11任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒在制备软组织填充、伤口止血、伤口愈合、抗瘢痕、瘢痕修复、关节润滑、关节保护的产品中的应用。

18. 根据前述项1-11任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒在真皮层和皮下中的应用。

附图说明

图1示例出本发明凝胶在实施例3注入组织后的染色效果。

图2示例出现有技术凝胶在对比实施例3.1注入组织后的染色效果。

图3示例出另一现有技术凝胶在对比实施例3.2注入组织后的染色效果。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

本发明所述的透明质酸浓度是指透明质酸的质量与水的体积比（w/v%）。

本发明所述的氢氧化钠浓度是指氢氧化钠的质量与水的体积比（w/v%）。

本发明所述的1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）浓度是指BDDE的质量与透明质酸的质量比（w/w%）。

实施例1：

本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同反应条件下所得凝胶的孔壁结构孔径、凝胶颗粒粒径。将透明质酸在水中均匀溶解，随后加入一定浓度的乙醇并搅拌均匀。在混合溶液中加入一定浓度的BDDE，随后加入氢氧化钠直至其浓度达到1%（w/v）。将混合溶液降温至指定温度并进行交联反应。反应完成后用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。凝胶性能的测试方法如下所示。

凝胶孔壁结构的孔径是通过如下方式测得的：将凝块在浓度为30、50、70、90、100%的乙醇水溶液中依序浸没20分钟以实现梯度脱水，在硅氮烷中浸没10分钟后真空干燥。将干燥后的样品进行SEM表征，视野下随机选取4个500×500 μm的正方形，随机测量其中20个孔径并进行统计分析，得到孔径的中位数。

凝胶粒径的中位数是通过配有湿法分散仪的激光粒度仪在0.9%的氯化钠水溶液中测定得到的。

凝胶的溶胀都是通过将凝胶在0.9%氯化钠溶液中浸没一小时，其重量与其完全干燥后的重量的比值。

凝胶弹性模量是使用TA的DHR旋转流变仪，在间隙高度为1mm时使用40mm的板直径，在25℃恒温下测定的。其中，每次测量在0.8%的应变和1Hz的频率下进行。

凝胶的推出力是如下测定的：将1毫升凝胶样品装入一个长80mm、内径为6.4 mm的圆筒内，圆筒的前段接有一根27G的注射针。以30mm/分钟的挤压速率将凝胶从注射针中推出时，所需的力的平均值记为推出力。

结果显示，在这些条件下形成具有孔壁结构的交联透明质酸钠凝胶。

对比例1：本对比例在与实施例1相同的透明质酸钠浓度、交联剂用量和碱性条件下，在交联反应温度40℃、交联反应时间4h的常规工艺条件下制备凝胶。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度5 w/v%，交联反应温度40℃，交联反应时间4h。

将一定浓度的透明质酸在水中均匀溶解，在混合溶液中加入一定浓度的BDDE，随后加入氢氧化钠直至其浓度达到1%（w/v）。将混合溶液温度升温至指定温度并进行交联反应。反应完成后用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。凝胶性能的测试方法同实施例1。

结果显示，在对比例的条件下可以形成交联透明质酸钠凝胶，但其孔壁结构不明显，无法满足局部组织新陈代谢的需要。

表1 实施例1制备工艺条件下所得凝胶孔径

实施例2：

本实施例考察实施例1所得凝胶是否符合下式，以及其支撑能力和易推出性。

50≤溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)≤600

凝胶性能的测试方法同实施例1。

凝胶性质	孔径中位数（μm）	粒径中位数（μm）	溶胀度	弹性模量（Pa）	推出力（N）
						实施例1.1	158.3	562.4	82.5	194.4	16.4
实施例1.2	105.2	574.3	40.3	332.8	20.2
						实施例1.3	148.4	465.8	72.4	278.2	23.7
实施例1.4	102.6	598.5	36.1	368.1	14.5

结果显示，三种条件下凝胶的弹性模量较高，推出力也在适用范围内，满足临床注射的需要，并可以满足在面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正中的应用。

对比例2：

本对比例考察不在符合下式的条件下，本发明所述的凝胶的支撑能力和易推出性。

50≤溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)≤600

凝胶性能的测试方法同实施例1。

凝胶性质	孔径中位数（μm）	粒径中位数（μm）	溶胀度	弹性模量（Pa）	推出力（N）
						对比例2.1	18.3	539.4	33.1	563.1	38.4
对比例2.2	162.5	204.6	34.2	64.6	8.3

