CN115128288A - 一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，它涉及生物分离纯化领域。本发明包括以下步骤：(1)、凝血因子亲和纯化磁珠的制备；(2)、乏因子血浆的制备；(3)、凝血因子亲和纯化磁珠的再生；（4）、乏因子血浆的检测。本发明选用了磁珠为载体，将抗特定凝血因子的抗体偶联到磁珠上，抗体偶联后的磁珠能够吸附血浆中的特定凝血因子，从而实现制备乏单因子血浆。本发明所述的方法制备乏单因子血浆耗时短，且操作方便，尽可能的避免其他凝血因子活性的损失。
Description
技术领域
本发明涉及的是生物分离纯化领域，具体涉及一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法。
背景技术
血浆与组织中直接参与凝血的物质，统称为凝血因子，在血液凝固过程中，起着非常重要的作用。按国际命名法，用罗马数字按发现的次序编号的凝血因子有12种，分别是凝血因子I，II，III，IV，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII。检测各凝血因子的活性，有助于判断血友病的类型，血友病的轻重程度以及某些病理情况下的凝血状况。
临床上比较常用的凝血因子活性的测定包括因子II、Ⅶ、Ⅷ、IX、X、XI和XII的测定。凝血因子II、Ⅶ和X活性测定可用于诊断先天性或获得性因子缺乏症，鉴别诊断异常蛋白血症和蛋白质合成障碍，检测凝血酶原复合物的疗效，检测口服抗凝药的治疗情况，检测肝病时的肝功能。凝血因子Ⅷ可用于诊断血友病甲，及评价血友病甲患者使用因子Ⅷ替代疗法的疗效。凝血因子IX活性测定可用于诊断血友病乙，及评价血友病乙患者使用因子IX替代疗法的疗效，也可用于诊断消耗性凝血病，肝硬化，并能更精确的检测口服抗凝剂的疗效。凝血因子XI活性测定可用于诊断血友病丙。凝血因子XII可用于因子XII缺乏症的诊断。因此，凝血因子的活性检测是临床工作中诊断相关疾病、监测治疗效果的重要指标。
临床上检测特定凝血因子的活性，需选用特定的乏因子血浆作为基质来测定。目前制备乏因子血浆的方法是将抗特定凝血因子的单克隆抗体交联到琼脂糖凝胶上，将琼脂糖凝胶装入层析柱中制备成亲和层析柱，将正常人血浆加入到亲和层析柱中，血浆中相应的凝血因子被吸附到亲和层析柱上，剩余的血浆即为乏因子血浆。如文献报道Saito等用抗凝血因子Ⅷ单克隆抗体交联于琼脂糖凝胶4B上，用于制备乏Ⅷ因子基质血浆，这样制备的乏Ⅷ因子血浆与天然乏因子血浆比较，两者相关性r=0.926，因此用单克隆抗体亲和柱制备的乏Ⅷ因子血浆可以取代天然乏Ⅷ因子血浆用于检测。
上述提到的单克隆抗体亲和柱法，在抗体交联到琼脂糖凝胶上后，需要将琼脂糖凝胶装到层析柱中，该过程比较繁琐且要求标准较高，若柱料中混入气泡会影响制备乏因子血浆的质量。而磁珠亲和纯化方法不需要将磁珠装到层析柱中可直接使用。此外，亲和柱层析法需要蛋白纯化仪来进行纯化，操作繁琐复杂，时间长，而磁珠亲和纯化方法只需要一个磁力架就可以实现凝血因子的分离，操作更加简单、快速。
发明内容
针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，利用磁珠亲和纯化方法操作简单，快速、纯化效率高，并且亲和纯化磁珠可重复使用，节省成本。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，包括以下步骤：
(1)、凝血因子亲和纯化磁珠的制备：
(1.1)、清洗磁珠：取磁珠放于离心管中，加入洗液混匀后，放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体，再加入pH6.0洗液，将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠，再次放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；向离心管中加入pH6.0洗液，将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠；
