CN1151119A - 菠萝蛋白酶的医学用途 - Google Patents

Abstract

菠萝蛋白酶，一种来自菠萝茎的酶混合物已发现是一种细胞内信号转导的调节剂，特别是其中肌醇磷酸起作用的途径中的调节剂，因此在治疗由这些细胞内信号途径介导的各种疾病和症状中有用。

Description

菠萝蛋白酶的医学用途

本发明涉及菠萝蛋白酶在治疗由细胞内信号介导的各种疾病和症状中的应用。具体地说本发明涉及菠萝蛋白酶在治疗诸如癌症和自身免疫疾病的疾病和症状及做为免疫抑制剂中的应用。另外，菠萝蛋白酶可用作疫苗佐剂。

菠萝蛋白酶是在植物风梨科组织中发现的蛋白水解酶的统称。菠萝蛋白酶是来自菠萝(Ananas comosus)茎的各成份的混合物。它含有至少两种蛋白水解酶，但也含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶；它也可能含有淀粉酶和纤维素酶活性。另外，也存在各种其它成份。

菠萝蛋白酶以前曾用于治疗包括炎症的各类症状，特别是它曾用于治疗腹泻。菠萝蛋白酶在治疗感染性腹泻中的用途在WO-A-9301800中有描述，其中认为菠萝蛋白酶经过以蛋白水解破坏病原体的肠道受体而发挥作用，在WO-A-8801506中讲授了菠萝蛋白酶将病原体和肠道受体分开。

现在已发现，除了感染性腹泻外，菠萝蛋白酶也在非感染性腹泻的治疗中有用，当然，这不能以WO-A-9301800中建议的作用机制解释。

Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，Planta Medioa，1988，377-381都建议菠萝蛋白酶可能在抑制肿瘤生长中有用。Taussig等把这归功于具有过氧化物酶活性的组份或菠萝蛋白酶成份，但没有提供机制的其它解释。然而，Maurer等讲授了菠萝蛋白酶能诱导白血病细胞系的分化且这一能力来自于蛋白水解活性。菠萝蛋白酶的作用机制也不清楚。在治疗诸如炎症的其它症状中菠萝蛋白酶发挥作用的作用机制也尚无满意的解释。

在WO-A-9400147中描述的各个实验证实蛋白水解酶、特别是菠萝蛋白酶能抑制分泌。该申请也公开了菠萝蛋白酶能减少毒素结合活性并能抑制诸如热不稳定性毒素(LT)和霍乱毒素(CT)的毒素及诸如热稳定性毒素(ST)的毒素的分泌效应。这与ST具有不同于LT和CT的作用方式这一事实无关。这些观察结果可用菠萝蛋白酶混合物的一种成分(茎菠萝蛋白酶)似乎能调节环核苷酸途径这一事实来解释。另外，也证实菠萝蛋白酶抑制由钙(Ca²⁺)依赖性途径引起的分泌。

LT和ST都由大肠杆菌产肠毒素菌株(ETEC)产生。一些ETEC菌株也产生称为定居因子抗原的菌毛粘附素。这些粘附素促进ETEC菌珠附着到小肠粘膜上，从而有利于肠毒素的定居和传递。腹泻疾病最终取决于肠毒素的生产和有效传递。

肠毒素经过激活信号途径刺激细胞的分泌。细胞内的内部信号经过“第二信使”实现。

人体的每一个细胞常受到其环境中各种信号的攻击。正常细胞接受并处理这些信号，可能促进生长，分化或死亡或控制其它的细胞功能，如肠上皮细胞液体的分泌。因此，信号是了解细胞中最终决定其命运的过程的关键。通过细胞表面具有不同生化活性的受体接受信号并将该信息进一步传递给效应器蛋白质。接着，这些蛋白质加工信号并将其转导给细胞内的其它分子。发生在细胞与生长因子相互作用之后和细胞反应发生前的一系列生化事件称为信号转导。

大多数细胞信号经过GTP-结合蛋白质、各种蛋白质激酶、蛋白磷酸酶、脂修饰酶和诸如Ca²⁺和环腺苷酸单磷酸(环AMP或cAMP)的第二信使传递。经过转录起动基因表达和随后细胞蛋白质翻译的因子在核中最终解释指令。

已知至少有3种信号途径对于分泌是重要的。一条途径使用了第二信使，环AMP。另一途径使用第二信使环乌苷单磷酸(环GMP或cGMP)。这二个信使称为环核苷酸。第三信号途径(Ca²⁺依赖途径)需要Ca²⁺作为第二信使。WO-A-9400147讲授了茎菠萝蛋白酶能经过干扰环核苷酸和Ca²⁺依赖性途径从而影响分泌而阻止腹泻。

本发明人目前已探索了其它细胞内信号途径，并惊奇地发现：除了其对环核苷酸途径的作用之外，菠萝蛋白酶似乎也作用于其它胞内信号传递途径，特别是那些由磷酸肌醇、蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶所调节的那些途径。

因此，在本发明的第一个方面，提供了菠萝蛋白酶在制备用于依赖于肌醇磷酸、蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶的作用调节细胞内信号途径的试剂中的应用。

在本发明说明书中，肌醇磷酸指任意磷酸化的肌醇分子，不管磷酸化的程度或磷酸基团的位置如何。肌醇磷酸的例子包括磷脂酰-4，5-双磷酸(PIP₂)和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP₃)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶指任何能经过加上或去掉磷酸分子将蛋白质的非活性形式转变成活性形式的分子。

已发现菠萝蛋白酶对于控制导致诸如后叶加压素和凝血酶的非联合细胞外信号分子且特别是影响细胞生长和增生的信号分子(如白细胞介素和其它生长因子)之生产的肌醇磷酸，蛋白激酶或蛋白质磷酸酶依赖型信号途径特别有用。

为了生长或增生，正常细胞需要由邻近和身体其它部分的其它细胞产生的生长因子提供的信号。这与癌细胞的自主行为相反，它由自己本身内部产生的信号控制。涉及细胞生长控制的各种蛋白质的功能可经过改变蛋白质结构或异常大量地产生正常蛋白质的突变束加强或修饰。因此，在癌细胞中，接受和处理信号的细胞器产生缺陷，细胞不能加工这些信号并作出合适的反应。具有缺陷型生长抑制信号的细胞，如那些由缺陷型肿瘤抑制基因产生的细胞不能平衡生长刺激信号。由于该缺陷，信号级联中的生长抑制信号未被传递，细胞不能控制其本身的增生。当肿瘤抑制基因失活时产生癌。同样，由于刺激信号级联的缺陷受到过度刺激的细胞表现出过度增生。癌基因是产生功能改变的蛋白质的基因，其活化强烈地、持续地促进细胞生长。癌基因破坏精细平衡的细胞增生的分子控制，在该程度下接着发生恶性生长。

已证实诸如v-src和相关v-abl蛋白质的蛋白酪氨酸激酶是实验和人癌症中最常涉及的蛋白质之一。c-src是在正常细胞中发现的激酶并受其它激酶的调节。发现在癌细胞中v-src失去这种调节。由于在c-src和v-src蛋白质之间一些氨基酸的差异，v-src激酶具有永久性高活性。该突变型蛋白质酪氨酸激酶的剧烈催化活性对细胞生长的控制具有有害影响。只有受到生长因子的刺激含c-src的正常细胞才会生长；含v-src的癌细胞显示出不同于外部提供的生长因子获得性独立。同时，可能不再对外部生长抑制信号作出反应。因此，产生癌症并形成肿瘤。

