CN115212254A - 头花蓼在制备抗肝损伤药物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体是头花蓼在制备抗肝损伤药物方面的应用。本发明通过研究,发现了头花蓼对急性肝损伤具有明显的保护效果以及剂量依赖,有效的显著保护了四氯化碳造成的急性肝损伤;还能有效减轻肝细胞坏死程度,降低肝细胞炎症浸润程度,减少肝细胞空泡样变性,有明显保护肝损伤的效果;并且可通过抑制炎症因子TNF‑α、IL‑17与IL‑1β的水平,从而发挥保肝作用。头花蓼醇提取物能够用于制备抗肝损伤药物,为治疗急性肝炎肝损伤提供了全新的、安全有效的天然药物,可以得到一系列以其为基础的新型保肝药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体是头花蓼在制备抗肝损伤药物方面的应用。
背景技术
肝脏是人体内脏中最大的实质性器官,在人体的代谢活动中发挥着重要作用,绝大多数摄入体内的物质都要通过肝脏的代谢转化。除此之外,肝脏还具有分泌胆汁、凝血、解毒、免疫和吞噬等多种重要的生理功能,所以在维持机体生命活动中发挥着至关重要的作用。诸多因素都可以造成肝脏的损伤,常见的肝损伤有化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤和酒精性肝损伤等。肝脏具有很强的再生能力,但是过度或持续的损伤会打破肝脏组织损伤与修复之间的平衡,使肝脏发生不可逆病变,导致肝纤维化、肝硬化甚至导致肝细胞癌等。因此预防和治疗肝损伤在肝脏疾病治疗过程当中具有重要意义,可有效减少肝纤维化、肝硬化或肝癌的发生。有研究表明,在我国,肝脏疾病发生率逐年升高并且呈低龄化发展态势。寻找治疗肝脏疾病的新思路、新方法迫在眉睫,而目前临床上具有的保肝药物及使用方法存在毒副作用,从而使保肝药物的使用受到限制。所以从传统天然药物中发现有效的新型保肝药物具有重要意义。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)是蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum)植物,药用部位为头花蓼的干燥全草或地上部分,又名四季红、石莽草、水绣球。头花蓼作为我国苗族民间常用药,其味苦、辛、性凉,归肾、膀胱经,具有清热利湿、解毒止痛、活血散瘀、利尿通淋之功效。头花蓼主要分布在贵州、云南等地,现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗菌、降糖、解热镇痛、调血脂等多种药理作用。其主要含黄酮类、酚酸类、木脂素类、烷基糖苷类、有机酸类、醇类、酯类、三萜类、鞣质类等多种化学成分。民间常用全草或地上部位治疗泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛、跌打损伤、疮疡、腹泻、痢疾等症。并且,目前尚未发现头花蓼提取物在保肝方面,尤其是针对急性肝损伤方面的应用和研究。
因此,从现有的传统天然药物中发现有效的新型保肝药物具有重要意义,是目前重要的研究方向。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了具有抗急性肝损伤作用的头花蓼及其提取物,为治疗肝损伤,尤其是急性肝损伤提供了有效的药物,具体如下:
头花蓼在制备抗肝损伤药物方面的应用。
进一步的,所述制备抗肝损伤药物方面的应用,是制备用于治疗、预防、减轻、缓解与肝损伤有关的疾病的药物中的应用。
进一步的,所述抗肝损伤药物,是抗急性肝损伤的药物。
进一步的,所述抗肝损伤药物,是抗急性肝炎肝损伤的药物。
进一步的,所述抗肝损伤药物,是抗氧化性肝损伤的药物。
进一步的,所述抗肝损伤药物,是抗化学性肝损伤的药物。
进一步的,所述头花蓼,是头花蓼醇提取物。进一步的,是头花蓼95%乙醇回流提取物,并经真空冻干所得提取物粉末。
进一步的,所述头花蓼,是头花蓼的全草或地上部分。
