CN115125148A - 一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的培养基和培养方法 - Google Patents
一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的培养基和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的新培养基和培养方法,由于采用本发明的培养基和培养方法,提高了原料利用率的同时降低发酵液粘度,且通过简化工艺来降低染菌率,并有效提高了环孢菌素发酵单位。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域,特别是涉及一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的培养基和培养方法。
背景技术
目前在器官移植领域,环孢菌素仍然是最基本的免疫抑制用药。除肝脏移植治疗可以用FK506替代外,其他领域都很难被替代。同时,环孢菌素还可以用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、再生障碍性贫血、皮肤肌炎以及肾综合症的治疗等。
目前国内外实现了环孢菌素的工业化生产,主要是通过工业应用比较多的微生物雪白白疆菌发酵产生环孢菌素,存在的问题主要是:
1)环孢菌素常规培养基配方中的碳源是葡萄糖或淀粉,氮源有蛋白胨(包含动物蛋白)、豆饼粉和酵母粉,环孢菌素发酵培养结束,发酵液粘度较高,其粘度>35mpa.s,为提取纯化环孢菌素带来一定的难度,环孢菌素的发酵规模不超过50m3,发酵单位<14000u/ml。
2)目前,国内相关文献资料公开了环孢菌素培养基配方和配伍比例,其适用于实验室条件或进行验证类试验,缺少完整的工业化大生产的培养基配方和配伍比例。同时,文献资料公开了环孢菌素发酵过程中需要进行补料,主要是补入氮源。利用公开的文献资料,进行了工业化大生产验证,确认培养基配方和配伍比例后,在50m3发酵罐中进行了生产验证,发酵过程中进行了补料,补入的物料主要是氮源,从而容易导致染菌问题。
发明内容
本发明的目的之一就在于提供一种原料利用率提高同时发酵液粘度降低,且简化工艺降低染菌率,并有效提高环孢菌素发酵单位的培养基;本发明的另一目的在于提供一种环孢菌素发酵生产的培养方法。
本发明第一方面涉及一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的培养基。
所述种子培养基组成为:
甘蔗糖蜜36~40kg/m3、藕粉固液混合物160~200L/m3或脱盐乳清粉11~15kg/m3、牛血蛋白6-10kg/m3、蝗虫粉或蚯蚓粉蛋白液280-300L/m3、复合酵母氮素68~72kg/m3、轻质碳酸钙1~5kg/m3、硫酸铵0.3~0.7kg/m3;
所述发酵培养基组成为:
甘蔗糖蜜41~45kg/m3、藕粉固液混合物200~240L/m3或脱盐乳清粉14~18kg/m3、牛血蛋白6-10kg/m3、蝗虫粉或蚯蚓粉蛋白液290-310L/m3、复合酵母氮素71~75kg/m3、轻质碳酸钙1~5kg/m3、硫酸铵0.5~0.9kg/m3、硫酸镁0.01~0.05kg/m3、硫酸锌0.003~0.007kg/m3、磷酸二氢钾0.05~0.09kg/m3、硫酸锰0.002~0.006kg/m3。
所述藕粉固液混合物制备方法包括如下步骤
首先藕粉加入水中;其次加入硫酸溶液,调节pH至5-6;最后加入碳酸钙和α-淀粉酶,升温至80-90℃,搅拌20-40min,得到藕粉固液混合物,配伍比例是:
硫酸浓度:4-5%;
W藕粉∶L水=1kg∶8-10L;
W藕粉∶W碳酸钙=1kg∶0.02-0.03kg;
W藕粉∶Wα-淀粉酶=1kg∶0.01-0.02kg。
所述蝗虫粉蛋白液或蚯蚓粉蛋白液制备方法包括如下步骤:
(1)浸泡
分别配置10-20%的氯化钠和5-10%的氢氧化钠混合溶液,加入蝗虫粉或蚯蚓粉,搅拌40-60min,过滤,
W蝗虫粉或蚯蚓粉∶L混合溶液=1kg∶4-6L;
(2)制备蛋白液
过滤后的蝗虫粉或蚯蚓粉加入水,首先加入10%的硫酸溶液,调节pH至5-6,其次加入酸性蛋白酶,最后升温至60-70℃,搅拌120-150min,得到蝗虫粉蛋白液或蚯蚓粉蛋白液,W蝗虫粉或蚯蚓粉∶L水=1kg∶4-6L;
W蝗虫粉或蚯蚓粉∶W酸性蛋白酶=1kg∶0.02-0.03kg。
本发明第二个方面是涉及一种利用上述培养基生产环孢菌素的培养方法。
培养方法包括如下步骤:
(1)种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的雪白白疆菌母瓶液接入种子培养基中进行培养,至菌体浓度10~14%移种;
(2)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,环孢菌素化学效价>16000u/ml时终止发酵。
其中培养方法中所述步骤(2)中还包括控制发酵液粘度为8-14mpa.s的步骤。
优选地,所述培养好的雪白白疆菌摇瓶种子液质量要求为菌体浓度6~10%;镜检无杂菌,接种量为5-7%。
优选地,所述种子培养条件为:罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:20~60m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在40~60r/min;
优选地,所述发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6~7;
b温度:培养温度25~27℃;
c搅拌转速:转速控制在60~80r/min;
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
f粘度控制:
发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s;
本发明取得了如下的至少一项有益效果:
1.原材料优势
采用蔗糖糖蜜代替葡萄糖,首先蔗糖糖蜜为制糖副产品,含糖量高,且价格低廉,其次,可以避免葡萄糖效应。
藕粉中含有淀粉、蛋白质、维生素(胡萝卜素、VA、VB1、VB2和VE)、钙、磷、铁、等矿物质物质,本专利中使用了藕粉水解液,主要功能是:作为碳源,代替葡萄糖;因其含有蛋白,可以减少培养基配方中其它氮源的用量;水解液中含有微量元素及微生物,它们对调解细胞酶活性和渗透压起到重要作用,有利于菌体的生长和繁殖。