蛋白质酪氨酸磷酸化级联(或激酶级联)在通过信号转导的调节事件中起着巨大的作用。许多生长因子受体具有酪氢酸激酶活性，当被激活时，在酪氢酸残基上触发多个细胞蛋白质的磷酸化。这一磷酸化过程的结果引起靶蛋白质获得或失去功能。p21c-ras在介导从受体酪氨酸激酶接受的促分裂和分化信号中发挥着关键作用(Wood等，cell，68，1041-1050，1992；Thomas等，cell，68，1031-1040，1992)，该作用激活一些激酶，包括蛋白激酶C(PKC)成员，Raf，促分裂原活化蛋白质(MAP)和S6激酶家族(Cantley等，Cell，64，281-302，1991)。这些激酶可从多个膜受体上整合信号。

现在认识到，在涉及将受体起动信号转导进核的信号途径中的一个关键成员是促分裂原活化蛋白质激酶(MAPK)的家族。MAPK是丝氨酸/苏氨酸激酶，它被细胞中的各种生长因子和肿瘤诱发物激活。进行过充分研究的这些激酶是P42MAPK和P44MAPK(也分别称为ERK2和ERK1，pp42mapk/erk2和pp44mapk/erk1/mpk，也称为微管相关蛋白激酶；髓鞘碱性蛋白(MBP)激酶；和RSKI和II)

MAP激酶的底物包括pp90和70s rsk激酶和一些转录因子，主要是Jun(Pulverer等，Nature，353，670-674，1991)，Myc和p62TCF。影响转录活性的蛋白质是在癌症处理中最广泛涉及的。

MAP激酶的激活机制非常复杂。MAPK在静止细胞中以去磷酸化形式存在且当酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化时被活化(Boulton等，Cell，65，663-675，1991)。在体外，如果任一残基去磷酸化，这种激活几乎完全逆转(Anderson等，Nature，343，651-653，1990)。最近报道PAC1是抑制MAP-激酶调节的报告基因表达的MAP激酶磷酸酶(Ward等，Nature，367：651-653(1994))。在MAP激酶中酪氨酰和苏氨酰调节位点的磷酸化受双重特异性MAP激酶激酶(MKK或MEK)的介导。MEK又通过被包括原癌基因产物Raf(Anderson等，Biochem.J.，277，573-576，1991)的MAP激酶激酶激酶磷酸化而受到调节，且MEKK又受蛋白激酶C(PKC)的调节。

现在本发明人发现菠萝蛋白酶能干扰对生长较重要的信号传递途径，特别是导致诸如IL-2，血小板产生的生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)的生长因子之生产的信号传递途径。

T-淋巴细胞用作证实细胞生长促进机制作用模式的细胞模型。T-淋巴细胞的生长通过生长因子产生，受体作用，细胞质信号加工和核内基因反应调节。T-淋巴细胞是常用的测量增生的模型，因为该细胞易于发病且白细胞介素-2(IL-2)的作用已充分证实，IL-2是增生和生长所需的T-细胞生长因子。

事实上，T细胞和其它类型的细胞需要刺激以启动为增生所必需的一系列事件。免疫系统含有亿万个白血细胞或淋巴细胞，它分成2类；B淋巴细胞和T淋巴细胞。B细胞在保护宿主抵抗细胞外病原体上发挥作用，T细胞保护宿主抵抗细胞内病原体。B细胞和T细胞分别使用B-细胞受体(BCR)和T-细胞受体(TCR)识别不同抗原的不同形式。

T-细胞激活是一个需要蛋白质酪氨酸激酶活性的复杂过程，它导致细胞生长和分化。激活需要抗原被TCR识别及T细胞表面的其它分子与存在抗原的细胞相互作用。当给T细胞提供合适的抗原和次级协同刺激信号时，T细胞以两种主要的方式发生反应。一种是变大并分裂，从而增加与抗原反应的细胞数。另一种是分泌淋巴因子或细胞因子，蛋白质，其直接抑制病原体或使其它细胞补充进来参加免疫反应。细胞因子白细胞介素2(IL-2)是T细胞生长因子，它在调节免疫反应中发挥关键性作用。

静止T-细胞不能与IL-2正常发生反应，因为这些细胞不能在其细胞表面表达可检测的高亲和力的IL-2受体。抗原刺激是诱导高亲和力IL-2受体表达所必需的，从而引起IL-2的反应性。因此，由T细胞抗原受体(TCR)、协同刺激信号刺激提供的起始激活信号通过诱导IL-2生产和IL-2受体表达起动T细胞激活。随后的T细胞增生由IL-2与其IL-2受体的相互作用起动。如果T-细胞仅通过TCR接受信号，T细胞会变得无活力或可能死亡(称为细胞程序死亡)。如果T-细胞仅接受协同刺激信号，则T细胞保持静止(不发生反应)。

上面所有的事件需要酪氨酸磷酸化，因为蛋白质酪氨酸激酶抑制剂可抑制大多数(如果不是全部)与TCR刺激相联系的随后事件(Mustelin等，Science，247，1584-1587，1990；June等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，7722-7726，1990)。蛋白质酪氨酸激酶活性的TCR-介导的诱导导致包括TCR zeta链(Baniyash等，J.Biol.Chem.，263，18225-18230，1988)，磷酸脂酶c g1(PLCg1)Weiss等，Proc，Natl.Acad，SciUSA，88，5484-5488，1991)，cD 5(Davies等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，6368-6372，1992)，原癌基因vav(Bustelo and Barbacid，Science，256，1196-1199，1992)，含续酪肽的蛋白质(VCP)，埃兹蛋白(Egerton等，EMBO J.，11，3533-3540和J.Immunol.，149，1847-1852，1992)，2AP-70(chan等，cell，71，649-662，1992)和MAPK(Nel等，J.Immunol.，144，2683-2689，1990)的许多细胞蛋白质的酪氨酸磷酸化。

PLC g1酪氨酸磷酸化导致其催化激活，导致磷脂酰肌醇(PI)途径中第二信使产生。PLC裂解磷脂酰肌醇4，5-双磷酸(PIP2)，导致形成肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和1，2-二脂酰甘油(DAG)。这些分子接着作为细胞内第二信使发挥功能以分别诱导Ca²⁺增加和PKC活化。PKC活化后，原癌基因Ras被激活，Raf-1激酶活性增强且MAPK变成磷酸化。MAPK活化引起原癌基因c-fos与c-jun形成二聚体以形成转录复合物AP-1.AP-1复合物与DNA上的成份结合以启动IL-2的转录。

图1概括了导致IL-2基因转录和IL-2生产的PI途径中与TCR活化相关的一些事件。

发现菠萝蛋白酶抑制与生长刺激相关的激酶级联。在该信号传递途径中的一个因子是ras蛋白质，在25至30％的人肿瘤中发现异常形。菠萝蛋白酶能够抑制T-细胞增长所需的信号，这很可能是经过抑制包括MAP激酶的蛋白质的酪氨酸磷酸化来实现。

由于其抑制MAP激酶和其它蛋白质酪氨酸磷酸化的能力，菠萝蛋白酶能作为抗癌剂发挥作用，因为它也抑制诸如血小板来源的生长因子(PGDF)和成纤维细胞和上皮细胞中的表皮生长因子(EGF)的生长因子过度生产。

另外，由于能抑制T-细胞的增生，它是一种免疫抑制剂，在防止宿主排斥移植器官或治疗诸如糖尿病，多处硬化和类风湿性关节炎的自身免疫疾病中有用。这一发现与WO-A-9301800中所讲授的含诸如菠萝蛋白酶的蛋白酶之组合物具有非特异性的免疫刺激活性完全相反。

事实上，我们发现菠萝蛋白酶可用于刺激或抑制细胞因子生产，这取决于它是用于处理激活的细胞(如那些已受到刺激的细胞)还是未激活(即静止或休息)的细胞。因此，它可用作免疫抑制剂，例如用于防止组织排异；或用作免疫刺激剂，例如作为疫苗佐剂。借助于其抑制细胞因子生产和酪氨酸磷酸化的能力，菠萝蛋白酶也可用于防止或处理毒性攻击。菠萝蛋白酶也可用于治疗过敏反应。