四氯化碳(CCl4)是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质,其导致肝损伤的作用机制复杂,有研究表明与氧化应激和脂质过氧化反应有关。CCl4在肝内经细胞色素P450酶代谢激活,产生三氯甲基自由基(CCl3·)和过氧化三氯甲基自由基(OOCCl3·),这些自由基可与肝细胞膜、内质网和线粒体上的磷脂分子发生共价结合,引发脂质过氧化反应损害膜的结构和功能,并通过抑制细胞膜及线粒体膜上钙泵的活性,使得Ca2+内流,导致肝细胞损伤,从而影响细胞正常的物质能量代谢。脂质过氧化的副产物能与细胞内正常的蛋白质和DNA发生结合,引起肝细胞的凋亡和坏死,具有肝毒性和致癌作用。除此之外,四氯化碳代谢产物还可以刺激肝脏枯否细胞(Kupffer cells),释放促炎性细胞因子,进一步加重肝脏的损伤。CCl4诱导的小鼠肝损伤模型在病理生理等方面与人类肝脏疾病相似,且易于复制,是理想的小鼠肝损伤模型,所以CCl4诱导的肝损伤模型被广泛用于保肝药物的研究。
水飞蓟素(silymarin)是指从菊科草本植物水飞蓟当中提取所得的一类多酚类黄酮,因其显著的保肝药理活性而被人们熟知,水飞蓟素被用于治疗肝损伤是美国最常用的肝脏疾病的植物疗法。除了保肝作用以外,水飞蓟素还具有清除活性氧、抗肿瘤、抗心血管疾病、保护脑缺血损伤等作用。水飞蓟素通过其抗过氧化特性,可以减轻脂质过氧化和自由基损伤的产生,并且在已经遭受损伤的肝细胞内,水飞蓟素能刺激蛋白质的合成并使磷脂代谢正常化。总之,水飞蓟素最大的贡献是对肝细胞膜有稳定作用。所以,基于水飞蓟素显著的保肝活性而选择其作为本实验的阳性对照药。
目前引起肝损伤的因素很多,主要包括药物(化疗药、解热镇痛药、抗病毒药等),大自然和人类工业生产过程中的化学物质(黄曲霉毒素、四氯化碳、二甲基甲酰胺等),病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等)以及酒精等,还有部分肝脏损伤是由于其他疾病引起的并发症,例如高血脂引起的肝脏损伤并发症,不属于急性肝损伤范畴。在治疗及药物选择使用时,需要针对不同原因的肝损伤来选择不同的治疗方式。四氯化碳诱导引起的肝损伤属于化学性肝损伤,可直接导致肝细胞与肝组织损伤。其主要治疗方式有抑制炎症因子释放,减轻肝脏的损伤。本申请中的头花蓼提取物,可以有效显著降低TNF-α、IL-17与IL-1β炎症因子的表达,通过抑制TNF-α、IL-17与IL-1β的mRNA水平,从而发挥苗药头花蓼提取物的抗急性肝炎肝损伤作用。
此外,研究表明肝脏也是血脂代谢的主要器官,包括脂肪的消化、分解、合成和运输。正常情况下,肝脏含有大约5%的脂肪,当脂肪水平超过该水平时,便蓄积在肝细胞中,导致脂肪肝。其中,高血脂可能导致脂肪肝和肝脏组织损伤,其发生机制可能为持续性的高血脂会增加肝脏脂质代谢的负担,导致血脂在肝细胞聚集,从而引发脂肪肝。而脂肪肝则可以导致患者的ALT、AST等肝功能指标异常,其作用机制可能是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)通路,下调硬脂酸辅酶A脱氢酶1(SCD)和脂肪酸合成酶(FASN)mRNA的表达,进而降低肝细胞内甘油三酯的水平,从而改善肝损伤。
但是,高血脂不能直接导致肝损伤,高血脂引起肝损伤的主要原因是持续性的高血脂引起胆固醇和甘油三酯在肝脏中的蓄积作用,进而促进肝细胞脂肪变性,最终可能导致肝功能损伤。其主要治疗方法为,降低肝细胞中胆固醇、血脂与甘油三酯的水平。例如,使用黄酮类化合物,可以通过抑制脂肪酸合成途径中的一些关键因子的表达,进而抑制肝脏脂质积累。
与现有技术相比,本发明创造的技术效果体现在:
本发明提供了能够制备抗肝损伤药物的头花蓼提取物,对急性肝损伤具有明显的保护效果以及剂量依赖,有效的显著保护了四氯化碳造成的急性肝损伤。头花蓼醇提物能有效减轻肝细胞坏死程度,降低肝细胞炎症浸润程度,减少肝细胞空泡样变性,有明显保护肝损伤的效果。头花蓼醇提取物可通过抑制炎症因子TNF-α、IL-17与IL-1β的水平,从而发挥急性肝损伤保肝作用。头花蓼醇提取物能够用于制备抗肝损伤药物,为治疗急性肝炎肝损伤提供了全新的、安全有效的天然药物,可以得到一系列以其为基础的新型急性肝损伤保肝药物。
附图说明