我国牛血资源十分丰富,年产牛血在5万吨以上。牛血蛋白作为培养基,可以释放16种氨基酸,总量约为73%。异亮氨酸和蛋氨酸含量<1%,其它氨基酸含量超过了3%。依据环孢菌素生化合成原理,培养基种的氨基酸(环孢菌素前体)种类和含量影响环孢菌素的发酵技术水平和质量。使用牛血蛋白,有助于提高环孢菌素发酵水平,提高环孢菌素A组分含量。
我国较多省份人工养殖蝗虫,规模较大,产量较高。蝗虫粉中蛋白含量达到了64-78%,远高于鱼粉和蛋白胨。蝗虫氨基酸含量也很丰富,据报道,蝗虫含有Glu、Ala、Asp、Pro、Arg、Tyr、Gly、Ser、His、Cys、Ile、Leu、Val、Lys、Thr、Phe、Met、Try 18种氨基酸。其中关键氨基酸Ile、leu、Val、Lys、Thr、Phe、Met、Try的含量高达36%,基本符合联合国粮农组织(FAO)制定的优良蛋白质中必需氨基酸应占氨基酸总量40%的规定。蚯蚓粉的蛋白质含量高于鱼粉,粗蛋白达到69.52%,大于国家特级标准鱼粉的蛋白质含量。蚯蚓粉的总氨基酸含量为53.37%,必需氨基酸含量为30.65%,蚯蚓粉中的必需氨基酸和非必需氨基酸水平(58.67%)都比蚯蚓本身(21.23%)要高,蚯蚓粉具有更好的氨基酸平衡水平。蝗虫粉或蚯蚓粉经过水解,其氨基酸释放于水中,依据环孢菌素生化合成原理,培养基种的氨基酸(环孢菌素前体)种类和含量影响环孢菌素的发酵技术水平和质量。使用其水解液,便于菌体吸收和利用,有助于提高环孢菌素发酵水平,提高环孢菌素A组分含量。
复合酵母氮素是“快速易利用氮源”和“难利用氮源”的高技术优化复合体。其中,前者能使刚接种的菌体迅速生长,从而缩短了微生物发酵的延迟期;后者能渐进地抑制微生物菌体过分生长,从而使菌体不得不把所投入的培养基的“营养质能”由“长菌体”向“分泌代谢产物”方向转化,进而提高了培养基的利用效能。
本发明取得了如下的至少一项有益效果:
1)由于采用本发明的培养基和发酵工艺,环孢菌素培养基中的碳源(总糖)的总用量是38-42kg/m3,氮源(氨基酸)的总用量是70-75kg/m3,并且部分原料经过水解,原料利用率高,从而发酵过程中不用补料,简化了发酵工艺,降低了染菌率;
2)环孢菌素发酵液中减少了氨基氮用量,采用水解液和复合酵母氮素代替豆饼粉、酵母粉和蛋白胨,降低了发酵液粘度,其粘度在8-14mpa.s,同公开的工艺比较(粘度维持在35mpa.s),粘度下降了31%,有利于提高环孢菌素发酵技术水平,为进一步提取纯化环孢菌素减轻了阻力,有效提高环孢菌素发酵单位。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种来源:
生产使用的菌种来源为雪白白疆菌摇瓶种子液,质量要求为菌体浓度6~10%;镜检无杂菌,接种量为5-7%。
实施例1
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜180kg、藕粉固液混合物800L、牛血蛋白30kg、蝗虫粉蛋白液1400L、复合酵母氮素340kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵1.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的250L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:20m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在40r/min;至菌体浓度10%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2050kg、藕粉固液混合物10000L、牛血蛋白300kg、蝗虫粉蛋白液14500L、复合酵母氮素3550kg、轻质碳酸钙50kg/m3、硫酸铵25kg、硫酸镁0.5kg、硫酸锌0.15kg、磷酸二氢钾2.5kg、硫酸锰0.1kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.1;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在65r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16024u/ml。
实施例2
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜185kg、脱盐乳清粉60kg、牛血蛋白35kg、蚯蚓粉蛋白液1425L、复合酵母氮素345kg、轻质碳酸钙10kg、硫酸铵2kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的275L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:30m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在45r/min;至菌体浓度11%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2100kg、脱盐乳清粉700kg、牛血蛋白350kg、蚯蚓粉蛋白液14750L、复合酵母氮素3600kg、轻质碳酸钙100kg/m3、硫酸铵30kg、硫酸镁1kg、硫酸锌0.2kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸锰0.15kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.2;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在65r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16140u/ml。
实施例3