正如上面所讨论的，菠萝蛋白酶是各种成份的混合物。尽管在WO-A-9400147中已讲授茎菠萝蛋白酶是负责介导环核苷酸途径的菠萝蛋白酶成份，但不清楚是否茎菠萝蛋白酶也负责菠萝蛋白酶对激酶途径的作用还是菠萝蛋白酶混合物的一些其它成份负责。

然而，这并不影响本发明的工作，因为至少粗制的菠萝蛋白酶混合物能影响MAP激酶的磷酸化(或激活)。

菠萝蛋白酶可用各种途径用药，包括肠道，例如口服，鼻内，口腔或肛门用药或肠胃外用药，例如经静脉内，肌肉内或腹膜内注射。然而，优选口服途径。

口服用药时为了帮助菠萝蛋白酶通过胃，需要以肠保护型制品配制该酶。其它口服可用的配方包括糖浆，酏剂和硬和软胶囊，它可以是肠覆盖型的。

菠萝蛋白酶活性在较宽的pH范围内(pH2-9)是稳定的。因此，肠保护(或肠覆盖)菠萝蛋白酶抵抗胃内酸性条件并非是必需的。然而，可能必需保护该酶免受消化道酸性蛋白酶的消化。因此，菠萝蛋白酶可与缓冲剂(如碳酸氢盐)一起施用。

菠萝蛋白酶的剂量通常以Rorer单位，FIP单位，BTU(菠萝蛋白酶酪氨酸单位)、CDU(酪蛋白消化单位)，GDU(明胶消化单位)或MCU(凝乳单位)来测量。蛋白酶活性的一个Rore单位定义为在pH7和25℃下水解标准化酪蛋白底物使在280nm时每分钟吸光率增加0.00001的酶量。菠萝蛋白酶活性的一个FIP单位指标准制品的量，它在标准条件下以某一起始速率水解合适的酪蛋白制品(FIP对照)，使每分钟释放的肽量不被特定的蛋白沉淀剂沉淀，在275nm下产生与1μm酪氨酸相同的吸光率。BTU，CDU，GDU和MCU按文献中的定义如下：

BTU

一个菠萝蛋白酶酪氨酸单位，是在测定条件下(例如，在pH5和30℃下消化酸变性的血红蛋白底物后)每分钟释放1微摩尔酪氨酸的酶量。

CDU

从pH7.0的标准酪蛋白底物在37℃消化1分钟后释放1微克酪蛋白所需的酶的量。

GDU

在45℃和pH4.5下消化20分钟后从标准明胶溶液释放1毫克(10^-3g)氨基氮的酶活性。

1100BTU/g＝750CDU/mg＝1200GDU/g。

尽管精确的剂量由医生或医务人员来控制，但发现日剂量从50到4000GDU/天可能是合适的，例如，从100到1000GDU/天。日剂量可用每天一个或多个等分试剂来提供，例如一天二次，三次或四次。特别优选的剂量是10mg/kg(一个普通的成年人剂量为700mg，相当于2800BTU)。

现在将以下面的实施例来描述本发明。实施例中提到一些附图，其中：

图1：描述了与导致IL-2基因转录和IL-2生产的磷脂酰肌酸(PI)途径中之T-细胞受体活化相联系的事件。

图2：在T-细胞杂交瘤GA15获得的蛋白质上检测MAP激酶的免疫印迹。GA15用钙离子载体，PMA或离子载体与PMA结合刺激或用PBS进行假处理(未刺激对照)。细胞用菠萝蛋白酶或用PBS处理。

图3：检测MAP激酶的免疫印迹。从用钙离子载体结合PMA激活的或PBS处理的(未刺激对照)GA15中获得蛋白质，GA15已用菠萝蛋白酶或用PBS处理。测定在给定的时间间隔内样品中MAP激酶的存在。

图4：显示了在用菠萝蛋白酶或PBS处理的刺激的T-细胞中MAP激酶对时间的存在。

图5：是显示产生的抗MAPK高度保守肽(ErK1)的多克隆抗体识别Mr 42000和44000两个蛋白质的免疫印迹。

图6：是与MAPK抗体的免疫印迹，显示了在用菠萝蛋白酶处理的细胞中对蛋白质磷酸化正常观察到的电泳迁移率改变被部分抑制。

图7：显示了在体外GA15细胞中菠萝蛋白酶处理对IL-2，IL-4和IFN-γmRNA积累的影响。当用PMA(20ng/ml)和钙离子载体A23187(500ng/ml)刺激时用菠萝蛋白酶处理的GA15细胞积累较少的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。

图8：显示了用菠萝蛋白酶处理的脾T-细胞用2c11(αCD3e)和CD28(αCD28)刺激时产生较少的IL-2。

图9：显示了菠萝蛋白酶处理对体外脾下细胞IL-2，IL-4和r-INF mRNA积累的影响。当用制动的抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激时用菠萝蛋白酶处理的脾T-细胞积累较少的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。

图10：显示了当用固相抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激时，菠萝蛋白酶处理增加脾-T细胞增生。

图11a和b：显示了菠萝蛋白酶处理增加抗-CD3e(a)和抗-CD28(b)mAb与脾T细胞的细胞表面结合，所示为FAC图移向右侧。

图12：显示了菠萝蛋白酶增加抗-CD3e mAb与GA15细胞表面的结合。

图13a和b：显示了在脾T-细胞中酪氨酸磷酸化蛋白质的免疫印迹。图13a显示菠萝蛋白酶处理诱导56和58KDa蛋白质的蛋白质酪氨酸磷酸化。图13b显示了菠萝蛋白酶处理抑制16Kda蛋白质的蛋白质酪氨酸磷酸化。

图14：显示了菠萝蛋白酶处理对体外GA15细胞中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA积累的影响。当用固相抗-CD3e(4μg/ml)和可溶性抗-CD28(10μg/ml)mAb刺激时，用菠萝蛋白酶处理的细胞中积累更多的IL-2，IL-4和IFN-γmRNA。

图15：显示了菠萝蛋白酶对绵羊体内红血细胞(SRBC)抗体反应的影响。用菠萝蛋白酶处理的小鼠具有更多生产抗SRBC之抗体的B细胞。

材料和方法

细胞系：

Tho细胞杂交瘤GA15用于研究酪氨酸磷酸化的实验。从胸癌BW5147与Th2克隆F4的融合产生GA15，F4对与I-Ab相联的KLH具有特异性(Fox，Int.Immunol.，5，323-330，1993)。细胞在由补充了10％胎牛血清(Inovar Bologicals，Gaithersburg，MD)，50mm 2-巯基乙醇，40mM谷氨酰胺和50μg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基(biofluids，Rockville，MD)组成的组织培养基(TCM)中维持。

动物：

研究了菠萝蛋白酶预处理对分离的鼠脾T-细胞的IL-2生产的影响。雄性C57BL/ONCr1BR小鼠购自Charies River Laboratories(Wilmington，MA，USA)。幼年小鼠(3至4月龄)和老年小鼠(20到26月龄)用于配对实验。不使用发现具有肿瘤、可见皮肤损伤或明显病状的小鼠。为了进行体内实验和研究IL-2，IL-4和IFN-γmRNA积累的实验，雌性Balb/c小鼠购自A.Tuck和Son Ltd(UK)。使用6到10周龄的小鼠。

拮抗剂

佛波酯在结构上与1，2-二脂酰甘油(DAG)相关，从而引起PKC激活，它诱导Raf-1的多磷酸化(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，8855-8859，1988)，以及MAP激酶的活化(Chung等，Mol.all.Biol.，11，1868-1874，1991)。离子载体增加细胞中的胞质自由钙，后者又结合钙调蛋白和PKC。