图1头花蓼醇提取物是对由CCl4诱导引起的肝损伤的保护作用结果:(A)血生化指标AST和ALT值(***p<0.001,**p<0.01与模型组比较,###p<0.001与空白组比较)(B)在10×倍显微镜下的由CCl4诱导引起的肝损伤的小鼠肝脏病理切片图
图2是头花蓼醇提取物保肝作用TNF-α、IL-17与IL-1β基因转录水平(*p<0.05,***p<0.001与模型组比较,###p<0.001与空白组比较)
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的限定,但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例
实施例1、头花蓼提取物的制备过程。
1、实验材料和方法。
提取物制备:将1000g的头花蓼粉碎干粉在95%乙醇中回流提取3次,每次2-3小时。滤液浓缩合并后,得到头花蓼醇提取物浸膏。并经真空冻干,得到头花蓼醇提取物粉末,置入干燥器中,备用。
2、实验结果。
头花蓼醇提取物粉末约200mg。
实施例2、头花蓼醇提物对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤的保护作用。
1、实验材料和方法。
4-6周雄性KM鼠购自贵州医科大学实验动物中心,给予12h光照12h黑暗,恒温,正常饲料及水饲养,于无菌环境中适应4天后进行实验。
动物随机分为5组(n=6),1)对照组及2)模型组动物每天按10mL/kg灌胃0.3%羧甲基纤维素钠溶液,3)阳性药组每天按10mL/kg灌胃10mg/mL的水飞蓟素混悬液(混于0.3%羧甲基纤维素钠溶液),4)头花蓼提取物低剂量保护组、5)头花蓼提取物高剂量保护组每天按10mL/kg分别灌胃50mg/mL、20mg/mL的苦参提取物混悬液(给药剂量500mg/kg、200mg/kg)。连续给药7天,第7天灌胃6h后,1)对照组腹腔注射玉米油(7mL/kg),2)~5)组腹腔注射CCl4造模(0.2%v/v,7ml/kg,溶于玉米油),24h后摘眼球取血,心脏灌流后取肝组织。血液样品室温静置2h后4℃8000g离心15min取血清。
血清样品进行血生化分析,检测ALT、AST指标(按说明书使用谷草转氨酶活力检测试剂盒及谷丙转氨酶活力检测试剂盒检测血生化指标谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT))。肝脏组织经多聚甲醛固定后进行石蜡包埋、切片、HE染色、拍照。
2、实验结果。
实验数据计量资料均以均数±标准差表示,两均数的比较使用SPSS16.0统计软件中的one-wayANOVA分析,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与模型组比较。
肝细胞受损后会释放谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST),血清中的这些酶浓度反应肝损伤程度。如图1(A),血生化结果显示头花蓼提取物有明显的保护效果以及剂量依赖,显著保护了四氯化碳造成的急性肝损伤。
在光学显微镜下,无损伤的小鼠肝组织切片中,可见肝细胞大小、形态均正常,无肝实质性细胞病变,中央静脉及汇管区正常,如图1(B)所示。四氯化碳损伤后的模型组,小鼠肝组织中中央静脉周围肝细胞无正常细胞形态,肝细胞肿大,部分细胞呈气球样变性,有炎症细胞浸润现象。经给药头花蓼提取物后,肝细胞坏死程度显著减轻,炎症浸润程度降低,低剂量给药组部分细胞仍呈现气球样变性,高剂量给药组几乎无气球样变性。与血生化结果吻合,说明头花蓼提取物有明显保护肝损伤的效果。
实施例3、头花蓼醇提物治疗小鼠急性肝损伤的作用机制研究。
1、实验材料和方法。