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜190kg、藕粉固液混合物900L、牛血蛋白40kg、蝗虫粉蛋白液1450L、复合酵母氮素350kg、轻质碳酸钙15kg、硫酸铵2.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的300L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:40m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在50r/min;至菌体浓度12%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2150kg、藕粉固液混合物11000L、牛血蛋白400kg、蝗虫粉蛋白液15000L、复合酵母氮素3650kg、轻质碳酸钙150kg/m3、硫酸铵35kg、硫酸镁1.5kg、硫酸锌0.25kg、磷酸二氢钾3.5kg、硫酸锰0.2kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.5;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在70r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16378u/ml。
实施例4
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜195kg、脱盐乳清粉65kg、牛血蛋白45kg、蚯蚓粉蛋白液1475L、复合酵母氮素355kg、轻质碳酸钙20kg、硫酸铵3kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的325L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在55r/min;至菌体浓度13%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2200kg、脱盐乳清粉800kg、牛血蛋白450kg、蚯蚓粉蛋白液15250L、复合酵母氮素3700kg、轻质碳酸钙200kg/m3、硫酸铵40kg、硫酸镁2kg、硫酸锌0.3kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸锰0.25kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.7;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在75r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16290u/ml。
实施例5
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜200kg、藕粉固液混合物1000L、牛血蛋白50kg、蝗虫粉蛋白液1500L、复合酵母氮素360kg、轻质碳酸钙25kg、硫酸铵3.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的350L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:60m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在60r/min;至菌体浓度14%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2250kg、藕粉固液混合物12000L、牛血蛋白500kg、蝗虫粉蛋白液15500L、复合酵母氮素3750kg、轻质碳酸钙250kg/m3、硫酸铵45kg、硫酸镁2.5kg、硫酸锌0.35kg、磷酸二氢钾4.5kg、硫酸锰0.3kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在7.0;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在80r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16070u/ml。
实施例6
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜180kg、脱盐乳清粉70kg、牛血蛋白30kg、蚯蚓粉蛋白液1400L、复合酵母氮素340kg、轻质碳酸钙20kg、硫酸铵3.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的300L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在50r/min;至菌体浓度12%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2050kg、脱盐乳清粉900kg、牛血蛋白500kg、蚯蚓粉蛋白液15500L、复合酵母氮素3750kg、轻质碳酸钙200kg/m3、硫酸铵45kg、硫酸镁2kg、硫酸锌0.3kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸锰0.2kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.8;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在80r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16120u/ml。
实施例7
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜200kg、藕粉固液混合物1000L、牛血蛋白30kg、蝗虫粉蛋白液1400L、复合酵母氮素340kg、轻质碳酸钙25kg、硫酸铵1.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的275L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:40m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在60r/min;至菌体浓度13%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2250kg、藕粉固液混合物12000L、牛血蛋白300kg、蝗虫粉蛋白液14500L、复合酵母氮素3550kg、轻质碳酸钙100kg/m3、硫酸铵25kg、硫酸镁2kg、硫酸锌0.25kg、磷酸二氢钾2.5kg、硫酸锰0.2kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.4;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在70r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16090u/ml。