(1.2)、抗凝血因子抗体标记磁珠：向离心管中加入EDC 350μl，室温震荡反应后，加入抗某种凝血因子抗体，室温震荡反应后，加入BSA水溶液室温震荡封闭过夜；将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；用PBST清洗磁珠，用PBS重悬磁珠；
(2)、乏因子血浆的制备：
在离心管中，加入上面亲和磁珠，放于磁力架上，亲和磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；将离心管从磁力架上取下，加入柠檬酸钠抗凝的血浆，旋转混匀，使磁珠和血浆充分混合；将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走血浆，放于一个新离心管中；去除凝血因子的血浆加入纤维蛋白原至终浓度为，加入甘露醇至终浓度为，然后分装到玻璃瓶中，冻干，保存；
(3)、凝血因子亲和纯化磁珠的再生：
将上面吸附过凝血因子的磁珠放于甘氨酸再生缓冲液中，震荡混匀分钟，用磁力架将磁珠吸附到离心管壁上，去除液体；重复此步骤；最后磁珠保存再保存液中，低温可长期保存，重复使用。
（4）、乏因子血浆的检测
乏因子血浆试剂可用于测定患者血浆某种凝血因子缺乏和缺乏程度，用不同乏因子血浆和患者血浆混合，测定部分凝血活酶时间，结果用不同稀释度标准血浆制成的校准曲线计算出活性；测定前，用咪唑缓冲液按比例稀释血浆样本，检测方法为在反应杯中加入乏因子血浆，稀释样本，APTT试剂孵育，准备氯化钙溶液，加入氯化钙后，立即启动血凝分析仪上的计时器，开始记录凝血时间，以亲和层析柱制备乏因子血浆为对照，评价用磁珠亲和纯化法制备乏因子血浆临床测试结果。
作为优选，所述的步骤1中的磁珠粒径为1.5μm，磁珠表面有羧基修饰。
作为优选，所述的步骤1中的凝血因子为II、Ⅶ、Ⅷ、IX、X和XII。
作为优选，所述的步骤1中的抗体为抗凝血因子II、Ⅶ、Ⅷ、IX、X和XII的单克隆抗体。
作为优选，所述的步骤2中的血浆为柠檬酸钠抗凝的人血浆。
本发明具有以下有益效果：本发明选用了磁珠为载体，将抗特定凝血因子的抗体偶联到磁珠上，抗体偶联后的磁珠能够吸附血浆中的特定凝血因子，从而实现制备乏单因子血浆。本发明所述的方法制备乏单因子血浆耗时短，且操作方便，尽可能的避免其他凝血因子活性的损失。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：一种利用磁珠亲和纯化法制备乏因子VIII血浆的方法，包括以下步骤：
1、凝血VIII因子亲和纯化磁珠的制备
清洗磁珠：取粒径为1.5μm磁珠（JSR，MS160/carboxy，浓度10%）500μl放于10ml离心管中，加入洗液3ml（20mM MES pH6.0）混匀后，放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体，再加入洗液3ml（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠，再次放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。向离心管中加入4ml洗液（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠。
抗凝血VIII因子抗体标记磁珠：向上面的离心管中加入EDC 350μl（用20mM MESpH6.0配制EDC至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应10分钟，加入抗凝血因子VIII抗体1mg（用20mM MES pH6.0稀释抗体至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应2小时，加入10%BSA水溶液3ml室温震荡封闭过夜。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。用PBST清洗磁珠3次后，用5ml PBS重悬磁珠。
2、乏VIII因子血浆的制备
在5ml离心管中，加入上面1ml的亲和磁珠，放于磁力架上，亲和磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。将离心管从磁力架上取下，加入3ml柠檬酸钠抗凝的血浆，于2-8℃旋转混匀15-20分钟，使磁珠和血浆充分混合。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走血浆，放于一个新的5ml离心管中。去除凝血VIII因子的血浆加入纤维蛋白原至终浓度为1mg/ml，加入甘露醇至终浓度为2mg/ml，然后分装到玻璃瓶中，每瓶1ml，冻干，于2-8℃保存。