总RNA提取:切取各动物肝脏组织5-10mg至1.5mL离心管,加入500μL的LysisBuffer。用电动匀浆机、组织破碎仪匀浆。室温静置5分钟,以充分裂解组织。加入100μL的氯仿,用手震荡混匀,室温静置3分钟。12000rpm,4℃离心2分钟,小心地吸取出上清,转移到新的1.5mL离心管中。向吸取的上清中加入等体积的无水乙醇充分混匀,加入离心柱,4000rpm,4℃离心1分钟。向RNA柱中加入500μL的Wash Buffer1,4000rpm,4℃离心1分钟,倒掉废液,将收集管倾斜倒扣在吸水纸上磕几下,将管口残留的液体吸干净。向RNA柱中加入500μL的Wash Buffer2,4000rpm,4℃离心1分钟,倒掉废液,将收集管管口残留的液体用吸水纸吸干净。将RNA柱放回收集管,12000rpm,4℃离心1分钟,以完全去除可能残留的WashBuffer。将离心柱取出,放进一个新的无RNA酶的1.5mL离心管中,开盖晾干2分钟。在RNA柱的膜中心部位加入20-50μL的Elution Buffer,室温静置2分钟。12000rpm,4℃离心1分钟。洗脱下来的RNA建议置于冰上,用分光光度计检测OD进行RNA定量。(A260/280在1.90-2.20之间均属正常)
反转:将RNA浓度调整为一致,10或20μL体系进行反转录,具体步骤按照TIANGEN反转录试剂盒说明进行操作。
实时定量PCR:QPCR引物信息如表1,按表2配置反应体系后按表6程序进行试试定量PCR实验,并收集处理数据。
表1 QPCR引物信息
Tab.1 Primer information of QPCR
表2 QPCR反应体系
Tab.2 The reaction system of QPCR
表3 QPCR反应程序
Tab.3 The response procedures of QPCR
2、实验结果。
结果显示,从图2可知,TNF-α、IL-17与IL-1β蛋白的mRNA转录水平在各组之间差异明显:模型组动物肝脏中炎症因子表达水平比空白组动物肝脏明显升高,说明CCl4造成的急性肝损伤导致肝脏中炎症相关因子表达显著升高,从而引起炎症、凋亡等一系列损伤反应。阳性药水飞蓟素组和头花蓼醇提物高剂量组动物肝脏中的TNF-α、IL-17与IL-1β显著下降(p<0.01),说明头花蓼醇提取物能够显著降低TNF-α、IL-17与IL-1β炎症因子的表达。通过抑制TNF-α、IL-17与IL-1β的mRNA水平,从而发挥苗药头花蓼提取物保肝的作用(图2)。初步表明头花蓼提取物对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有显著的治疗作用。
最后,应当指出,以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然,本发明的技术方案并不限于上述实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.头花蓼在制备抗肝损伤药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述制备抗肝损伤药物方面的应用,是制备用于治疗、预防、减轻、缓解与肝损伤有关的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肝损伤药物,是抗急性肝损伤的药物。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肝损伤药物,是抗急性肝炎肝损伤的药物。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肝损伤药物,是抗氧化性肝损伤的药物。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗肝损伤药物,是抗化学性肝损伤的药物。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述头花蓼,是头花蓼醇提取物。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述头花蓼醇提取物,是头花蓼95%乙醇回流提取物,并经真空冻干所得提取物粉末。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述头花蓼,是头花蓼的全草或地上部分。
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