为了进行酪氨酸磷酸化实验，佛波醇12，豆蔻酸13-乙酸(PMA)和钙离子载体A23187用于刺激细胞。佛波酯和离子载体处理T-淋巴细胞协同作用以模拟第二信使二乙酯酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP₃)的效应，从而再生出许多TCR刺激特征(Truneh等，Nature，313，318-320，1985)，如IL-2分裂，IL-2受体表达和T细胞增生。

从小鼠分离脾T-细胞：

经过折断颈椎处死动物，并无菌取出脾脏。在由补充有10％加热灭活的胎牛血清(FCS)(GIBCO实验室)和2mM L-谷氨酰胺，5×10^-52-ME和抗生素(50mg/ml庆大霉素和10U/ml青霉素)的RPMI1640(GIBCO实验室，Grand Island，Ny)组成的组织培养基(TCM)中制备单细胞悬液。在裂解缓冲液(140mM NH₄Cl，17mM Tris，pH7.2)中以5×10⁷淋巴细胞/ml裂解红细胞2-5分钟。经过加入TCM终止裂解，经过在尼龙绒(Polysciences，Warrington，PA)上37℃培养1小时纯化T细胞(Julius et al.，Eur.J.Immunol.3：645，(1973))。在流出物中收集T细胞，以流式细胞光度术评价含有790％的Thy-1和＜5％MHCII型+细胞。

为了测量鼠T-细胞产生的IL-2，单克隆抗体(mAb)用作模拟在T细胞表面和存在抗原的细胞之间发生的分子相互作用的颉抗剂。单克隆抗体2C11(抗-CD3e链)用于交联TCR受体并模拟抗原肽/主要组织相容性(MHC)刺激的颉抗效应。经过使用抗-CD28 mAb(37.51)通过CD28提供协同刺激信号。已证实CD28分子与抗体的连接和TCR的交联起动导致IL-2生产和T细胞增生的特异性信号转导。

其它试剂：

从所示来源购买试剂：绵羊红血细胞(SRBC)来自TCS Biological(Buckingham，UK)；抗-CD3e-链mAb(145-2c11)来自Pharmingen(San Diego，CA)；抗-CD28 mAb(PV-1)和多克隆仓鼠IgG(对照仓鼠IgG)由Drc.June(NMRI，Bethesda，mD)惠赠；山羊抗-仓鼠IgG Ab，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸(PMA)，钙离子载体A23187均来自Sigma(Dorset，UK)；小鼠抗磷酸酪氨酸mAb(4G10)来自UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)；连接有辣根过氧化物酶的山羊抗-小鼠IgG Ab来自Southern Biotechnology Associates(Birmingham，AL)；连接有异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗-仓鼠IgG Ab来自Cappel(Durham，NC)；RNA 201B来自Cinna/Biotecx Laboratories(Houston，TX)RNAguard，dNTP都来自Pharmacia Biotech(St Albans，Herts)；MMLV-逆转录酶，随机引物都来自GIBCO BRL(Gaithersberg，MD)；biotaq聚合酶来自Bioline(London，UK)；粗制菠萝蛋白酶提取物(E.C.3.4.22.4)(批号TAD8TK1125)来自Miles Scientific(Elkhart，IN)。

GA15细胞处理和刺激：

为了进行磷酸蛋白实验，在第二信使刺激前用菠萝蛋白酶(15μg/ml或50μg/ml，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中稀释)预处理GA15(1×10⁶细胞)30分钟。经过重复离心(1500rpm，Sorvall RT 6000B冷冻离心机；Dupont)和在RPMI中重新悬浮洗涤细胞二次。单独用PBS载体处理对照细胞。

细胞用钙离子载体(1μm)，PMA(10ng/ml)或离子载体与PMA结合刺激各种时间长度。刺激后，裂解细胞并按下面所述测定酪氨酸磷酸化的蛋白质。

测定脾T-细胞中IL-2的生产：

为了测定IL-2生产，将鼠脾T细胞以每孔10⁵细胞在96孔，平底，微培养板(Corning，Corning，NY，USA)上培养。用100μg/ml固相(与平板结合)抗小鼠CD3e mAb(145-2c11)(Leo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，84，1374，1987)与10μg/ml可溶性抗-小鼠CD28 mAb(37.51)(Gross等，J.Immunol.，144，3201，1990)刺激细胞。为了提供固相抗-小鼠CD3e mAb，在PBS中稀释145-2c11腹水，以50μl加到微培养板上，4℃培养16小时，然后将孔在PBS中洗涤3次。在收获培养上清分析IL-2活性前将一式三份培养物在湿润的5％CO₂中37℃培养24小时。使用IL-2依赖型细胞系CTL-L按以前所述测量IL-2活性(Gtllis等，J.Immunol.，120，2027，1978)。简单地说，在96孔平底微培养板上以4×10³ CTL-L细胞/孔系列稀释上清。24小时后，用0.5μci/孔[3H]胸腺嘧啶再脉冲细胞16小时。收获细胞并用液闪计数测定增生。单位使用重组鼠IL-2(Pharmingen，San Diego，CA，USA)作标准。

在测置IL-2，IL-4和IFN-γmRNA积累的实验中和在FACS分析中，在含50μg/ml菠萝蛋白酶的RPMI 1640中以10⁷细胞/ml在37℃培养细胞30分钟。伪处理的细胞用等体积的磷酸缓冲盐溶液(0.1M，ph7.4；PBS)(菠萝蛋白酶稀释剂)培养。培养后，细胞在RPMI 1640中洗涤3次，然后垂悬于TCM中。

细胞培养物的mRNA测定：

在研究细胞因子mRNA积累的实验中，GA15杂交瘤以2ml培养体积在24孔平底板(Nunc，Rosskilde，Denmark)中以每孔2.5×10⁶个细胞培养4小时。脾T细胞以4ml培养体积在6孔平底板(Flow Laboratories，Mclean，VA)中以每孔5×10⁶个细胞培养24小时。在研究增生的实验中，脾T细胞以一式三份在96孔平底板(Nunc)中以每孔10⁵个细胞在200μl培养体积中培养36小时。这些培养物用0.5μCi[³H]TdR脉冲16小时，然后收获到玻璃纤维上并计数掺入的[³H]TdR。全部试剂在TCM中稀释，除了固相抗-CD3e mAb的制备是在PBS中稀释mAb，加到培养板上以覆盖孔的底部，在4℃培养16小时，然后用PBS洗涤孔3次。所有细胞在37℃下在润湿的5％CO₂中培养。

流式细胞光度术：

染色前，细胞在1ml含50％过滤的马血清的荧光激活细胞分类(FACS)缓冲液(含1％加热灭活的FCS的PBS，0.02％NaN₃)中在冰上培养30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤一次。细胞在100μlFACS缓冲液中在冰上用抗-CD3e mAb，抗-CD28 mAb或仓鼠IgG对照Ab(均为10μg/ml)染色30分钟并用FACS缓冲液洗涤一次。经过将细胞在100μl FACS缓冲液中在冰上用FITC连接的抗仓鼠IgG(10μg/ml)培养30分钟然后在FACS缓冲液中洗涤一次检测特异性接合到细胞表面的Ab。细胞垂悬于1％多聚甲醛(在FACS缓冲液中稀释)中并在4℃贮存。在Becton Dickinson FACS can流式细胞光度计(BectonDickinson，Mountain View，CA)上分析细胞。淋巴细胞向前和侧向分散通过闸门，数据在对数刻度上标示。细胞因子mRNA的PCR分析：