3、凝血VIII因子亲和纯化磁珠的再生
将上面吸附过凝血因子的磁珠放于3ml再生缓冲液（ 100mM甘氨酸pH2.7）中，震荡混匀1分钟，用磁力架将磁珠吸附到离心管壁上，去除液体。重复此步骤2次。最后磁珠保存在1ml 保存液中（PBS含0.02%叠氮钠 pH7.4）中，2-8℃可长期保存，重复使用。
4、乏VIII因子血浆的检测
检测原理：血浆中内源性凝血系统任一凝血因子缺乏，都会导致部分凝血活酶时间延长。乏因子血浆试剂可用于测定患者血浆某种凝血因子缺乏和缺乏程度。用不同乏因子血浆和患者血浆混合，测定部分凝血活酶时间，结果用不同稀释度标准血浆制成的校准曲线计算出活性。缺乏某种特定凝血因子患者血浆不能用相应乏因子血浆补偿，从而导致部分凝血活酶时间延长。
检测方法：测定前，用100mM pH7.4咪唑缓冲液按1:5比例稀释血浆样本。检测方法为在反应杯中加入乏VIII因子血浆50μl，稀释样本50μl，APTT试剂50μl，37℃孵育3分钟，加入氯化钙溶液50μl，立即启动凝血分析仪上的计时器，开始记录凝血时间。凝血分析仪厂家为北京众驰伟业科技发展有限公司XL3200，APTT试剂厂家为北京众驰伟业，咪唑缓冲液为自配。
以亲和层析柱制备乏VIII因子血浆（A）为对照，评价用磁珠亲和纯化法制备乏VIII因子血浆（B）的临床测试结果。
乏因子VIII血浆临床对比测试结果
实施例2：一种利用磁珠亲和纯化法制备乏Ⅸ因子血浆的方法，包括以下步骤：
1、凝血Ⅸ因子亲和纯化磁珠的制备
清洗磁珠：取粒径为1.5μm磁珠（JSR，MS160/carboxy，浓度10%）500μl放于10ml离心管中，加入洗液3ml（20mM MES pH6.0）混匀后，放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体，再加入洗液3ml（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠，再次放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。向离心管中加入4ml洗液（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠。
抗凝血Ⅸ因子抗体标记磁珠：向上面的离心管中加入EDC 350μl（用20mM MESpH6.0配制EDC至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应10分钟，加入抗凝血Ⅸ因子抗体1mg（用20mM MES pH6.0稀释抗体至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应2小时，加入10%BSA水溶液3ml室温震荡封闭过夜。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。用PBST清洗磁珠3次后，用5ml PBS重悬磁珠。
2、乏Ⅸ因子血浆的制备
在5ml离心管中，加入上面1ml的亲和磁珠，放于磁力架上，亲和磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。将离心管从磁力架上取下，加入3ml柠檬酸钠抗凝的血浆，于2-8℃旋转混匀15-20分钟，使磁珠和血浆充分混合。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走血浆，放于一个新的5ml离心管中。去除凝血Ⅸ因子的血浆加入纤维蛋白原至终浓度为1mg/ml，加入甘露醇至终浓度为2mg/ml，然后分装到玻璃瓶中，每瓶1ml，冻干，于2-8℃保存。
3、凝血Ⅸ因子亲和纯化磁珠的再生
将上面吸附过凝血因子的磁珠放于3ml再生缓冲液（ 100mM甘氨酸pH2.7）中，震荡混匀1分钟，用磁力架将磁珠吸附到离心管壁上，去除液体。重复此步骤2次。最后磁珠保存在1ml 保存液中（PBS含0.02%叠氮钠 pH7.4）中，2-8℃可长期保存，重复使用。
4、乏Ⅸ因子血浆的检测