结果显示，两种条件下凝胶性能或者推出力过高，或者支撑性能太低，无法满足在面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正中的应用。结果显示，对比例2.1所示产品参数条件下，溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)超过了600的结果，产品支撑能力很高，但推出力过大，易推出性差，无法满足临床注射的需要。对比例2.2所示产品参数条件下，溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)低于50，此时产品凝胶颗粒结构稳定性大幅下降，弹性模量低，不具备足够的支持性能。综上所述，上述2个对比例都无法满足在面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正中的应用。

实施例3：

为了更好的说明本发明所述凝胶具有与组织、细胞生长相适应的孔壁结构特征，能够支持组织、细胞的迁移生长，支持信号分子、营养和代谢产物的运输。以实施例1.1为对象进行了皮内植入实验。

取新西兰兔，雄性四周龄，背部备皮消毒后将0.05 ml本发明所述的交联透明质酸凝胶注射到新西兰兔背部皮内，标记皮丘位置。植入13周后沿标记取下皮丘及周围0.5cm正常皮肤组织。取材时避免皮丘压迫，将取下皮肤组织立即放入装有10%中性福尔马林的50ml离心管中。组织固定完成后，进行脱水、透明、切片、苏木精伊红染色。

封片后于组织切片病理扫描仪下成像，所得组织染色结果如附图1所示。结果显示，植入13周后凝胶仍表现出明显的孔壁结构特征。细胞与凝胶间未出现明显分界线，细胞的分布较为均匀，证明凝胶能够支持组织、细胞的迁移生长，支持信号分子、营养和代谢产物的运输。

对比例3.1

本对比例以市售产品瑞蓝2（Restylane）（由Q-Med AB公司以Modified SodiumHyaluronate Gel for Injection（注射用修饰透明质酸钠凝胶）出售）进行了长期皮内植入实验。实验步骤同实施例3。该产品凝胶具有颗粒粒径较大的特征，不具备明显的孔壁结构，所得组织染色结果如附图2所示。从图中可以看出，凝胶在组织中以惰性物理屏障形式存在，细胞分布以凝胶间隙为主，无法穿透凝胶，细胞与凝胶间出现了明显的分界线分布极不均匀。这证明凝胶在局部形成了一个惰性物理屏障，阻碍了局部组织的新陈代谢活动。

对比例3.2

本对比例以市售产品乔雅登雅致（由艾尔建信息咨询(上海)有限公司公司以“Juvéderm ULTRA/注射用交联透明质酸钠凝胶”出售）进行了长期皮内植入实验。实验步骤同实施例3。所得组织染色结果如附图3所示。该产品凝胶具有颗粒粒径分布较广的特征，凝胶中同时存在着多种尺寸的颗粒，不具备明显的孔壁结构。从组织学切片可以看出，凝胶在组织中以惰性物理屏障形式存在，在凝胶颗粒较小的局部区域，组织的新陈代谢未受到明显影响，细胞分布较为均匀，但在主要发挥支持作用的大颗粒凝胶附近，细胞分布也较不均匀，只能围绕着凝胶边缘生长。这证明凝胶中的大颗粒组分仍然在局部形成了一个惰性物理屏障，阻碍了局部组织的新陈代谢活动。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒具有多孔结构，孔径中位数在50-1000um之间，优选为80-500 um，更优选为90-300 um，甚至100-200um。

2. 根据权利要求1所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的粒径中位数D₅₀在50-1000 um之间，优选为100-800 um，更优选为300-700 um，甚至400-600um。

3.根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的孔径的中位数与凝胶颗粒的粒径的中位数D₅₀的比值在0.05-1之间，优选为0.1-0.8，更优选为0.1-0.6，甚至0.15-0.5。

4.根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的溶胀度在20-200之间，优选为40-150，更优选为40-100。

5.根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中使得交联透明质酸凝胶颗粒符合下式：

50≤溶胀度/(孔径中位数/粒径中位数)≤600。

6. 根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶颗粒的弹性模量在1Hz下为100Pa至1000Pa，优选为200Pa至500 Pa。

7.根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，其中所述凝胶的推出力在5N到30N之间，更优选为5N到20N之间，甚至为10-15N之间。

8.制备交联透明质酸凝胶颗粒的方法，特别地根据前述权利要求任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒，包括以下步骤：

（1）溶解步骤：将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物溶解形成溶液；

（2）分散步骤：在上述溶液中加入醇类物质形成分散的混合溶液。

9.根据前述权利要求任一项1-7所述交联透明质酸凝胶颗粒在制备医疗美容例如面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正、外科手术或外科治疗如防粘连和抗瘢痕的产品中的应用。

10.根据前述权利要求1-7任一项所述交联透明质酸凝胶颗粒在制备软组织填充、伤口止血、伤口愈合、抗瘢痕、瘢痕修复、关节润滑、关节保护的产品中的应用。

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