使用以前描述的半定量RT-PCR试验的修改方法测量IL-2，IL-4和IFN-γmRNA的积累(Svetic等，J.Immunol.147：2391-2397(1991))。简单地说，使用RNA201 B根据厂商说明书(Cinna/BiotecxLaboratories)从细胞和脾组织(Chomczynski and Sacchi，Anal.Biochem.162：156-159(1987))分离RNA，以标准方法(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd.edn，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))使用从样品中回收的3μg总RNA以25μl的终反应体积逆转录mRNA。使用2.5μl逆转录的mRNA样品作为cDNA模板从25μl的终体积进行PCR，每个样品以一式2份进行。对IL-2，IL-4，IFN-γ特异性的寡核苷酸和管家基因次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和PCR的其它成份如前面所述(Svetic等(1991)，出处同上)。

全部PCR由在95℃变性1分钟，在55℃退火1分钟和在72℃延伸2分钟组成。PCR循环数用于保证当扩增产物可被检测但低于饱和浓度时终止扩增，测定各细胞因子并分析RNA样品。经过琼脂糖凝胶电泳和根据厂家建议将DNA转移到Hybond N⁺尼龙膜上按大小分离扩增的DNA来检测PCR产物(Amershan，Buckinghamshire，UK)。

使用以辣根过氧化物酶(HRP)标记的，与ECL化学发光检测系统反应的细胞因子特异性寡核苷酸(Svetic等(1991)出处同上)按厂家所述(Amersham)显示扩增的细胞因子mRNA。特异性信号记录在放射自显影膜(Kodak，Rochester，NY)上，使用Phoretix 1-D软件(phoretixInternational，New castle，UK)在Sharp JX-3F6计算密度计(Sharp，日本)上分析。

由HPRT产物产生的信号强度用于保证进入PCR的靶cDNA的平均负荷。一般来说，HPRT产物产生的信号为不同处理组以相同方式刺激的细胞中分离的样品之相应信号强度的10％以内。计算各样品中相对于HPRT产物产生的信号由细胞因子产物产生的信号的强度。

细胞的免疫印迹：

按Thomas等(Cell，68，1031-1040，1992)所述进行细胞磷酸酪氨酸印迹。简单地说，经过在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl₃ 4mM EDTA，1％Triton X-100，4mM Sodium orthovanadate，1mM PMSF，50mM NaF，10μg/ml亮抑蛋白酶肽)中在持续摇动的条件下裂解细胞30分钟从1×10⁶ GA15细胞制备细胞溶胞产物。将溶胞产物澄清(14,000xg 2分钟)，悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中并煮沸5分钟。将含等量蛋白质的样品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分辨。分离的蛋白质经电泳转移到硝酸纤维素(BioRad)上，未占据的结合位点在含5％牛血清白蛋白(Sigma，fraction Vi BSA)，0.05％NP-40，170mMNaCl和50mM Tris(pH7.5)的封闭溶液中封闭。将免疫印迹物与1μg/ml抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G10；IgG 26k)(Upstate BiochemicalIndustries，NY)保温以检测酪氨酸磷酸化的蛋白质。以辣根过氧化物酶连接的山羊抗小鼠IgG检测结合的单克隆抗体。使用ECL化学发光反应(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)测定免疫反应性，特异性信号记录在放射自显影胶片上。

使用兔抗大鼠MAP激酶R2(erk1-CT)多克隆IgG，接着用辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔IgG进行分离蛋白质的免疫印迹以检测MAP激酶。使用的抗MAP激酶抗体识别分别由erk1基因，mapk基因和mpk基因编码的42kda，43kda和44kda MAP激酶。

用αCD3e和αCD28mAb刺激后分析蛋白质酪氨酸磷酸化：

刺激前细胞以5-10×10⁷细胞/ml在37℃的RPMI 1640中悬浮5分钟。使用的PMA和钙离子载体A23187分别为20和500ng/ml。经过在各mAb为10μg/ml的条件下在冰上保温T细胞30分钟进行CD3e和CD28 mAb的交联。洗去多余的抗体后，将细胞以5-10×10⁷细胞/ml悬浮于RPMI1640中(均在4℃)。在37℃下与10μg/ml山羊抗-仓鼠IgG进行交联。按附图说明和说明书中所示的时间刺激细胞。经过加入冰冷的终止缓冲液，产生0.5％Triton x-100，25mM Tris，pH7.2，75mM NaCl，400mM EDTA，10mM氟化钠，400mM Sodiumorthoranadate，10mM磷酸钠，74mg/ml亮抑蛋白酶肽，740mMPMSF和74μg/ml抑蛋白酶肽的终浓度终止刺激。在4℃裂解后，样品以12,000rpm(13,200g)在4℃离心15分钟。收集澄清后的上清液，加入等体积的2X SDS-PAGE样品缓冲液(50mM Tris，pH7，700mM-2ME，50％(v/v)甘油，2％(w/v)SDS，0.01％(w/v)溴酚兰)。蛋白质以100℃溶解5分钟并以SDS-PAGE分辨。

羊红血细胞试验：

小鼠在实验的1，4和6天接受3×200μl 200μg菠萝蛋白酶或等体积的0.9％NaCl(菠萝蛋白酶稀释剂)的静脉内(i.v.)注射。在实验的第4天两个处理组接受100μl腹膜内(i.p.)注射10⁷SRBC或等体积的0.9％NaCl(SRBC稀释剂)。在第7天处死小鼠，取出其脾脏，并按细胞制备部分所述分离脾细胞。以Weir(1986)所述的以Jerne和Nordin的原始方法为基础的试验测定分泌对SRBC抗原具有特异性的抗体的B细胞数。简单地说，在160μl，由5×10⁵个脾细胞，6×10⁶SRBC和1：27溶于RPMI 1640的豚鼠补体组成的溶液中进行测定。反应混合物放入经过将两玻璃片与双侧管连接然后封上蜡制成的室中。样品在37℃保温1小时，然后计算形成空斑的细胞(PFC)(即分泌SRBC特异性Ab的B细胞)。

结果

实施例1

在GA15中菠萝蛋白酶对离子载体和佛波酯诱导的酪氨酸磷酸化的影响：

测定了菠萝蛋白酶预处理的T-细胞对酪氨酸激酶细胞底物的第二信使刺激的影响。使用特异性抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹显示了用PMA，离子载体或PMA结合离子载体(PMA+Ca)刺激5分钟后一些蛋白质带的酪氨酸磷酸化。大约42Kda的主要蛋白质带是最清晰的。PMA+Ca的协同效应增加了磷酸化带的强度(图2)。

菠萝蛋白酶对酪氨酸磷酸化的效应以抗磷酸酪氨酸免疫印迹检测时其抑制42kda带存在的能力来测定。当用全部第二信使颉抗物刺激时，菠萝蛋白酶预处理的GA15细胞封闭42kda蛋白质的酪氨酸磷酸化。这一带未用磷酸酪氨酸免疫印迹检测。由于PMA+Ca组合的协同效应，随后的全部实验用该组合进行。

接着检查了磷酸化的动力学并测定了在5分钟时菠萝蛋白酶抑制酪氨酸磷酸化的能力是时间的作用还是菠萝蛋白酶完全抑制酪氨酸磷酸化。发现菠萝层的酶并不完全抑制磷酸化，但延迟酪氨酸磷酸化(图3)。然后经过对放射自显影的光密度测定法测量定量磷酸化的动力学(见图4)。尽管酪氨酸磷酸化延迟，但该带的磷酸化并未达到在未处理的对照中观察到的相同强度且到180分钟为止完全脱磷酸化(资料未显示)。

当用第二信使颉抗物刺激细胞时，除了42kda蛋白质外，还观察到一些尚未鉴定的其它蛋白质的抑制。尽管如此，以抗磷酸酪氨酸免疫印迹检查时，菠萝蛋白酶不影响未刺激细胞中丰富的细胞磷酸蛋白质的总体磷酸化。主要42kda磷酸化带的鉴定：