检测原理：血浆中内源性凝血系统任一凝血因子缺乏，都会导致部分凝血活酶时间延长。乏因子血浆试剂可用于测定患者血浆某种凝血因子缺乏和缺乏程度。用不同乏因子血浆和患者血浆混合，测定部分凝血活酶时间，结果用不同稀释度标准血浆制成的校准曲线计算出活性。缺乏某种特定凝血因子患者血浆不能用相应乏因子血浆补偿，从而导致部分凝血活酶时间延长。
检测方法：测定前，用100mM pH7.4咪唑缓冲液按1:5比例稀释血浆样本。检测方法为在反应杯中加入乏Ⅸ因子血浆50μl，稀释样本50μl，APTT试剂50μl，37℃孵育2分钟，氯化钙溶液50μl，加入氯化钙后，立即启动血凝分析仪上的计时器，开始记录凝血时间。血凝分析仪厂家为希森美康1500，APTT试剂厂家为西门子，咪唑缓冲液和氯化钙溶液为自配。
以亲和层析柱制备乏Ⅸ因子血浆（A）为对照，评价用磁珠亲和纯化法制备乏Ⅸ因子血浆（B）的临床测试结果。
乏Ⅸ因子血浆临床对比测试结果
实施例3：
一种利用磁珠亲和纯化法制备乏Ⅻ因子血浆的方法，包括以下步骤：
1、凝血因子Ⅻ亲和纯化磁珠的制备
清洗磁珠：取粒径为1.5μm磁珠（JSR，MS160/carboxy，浓度10%）500μl放于10ml离心管中，加入洗液3ml（20mM MES pH6.0）混匀后，放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体，再加入洗液3ml（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠，再次放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。向离心管中加入4ml洗液（20mM MES pH6.0），将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠。
抗凝血因子Ⅻ抗体标记磁珠：向上面的离心管中加入EDC 350μl（用20mM MESpH6.0配制EDC至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应10分钟，加入抗凝血因子Ⅻ抗体1mg（用20mM MES pH6.0稀释抗体至终浓度为1mg/ml），室温震荡反应2小时，加入10%BSA水溶液3ml室温震荡封闭过夜。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。用PBST清洗磁珠3次后，用5ml PBS重悬磁珠。
2、乏因子Ⅻ血浆的制备
在5ml离心管中，加入上面1ml的亲和磁珠，放于磁力架上，亲和磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体。将离心管从磁力架上取下，加入3ml柠檬酸钠抗凝的血浆，于2-8℃旋转混匀15-20分钟，使磁珠和血浆充分混合。将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走血浆，放于一个新的5ml离心管中。去除凝血因子Ⅻ的血浆加入纤维蛋白原至终浓度为1mg/ml，加入甘露醇至终浓度为2mg/ml，然后分装到玻璃瓶中，每瓶1ml，冻干，于2-8℃保存。。
3、凝血因子Ⅻ亲和纯化磁珠的再生
将上面吸附过凝血因子的磁珠放于3ml再生缓冲液（ 100mM甘氨酸pH2.7）中，震荡混匀1分钟，用磁力架将磁珠吸附到离心管壁上，去除液体。重复此步骤2次。最后磁珠保存在1ml 保存液中（PBS含0.02%叠氮钠 pH7.4）中，2-8℃可长期保存，重复使用。
4、乏因子Ⅻ血浆的检测
检测原理：血浆中内源性凝血系统任一凝血因子缺乏，都会导致部分凝血活酶时间延长。乏因子血浆试剂可用于测定患者血浆某种凝血因子缺乏和缺乏程度。用不同乏因子血浆和患者血浆混合，测定部分凝血活酶时间，结果用不同稀释度标准血浆制成的校准曲线计算出活性。缺乏某种特定凝血因子患者血浆不能用相应乏因子血浆补偿，从而导致部分凝血活酶时间延长。
检测方法：测定前，用100mM pH7.4咪唑缓冲液按1:5比例稀释血浆样本。检测方法为在反应杯中加入乏因子Ⅻ血浆50μl，稀释样本50μl，APTT试剂50μl，37℃孵育2分钟，氯化钙溶液50μl，加入氯化钙后，立即启动血凝分析仪上的计时器，开始记录凝血时间。凝血分析仪厂家为北京众驰伟业科技发展有限公司XL3200，APTT试剂厂家为众驰伟业，咪唑缓冲液为自配。