实施例8
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜185kg、脱盐乳清粉75kg、牛血蛋白50kg、蚯蚓粉蛋白液1500L、复合酵母氮素360kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵3.5kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的250L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在65r/min;至菌体浓度11%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2100kg、脱盐乳清粉850kg、牛血蛋白500kg、蚯蚓粉蛋白液15500L、复合酵母氮素3750kg、轻质碳酸钙250kg/m3、硫酸铵45kg、硫酸镁2.5kg、硫酸锌0.35kg、磷酸二氢钾4.5kg、硫酸锰0.3kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.5;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在80r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16040u/ml。
实施例9
种子培养:种子培养基体积5m3。
甘蔗糖蜜200kg、藕粉固液混合物1000L、牛血蛋白45kg、蝗虫粉蛋白液1475L、复合酵母氮素355kg、轻质碳酸钙10kg、硫酸铵3kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的300L雪白白疆菌摇瓶种子液接入种子培养基中进行培养。培养工艺是罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:60m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在60r/min;至菌体浓度14%移种。
发酵培养:发酵培养基体积50m3。
甘蔗糖蜜2250kg、藕粉固液混合物12000L、牛血蛋白400kg、蝗虫粉蛋白液15200L、复合酵母氮素3700kg、轻质碳酸钙200kg/m3、硫酸铵40kg、硫酸镁2kg、硫酸锌0.2kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸锰0.1kg。
先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,培养条件是:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.1;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在80r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
f粘度控制:发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
发酵培养结束,环孢菌素化学效价是16020u/ml。
对比实施例1
种子培养:种子培养基体积2m3。
葡萄糖20kg、黄豆饼粉30kg、玉米浆40kg、蛋白胨12kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵7kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的雪白白疆菌摇瓶种子液100L接入种子培养基中进行种子培养。
培养条件为:罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:50m3/h;搅拌转速50r/min。
至菌体浓度13%移种。
发酵培养:发酵培养基体积20m3。
葡萄糖210kg、黄豆饼粉300kg、玉米浆400kg、蛋白胨120kg、轻质碳酸钙30kg、硫酸铵25kg、硫酸镁1.2kg、硫酸锌0.15kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸锰0.1kg。先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.5;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在70r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,粘度在35-40mpa.s。
补料:
发酵过程中每隔6-8h检测总糖和氨基氮含量。发酵120h后,发酵液中总糖浓度<1.5%,补入葡萄糖,控制总糖浓度在1.5-2.0%;发酵液中氨基氮含量<30mg/100g,补入氮源玉米浆或蛋白胨,控制氨基氮含量在30-40mg/100g;
发酵培养结束,环孢菌素化学效价9482u/ml。
对比实施例2
种子培养:种子培养基体积2m3。
果糖15kg、葡萄糖10kg、干酪素12kg、豆饼粉20kg、玉米浆30kg、蛋白胨10kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵6kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的雪白白疆菌摇瓶种子液100L接入种子培养基中进行种子培养。
培养条件为:罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:60m3/h;搅拌转速60r/min。
至菌体浓度13%移种。
发酵培养:发酵培养基体积20m3。
果糖150kg、葡萄糖100kg、干酪素120kg、豆饼粉200kg、玉米浆300kg、蛋白胨100kg、轻质碳酸钙40kg、硫酸铵30kg、硫酸镁12kg、硫酸锌1.4kg、磷酸二氢钾14kg、硫酸锰13kg。先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.9;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在70r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,粘度在37-42mpa.s。
补料:
发酵过程中每隔6-8h检测总糖和氨基氮含量。发酵120h后,发酵液中总糖浓度<1.5%,补入葡萄糖,控制总糖浓度在1.5-2.0%;发酵液中氨基氮含量<30mg/100g,补入氮源豆饼粉或玉米浆,控制氨基氮含量在30-40mg/100g;
发酵培养结束,环孢菌素化学效价10590u/ml。
对比实施例3
种子培养:种子培养基体积2m3。
玉米粉20kg、葡萄糖15kg、麦芽粉10kg、酵母浸粉20kg、玉米浆30kg、蛋白胨13kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵4kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的雪白白疆菌摇瓶种子液100L接入种子培养基中进行种子培养。
培养条件为:罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:60m3/h;搅拌转速60r/min。
至菌体浓度12%移种。
发酵培养:发酵培养基体积20m3。
玉米粉200kg、葡萄糖150kg、麦芽粉100kg、酵母浸粉200kg、玉米浆300kg、蛋白胨130kg、轻质碳酸钙30kg、硫酸铵40kg。硫酸镁15kg、硫酸锌1.7kg、磷酸二氢钾15kg、硫酸锰2kg。先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养,发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6.5;
b温度:培养温度25~27℃,
c搅拌转速:转速控制在70r/min,
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa,
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7,
发酵过程中,使用数字式粘度计检测发酵液粘度,粘度在40-45mpa.s。
补料:
发酵过程中每隔6-8h检测总糖和氨基氮含量。发酵120h后,发酵液中总糖浓度<1.5%,补入葡萄糖,控制总糖浓度在1.5-2.0%;发酵液中氨基氮含量<30mg/100g,补入氮源玉米浆或蛋白胨,控制氨基氮含量在30-40mg/100g;
发酵培养结束,环孢菌素化学效价8330u/ml。
Claims (8)
1.一种利用雪白白疆菌发酵生产环孢菌素的培养基,其特征在于包括种子培养基和发酵培养基,其中所述种子培养基组成为:
甘蔗糖蜜36~40kg/m3、藕粉固液混合物160~200L/m3或脱盐乳清粉11~15kg/m3、牛血蛋白6-10kg/m3、蝗虫粉或蚯蚓粉蛋白液280-300L/m3、复合酵母氮素68~72kg/m3、轻质碳酸钙1~5kg/m3、硫酸铵0.3~0.7kg/m3;
所述发酵培养基组成为:
甘蔗糖蜜41~45kg/m3、藕粉固液混合物200~240L/m3或脱盐乳清粉14~18kg/m3、牛血蛋白6-10kg/m3、蝗虫粉或蚯蚓粉蛋白液290-310L/m3、复合酵母氮素71~75kg/m3、轻质碳酸钙1~5kg/m3、硫酸铵0.5~0.9kg/m3、硫酸镁0.01~0.05kg/m3、硫酸锌0.003~0.007kg/m3、磷酸二氢钾0.05~0.09kg/m3、硫酸锰0.002~0.006kg/m3。
2.按照权利要求1所述培养基,其特征在于所述藕粉固液混合物制备方法包括如下步骤:首先藕粉加入水中;其次加入硫酸溶液,调节pH至5-6;最后加入碳酸钙和α-淀粉酶,升温至80-90℃,搅拌20-40min,得到藕粉固液混合物,其配伍比例如下:
硫酸浓度:4-5%;
W藕粉∶L水=1kg∶8-10L;
W藕粉∶W碳酸钙=1kg∶0.02-0.03kg;
W藕粉∶Wα-淀粉酶=1kg∶0.01-0.02kg。
3.按照权利要求1所述培养基,其特征在于所述蝗虫粉蛋白液或蚯蚓粉蛋白液制备方法包括如下步骤:
(1)浸泡
分别配置10-20%的氯化钠和5-10%的氢氧化钠混合溶液,加入蝗虫粉或蚯蚓粉,搅拌40-60min,过滤,
W蝗虫粉或蚯蚓粉∶L混合溶液=1kg∶4-6L;
(2)制备蛋白液
过滤后的蝗虫粉或蚯蚓粉加入水,首先加入10%的硫酸溶液,调节pH至5-6,其次加入酸性蛋白酶,最后升温至60-70℃,搅拌120-150min,得到蝗虫粉蛋白液或蚯蚓粉蛋白液,
W蝗虫粉或蚯蚓粉∶L水=1kg∶4-6L,
W蝗虫粉或蚯蚓粉∶W酸性蛋白酶=1kg∶0.02-0.03kg。
4.一种利用权利要求1-3任一项所述培养基发酵生产环孢菌素的培养方法,其特征在于所述培养方法包括如下步骤:
(1)种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至室温,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的雪白白疆菌母瓶液接入种子培养基中进行培养,至菌体浓度10~14%移种;
(2)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至室温,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养,环孢菌素化学效价>16000u/ml时终止发酵。
5.按照权利要求4所述的培养方法,其特征在于所述步骤(2)中还包括控制发酵液粘度为8-14mpa.s的步骤。
6.按照权利要求4所述的培养方法,其特征在于所述培养好的雪白白疆菌摇瓶种子液质量要求为菌体浓度6~10%,镜检无杂菌,接种量为5-7%。
7.按照权利要求4所述的培养方法,其特征在于所述种子培养条件为:罐压0.03~0.06MPa;罐温25~27℃;空气流量:20~60m3/h;搅拌转速:种子培养前10h,进行空气搅拌,空气搅拌结束后,搅拌器转速控制在40~60r/min。
8.按照权利要求4所述的培养方法,其特征在于所述发酵培养条件为:
a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6~7;
b温度:培养温度25~27℃;
c搅拌转速:转速控制在60~80r/min;
d压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
e pH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
f粘度控制:使用数字式粘度计检测发酵液粘度,控制粘度8-14mpa.s。
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