如上所述，用生长因子及以佛波酯和钙离子载体处理后MAPK家族的一些成员在酪氨酸残基上磷酸化。由于文献中描述的MAPK的分子量与本实验酪氨酸磷酸化的主要蛋白质带相对应，我们假定在GA15细胞中观察到的42kda蛋白质是MAPK。因此我们使用抗-MAPK抗体检测GA15细胞中的MAPK。

图5显示了针对MAPK高度保守肽(ErK1)的多克隆抗体识别Mr 42,000和44,000两种蛋白质(分别假定为erK1和erK2)。42kda蛋白质显示出的电泳迁移率与在刺激的T-细胞中检测的42kda的含磷酸酪氨酸的蛋白质相似。44kda带也与酪氨酸磷酸化不依赖于PMA加离子载体刺激的蛋白质相关。也检测到48kda的蛋白质和其它低分子量的蛋白质，尽管这些带在未加抗-MAPK的对照免疫印迹中也检测到，认为该反应性无特异性。

在所有试验样品中以抗MAPK抗体的免疫印迹显示出相似强度，表明在菠萝蛋白酶处理的细胞中观察到的酪氨酸磷酸化强度减少不是由于存在的蛋白质水平不同。电泳迁移率：

经过其在电泳迁移中的特征性延迟检测磷酸化的MAP激酶，我们还研究了是否本实验中磷酸化的42kda带是MAPK。经过用抗-MAPK抗体进行免疫印迹分析检查细胞溶胞产物。

以MAPK抗体进行的免疫印迹表明电泳迁移率的改变与正常情况下在MAPK磷酸化中观察到的一致。在用菠萝蛋白酶处理的细胞中这种迁移率的改变也被部分封闭(图6)。菠萝蛋白酶对体外GA15中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA生产的影响：

上面显示用菠萝蛋白酶处理GA15 T细胞杂交瘤，当用PMA和钙离子载体A23187刺激细胞时导致酪氨酸磷酸化改变。具体地说，菠萝蛋白酶显著减少称为MAP激酶的42KDa蛋白质的酪氨酸磷酸化。为了测定是否酪氨酸磷酸化方式的改变由菠萝蛋白酶导致的任何功能改变诱导，我们测量了细胞因子mRNA在GA15中的积累。

经过培养4小时后使用RT-PCR试验测定编码这些细胞因子的mRNA的积累来试验菠萝蛋白酶对IL-2，IL-4和IFN-γ生产的影响。用PMA和A23187刺激GA15细胞。这种组合刺激(PMA和A23187)直接激活细胞信号传递途径，因而绕过全部细胞表面分子。使用相当短的培养期限(4h)是为了保证积累的细胞因子mRNA是使用特异性刺激的结果而不是新合成的细胞因子的自分泌效应。

在单独用TCM培养的细胞中检测不到细胞因子mRNA。与对照(PBS)细胞相比，用PMA和A23187刺激后的全部细胞因子mRNA种类的积累在用菠萝蛋白酶处理的GA15细胞中一直较低(图7)。对于IL-4，细胞因子mRNA积累的差别最明显。在用菠萝蛋白酶处理的细胞中明显更低(n＝3，p＜0.05)。由于MAP激酶的酪氨酸磷酸化与细胞因子基因转录相联系(pelech，curr.Biol.3：513(1993))，我们假定细胞因子mRNA积累的减少由MAP激酶酪氨酸磷酸化的减少引起。菠萝蛋白酶对脾T-细胞中IL-2生产的影响

接着我们研究了当通过细胞表面分子刺激时在从小鼠(鼠)脾分离的正常T-细胞中菠萝蛋白酶是否影响细胞因子生产。第一种刺激组合(PMA+A23187)直接激活细胞信号途径，因而绕过了所有细胞表面分子。固相αCD3e和可溶性抗CD28 mAb的组合通过T细胞受体(经CD3e链)提供初级信号并通过CD28提供共同刺激信号以激活细胞信号级联。以前已显示出两种刺激组合(PMA+A23187；αCD3e+αCD28)提供最适T-细胞激活(Truneh等，Nature，313：318-320(1985)；Linsley and Ledbetter，Ann.Rev.Immund.，11：191(1993))，但使用的机制不同(即分别是直接和间接作用)。

测量了经幼鼠脾T细胞分泌进培养上清中的IL-2。在抗-CD28mAb存在下用固相抗-CD3e mAb刺激T细胞24小时，如上所述。在缺乏抗体或单独存在抗-CD28或抗-CD3e的条件下培养T细胞用做对照。

图8显示了单个实验的结果。在缺乏抗体或见有单独的抗-CD28时培养的T细胞不产生可检测水平的IL-2(资料未显示)。同样地，单独的固相抗-CD3e产生几乎检测不到的IL-2水平。由于通过TCR的初级信号和共同刺激信号都是最适T细胞激活所需要的，所以在两种抗体存在的条件下培养T细胞。

在培养物中抗CD-28和抗-CD3e的组合导致T细胞产生的IL-2大量增加。刺激后，在幼年和老年小鼠间观察到IL-2生产的差异。这一现象在文献中有广泛的报道(Thoman及Weigle，1989进行了综述)。另外，正如以前在GA15实验中观察到的，用菠萝蛋白酶预处理的T细胞比仅用PBS预处理的T细胞产生的IL-2明显要少。在年老和年幼小鼠中注意到相似的减少、当用通过TCR的初级信号和经CD28辅助分子的共同刺激信号最理想地刺激T细胞时，观察到这一效应。菠萝蛋白酶的效应似乎不与年龄相关，因为年幼和年老小鼠的T细胞都表现出IL-2生产减少。菠萝蛋白酶对体外脾T-细胞中IL-2，IL-4和IFN-γmRNA生产的影响：

接着我们研究了菠萝蛋白酶诱导的酪氨酸磷酸化方式的改变是否影响脾T-细胞产生的其它细胞因子。经过测量编码这些细胞因子的mRNA的积累，我们研究了菠萝蛋白酶对IL-2，IL-4和IF-γ生产的影响。在单独的培养基中或在固相抗-CD3e和可溶性抗-CD28mAb之组合存在的条件下培养T细胞24小时。在仅含TCM培养的细胞中检测不到细胞因子mRNA(资料未显示)。

刺激后全部细胞因子mRNA种类的积累在菠萝蛋白酶处理的T细胞中比对照要低(图9)。对于IL-4，细胞因子mRNA积累的差异最显著，在用抗CD3e和抗-CD28 mAb刺激的菠萝蛋白酶处理的细胞中明显较少(n＝3，p＜0.05)。菠萝蛋白酶对体外脾T-细胞增生的影响：

由于在菠萝蛋白酶预处理的脾T细胞中观察到细胞因子mRNA积累减少且这些细胞因子(特别是IL-2和IL-4)对T细胞增生较重要，因此可期望菠萝蛋白酶会引起T细胞增生减少。因而我们经过测量用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激的细胞中掺入的³H-TdR研究了菠萝蛋白酶对T细胞增生的影响。令人惊奇的是，菠萝蛋白酶预处理的T细胞引起T细胞增生明显增加(n＝6；p＜0.05)，而不是象预期的那里减少增生(图10)。这些矛盾的效应的一个可能的解释是，菠萝蛋白酶可能引起细胞因子生产减少，但增加对细胞中生长因子的反应性，如对IL-2和IL-4的反应性(很可能是经过修饰这些生长因子的细胞表面受体或经过对信号级联的影响增加表达。菠萝蛋白酶对脾T细胞表面分子的影响：