以亲和层析柱制备乏因子Ⅻ血浆（A）为对照，评价用磁珠亲和纯化法制备乏因子Ⅻ血浆（B）的临床测试结果
乏因子Ⅻ血浆临床对比测试结果
本发明中各个实施例的结果显示，采用磁珠亲和纯化法制备乏因子血浆和用亲和层析柱制备乏因子血浆测临床样本没有明显差异，说明可以用磁珠亲和纯化法替代亲和层析柱法制备乏因子血浆，并且磁珠亲和纯化法是一种操作更为简单、快速的方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、凝血因子亲和纯化磁珠的制备：
(1.1)、清洗磁珠：取磁珠放于离心管中，加入洗液混匀后， 放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体，再加入pH6.0洗液，将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠，再次放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；向离心管中加入pH6.0洗液，将离心管从磁力架上取下后混匀磁珠；
(1.2)、抗凝血因子抗体标记磁珠：向离心管中加入EDC 350μl，室温震荡反应后，加入抗某种凝血因子抗体，室温震荡反应后，加入BSA水溶液室温震荡封闭过夜；将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；用PBST清洗磁珠，用PBS重悬磁珠；
(2)、乏因子血浆的制备：
在离心管中，加入上面亲和磁珠，放于磁力架上，亲和磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走液体；将离心管从磁力架上取下，加入柠檬酸钠抗凝的血浆，旋转混匀，使磁珠和血浆充分混合；将离心管放于磁力架上，磁珠被磁力架吸附到离心管壁上，吸走血浆，放于一个新离心管中；去除凝血因子的血浆加入纤维蛋白原至终浓度为，加入甘露醇至终浓度为，然后分装到玻璃瓶中，冻干，保存；
(3)、凝血因子亲和纯化磁珠的再生：
将上面吸附过凝血因子的磁珠放于甘氨酸再生缓冲液中，震荡混匀分钟，用磁力架将磁珠吸附到离心管壁上，去除液体；重复此步骤；最后磁珠保存再保存液中，低温可长期保存，重复使用；
（4）、乏因子血浆的检测
乏因子血浆试剂可用于测定患者血浆某种凝血因子缺乏和缺乏程度，用不同乏因子血浆和患者血浆混合，测定部分凝血活酶时间，结果用不同稀释度标准血浆制成的校准曲线计算出活性；测定前，用咪唑缓冲液按比例稀释血浆样本，检测方法为在反应杯中加入乏因子血浆，稀释样本，APTT试剂孵育，准备氯化钙溶液，加入氯化钙后，立即启动血凝分析仪上的计时器，开始记录凝血时间，以亲和层析柱制备乏因子血浆为对照，评价用磁珠亲和纯化法制备乏因子血浆临床测试结果。
2.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的EDC 350μl用20mM MES pH6.0配制EDC至终浓度为1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的磁珠粒径为1.5μm，磁珠表面有羧基修饰。
4.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的凝血因子为II、Ⅶ、Ⅷ、IX、X和XII。
5.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的抗体为抗凝血因子II、Ⅶ、Ⅷ、IX、X和XII的单克隆抗体；所述抗体用20mM MES pH6.0稀释抗体至终浓度为1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的血浆为柠檬酸钠抗凝的人血浆。
7.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的保存液为PBS含0.02%叠氮钠 pH7.4。
8.根据权利要求1所述的一种利用磁珠亲和纯化法制备乏单因子血浆的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的低温为2-8℃。
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