由于以前已证实菠萝蛋白酶去掉特异性T细胞表面分子(Hale及Haynes，J.Immunol.，149：3809-3816(1992))，我们用流式细胞光度术研究了是否菠萝蛋白酶去掉菠萝蛋白酶处理的脾T细胞上的CD3e和CD28分子。用于这些研究的mAb与上面所述的用于刺激试验的相同。我们观察到与脾T细胞表面CD3e的结合对于用菠萝蛋白酶处理的细胞一直更高(图11a)。还发现抗-CD28 mAb与CD28(在脾T细胞上以可检测的水平表达)的结合增加(图11b)。这些结果表明菠萝蛋白酶处理去掉的细胞表面分子不是所观察到的细胞因子mRNA积累减少的原因，尽管mAb与CD3e和CD28分子的结合增加可能引起菠萝蛋白酶处理的细胞增生增加。菠萝蛋白酶对GA15细胞表面分子的影响：

由于我们观察到αCD3e与菠萝蛋白酶处理后的脾T细胞结合增加，我们也研究了是否菠萝蛋白酶会影响GA15细胞上的CD3e和CD28分子。用于这些研究的mAb与上面所述的刺激试验中所用的相同。菠萝蛋白酶处理后mAb与GA15表面的CD3e的结合似乎又略有增加(以平均荧光强度的增加表示(图形移向右侧)(图12)。这一结果与以前对脾T-细胞观察到的一致。这种观察到的增加是特异性事件，因为在菠萝蛋白酶和PBS处理的GA15中，对照mAb未显示出高于背景水平的结合增加。抗-CD3e mAb与GA15表面的结合增加不可能由CD3e的表达增加引起，因为细胞仅在37℃下用菠萝蛋白酶处理了30分钟，且随后的染色程序在4℃进行，其中预期的细胞活性非常小。很可能mAb与CD3e结合的增加由菠萝蛋白酶修饰该分子暴露了更多的抗原决定簇引起。

菠萝蛋白酶对正常鼠体外脾T细胞中酪氨酸磷酸化的影响：

前面我们研究了菠萝蛋白酶对GA15细胞中酪氨酸磷酸化的影响。接着我们研究了菠萝蛋白酶处理对正常鼠T细胞酪氨酸磷酸化的影响。从健康的Balb/c小鼠脾脏分离T细胞并用PMA和A23187或固相抗-CD3e和可溶性抗-CD28mAb刺激，如上面对GA15细胞所述。分离脾T细胞，然后按Vandenberghe等〔J.Exp.Med.175：951-960(1992)〕所述在含5ng/ml PMA的TCM中培养48小时，接着进行刺激以分析酪氨酸磷酸化。在PMA中预培养的理由是在休息T细胞中酪氨酸磷酸化的增加非常难以检测(Vandenberghe等，(1992)出处同上)。

在脾T细胞中观察到的酪氨酸磷酸化方式与以前在GA15中观察到的不同(图13a和13b)。菠萝蛋白酶抑制低分子量(大约16KDa)蛋白质的酪氨酸磷酸化，不管细胞是否受到刺激(图13b)。以前在GA15中观察到的42KDa酪氨酸磷酸化MAP激酶带未检测到。对于这些细胞需要更灵敏的试验测量MAP激酶活性。在脾T细胞和GA15中酪氨酸磷酸化方式的另一显著的区别是菠萝蛋白酶处理导致蛋白质酪氨酸磷酸化(图13)，而在GA15细胞中刺激后有抑制效应。当用PMA和A23187或抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激T细胞时，观察到主要56KDa酪氨酸磷酸化蛋白质。另外，在这些细胞中还检测到略大于58KDa的酪氨酸磷酸化蛋白质。除非T细胞用菠萝蛋白酶处理，否则检测不到这些蛋白质的酪氨酸磷酸化。这些蛋白质在用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激2到5分钟后发生酪氨酸磷酸化，且在刺激后保持磷酸化至少30分钟(图13a和13b)。由于一些蛋白质的磷酸化与细胞反应激活相联系，菠萝蛋白酶在T细胞中诱导酪氨酸磷酸化的能力表明菠萝蛋白酶可激活这些细胞。以前研究菠萝蛋白酶对脾T细胞增生的影响获得的结果表明这些细胞被菠萝蛋白酶激活。

实施例2

在前面的实施例中我们注意到，菠萝蛋白酶引起GA15细胞(一种T细胞杂交瘤)中蛋白质(特别是MAP激酶)磷酸化减少。我们还观察到当用佛波酯和离子载体刺激时，菠萝蛋白酶处理GA15细胞导致IL-2，IL-4和IFN-γ减少。另外，我们还观察到当提供更多的生理刺激(即分别经T-细胞受体提供信号和经CD28提供共同刺激信号的αCD3e和αCD28)时，菠萝蛋白酶处理正常鼠脾T-细胞引起IL-2，IL-4和IFN-γ同样减少。综合起来，这些资料表明酪氨酸磷酸化的减少与细胞因子生产的减少相关。然而，从显示蛋白质酪氨酸磷酸化增加的图13中所获得的资料和在脾T-细胞增生中观察的增加(图10)表明菠萝蛋白酶也刺激或激活T细胞。

我们进行了进一步的实验并研究了菠萝蛋白酶对用αCD3e和αCD28刺激GA15细胞后产生的细胞因子mRNA的影响(前面实施例1的实验中研究了菠萝蛋白酶和PMA+A23187对细胞因子生产的影响)。

令人感兴趣的是我们观察到了当用菠萝蛋白酶处理细胞并用抗-CD3e和抗-CD28 mAbs刺激时细胞因子mRNA生产增加(图14)。

这种细胞因子mRNA积累的方式与在实施例1中观察到的相反，其中当用佛波酯加离子载体刺激时菠萝蛋白酶减少GA15细胞中细胞因子mRNA积累。

另外，对IL-4而言细胞因子mRNA积累的差异最显著，在用抗-CD3e和抗-CD28 mAb刺激的菠萝蛋白酶处理的细胞中显著更高(n＝3，p＜0.05)(前面在用PMA+A23187刺激的GA15细胞中菠萝蛋白酶引起IL-4 mRNA积累明显更低(n＝3，p＜0.05)。对上面所述的这种不同结果的一个可能的解释是：在GA15细胞中，菠萝蛋白酶处理抑制了直接由PMA+A23187刺激的信号途径，但能增加与细胞表面分子，如CD3e和CD28相联系的可选择的信号级联。

菠萝蛋白酶在小鼠体内的效应：

至此提供的资料表明菠萝蛋白酶对T细胞有多种影响(取决于所研究的细胞类型，有刺激效应和抑制效应)。我们已显示了对正常脾T细胞(主要是原始的或未激活的T细胞)和T细胞杂交瘤GA15(代表激活的T细胞)酪氨酸磷酸化的不同影响。另外，当细胞表面分子的配体用于刺激细胞时(即，抗-CD3e和抗-CD28 mAb)，菠萝蛋白酶处理增加了GA15中细胞因子mRNA积累，但在正常脾T细胞中细胞因子mRNA减少，尽管引起这些细胞中增生增加。

由于在体外培养的细胞间观察到了差异，我们接着研究了菠萝蛋白酶对未受损的动物T细胞功能的影响。研究了菠萝蛋白酶对在与绵羊红血细胞(SRBC)反应的T细胞依赖性抗性体内模型(Weir，Handbook 0fExpermental Immunology，1-4，4th edn，Blackwell ScientificPublications，Oxford，UK(1986))中已充分描述的T细胞激活的影响。该试验直接测量了用SRBC抗原免疫后产生的对SRBC有特异性的Ab的B细胞数(即，噬斑形成细胞(PFC))。该反应取决于SRBC特异性T细胞增生和细胞因子(特别是IL-4的生产)。

用盐水免疫的小鼠(对照)产生非常少的PFC，不管它们是用菠萝蛋白酶还是盐水(对照)预处理(图15)。这表明菠萝蛋白酶处理不引起PFC的自发生产。在用SRBC免疫的小鼠中，与对照动物相比施用菠萝蛋白酶引起PFC明显增加(n＝11，p＜0.05)(图15)。这一结果的一个可能的解释是菠萝蛋白酶处理引起SRBC特异性T细胞增生增加(与在用体外脾T细胞进行的实验中看见的增生增加相似，图10)，导致T细胞对B细胞产生SRBC-特异性Ab的辅助增强。然而，我们不能排除菠萝蛋白酶直接刺激B细胞或一些涉及抗体反应的其它细胞的可能性。不管涉及的到准确机制，该结果表明了菠萝蛋白酶作为佐剂的新应用。

讨论：

已报道菠萝蛋白酶抑制肠细胞中诸如环AMP、环GMP和Ca²⁺的各种次级信使的分泌效应。菠萝蛋白酶的作用机制尚不清楚，但认为其作用与细胞中环核苷酸的积累相近。

考虑到菠萝蛋白酶对肠细胞的影响，第二信使和蛋白质磷酸化在这些事件中所起的作用，我们研究了菠萝蛋白酶是否能抑制其它细胞中的信号转导系统。具体地说，我们检查了菠萝蛋白酶对肌醇途径和为细胞因子(IL-2，IL-4和IFN-γ)生产和T-细胞增生所需要的酪氨酸磷酸化的影响。我们假定，如果菠萝蛋白酶影响细胞中的信号转导，那么这种抑制就会伴随着T细胞不能产生细胞因子、主要自泌型生长因子和增生。

结果表明，当用佛波酯和钙离子载体及抗表面分子的抗体刺激时，菠萝蛋白酶能抑制或刺激蛋白质的酪氨酸磷酸化。我们鉴定的一个受影响的蛋白质推定为MAPK(分裂素激活的蛋白激酶)。一些观察结果支持我们推断的鉴定：

1)在用佛波酯和钙离子载体刺激T细胞时，MAPK变成磷酸化，且在T细胞受体与共同刺激分子连接时也磷酸化。

2)与42kda的文献值相对应的42kda蛋白质在用佛波酯和离子载体刺激GA15细胞时磷酸化。当用菠萝蛋白酶处理细胞时该蛋白质不磷酸化或磷酸化显著减少。

3)用特异性抗-MAPK抗体免疫印迹导致识别42kda蛋白质带。

4)免疫印迹显示菠萝蛋白酶引起42kda蛋白质电泳迁移率延迟，这是MAPK磷酸化的特征。

由于菠萝蛋白酶对酪氨酸磷酸化和MAPK的抑制效应，我们假定这种抑制可能与信号转导减少相联系。MAPK对IL-2生产较重要，因为它能磷酸化起动IL-2转录所需的其它蛋白质(如C-Jun)。因此，我们试验了菠萝蛋白酶抑制鼠脾T细胞IL-2生产的能力。令人感兴趣的是，用菠萝蛋白酶预处理的T细胞在用抗CD3e mAb和CD28 mAb刺激后产生的IL-2比仅用PBS预处理的T细胞明显较少。

菠萝蛋白酶作用的准确机制尚不了解。很可能是经过抑制酪氨酸激酶活性或经过刺激磷酸酶引起蛋白质脱磷酸化(例如激活CD45)来抑制酪氨酸磷酸化。

不论其作用机制如何，已报道蛋白质酪氨酸激酶活性的调控剂具有免疫抑制特性(June等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，87,7722-7726,1990)。已显示除莠霉素A抑制抗原受体-刺激的T细胞激活的早期生化事件并且与蛋白质酪氨酸激酶活性的抑制相关。然而，除莠霉素不能抑制佛波酯和离子载体的刺激效应。菠萝蛋白酶的效应与以前报道的除莠霉素A的效应的区别在于菠萝蛋白酶能抑制T细胞受体的刺激效应(在抗体连接实验中证实)和第二信使的效应(佛波酯和离子载体)。

菠萝蛋白酶具有不同于纳巴霉素的效应，后者也报道具有免疫抑制特性。与纳巴霉素不同，菠萝蛋白酶抑制MAP激酶的酪氨酸磷酸化(Chung等，Cell69，1227-1236，1992)。另一种免疫抑制剂环孢菌素A抑制钙调磷酸酯，也明显不同于菠萝蛋白酶的作用。

由于除莠霉素和纳巴霉素抑制蛋白质酪氨酸活性和信号转录的能力，建议将它们用作免疫抑制剂。在本试验中，菠萝蛋白酶显示出抑制T细胞的酪氨酸磷酸化，因此可推断菠萝蛋白酶也可具有作为免疫抑制剂的潜力。

除莠霉素A也显示出在许多细胞系中诱导分化，在一个例子中，与蛋白质酪氨酸激酶活性的抑制相关(Kondo等，J.Cell.Biol.，190，285-293，1989)。

上面讨论的结果表明了菠萝蛋白酶的许多潜在应用。菠萝蛋白酶影响T细胞中酪氨酸磷酸化方式的事实表明由这些信号机制引起的细胞事件可经过使用菠萝蛋白酶来操纵。另外，由于菠萝蛋白酶对不同哺乳动物细胞类型的不同效应以及在所有这些细胞酪氨酸磷酸化中的重要性，菠萝蛋白酶能调节在大范围细胞中由信号机制引发的细胞事件。

除了菠萝蛋白酶对酪氨酸磷酸化的影响外，我们发现菠萝蛋白酶处理T细胞能修饰细胞表面受体以增加与配体的结合。以前，认为菠萝蛋白酶仅经过裂解表面受体影响T细胞(Hale和Haynes，(1992)出处同上)。因此，我们相信我们已发现了另外两个机制(除了裂解细胞表面分子外)，菠萝蛋白酶以该机制影响T细胞(即：修饰酪氨酸磷酸化和修饰特异性细胞表面受体以增加与其生理学配体的结合)。

基于这些结果，相信菠萝蛋白酶可用于修饰下面的细胞过程：

修饰细胞因子的生产：

我们有了菠萝蛋白酶能刺激(图14)或抑制(图7，8和9)T细胞中细胞因子生产的直接证据。使用菠萝蛋白酶刺激细胞因子生产的潜在应用包括作为免疫受损个体或感染了寄生虫/病原体的患者的免疫增强剂和作为疫苗(其直接证据见图15)或化疗的佐剂。使用菠萝蛋白酶抑制细胞因子生产的潜在应用包括作为防止移植后组织排斥和防止自身免疫反应的免疫抑制剂。菠萝蛋白酶也可以具有作为防止毒性攻击的应用(个体的炎症性细胞因子生产是毒性攻击的重要原因)。包括MAP激酶的蛋白质的磷酸化据认为在毒性攻击中是重要的。已证实酪氨酸激酶抑制剂抑制体内脓毒休克(Novogrodsky等，Science，264：1319-1322(1994))。同样，菠萝蛋白酶可用于防止过敏反应。接触过敏原后细胞释放炎症性细胞因子和其它细胞产物，如组胺。导致细胞分泌炎症产物的信号传递级联涉及酪氨酸磷酸化。

刺激T细胞增生或分化：

我们有菠萝蛋白酶能刺激正常脾T细胞增生的直接证据(图10)。由于随着原始T细胞的增生，它能分化成特定类型的产细胞因子的细胞这一事实，我们相信菠萝蛋白酶也可以影响这一分化过程。使用菠萝蛋白酶刺激T细胞增生的潜在应用与增加细胞因子生产的应用一样。然而，除了增加可导致更多细胞能产细胞因子的T细胞增生外，还有更多的细胞提供细胞-细胞相互作用，它除了细胞因子生产外，还是免疫反应的关键成份。促进细胞分化的另一优势是在白血病或T细胞癌中，其中T细胞癌起因于未分化的T细胞群体增加(N.B.我们未期望菠萝蛋白酶能刺激异常T细胞的增生，因为在GA15细胞，(一种T细胞杂交瘤)中产生的资料证实菠萝蛋白酶抑制这些细胞的增生)。

防止T细胞死亡：

菠萝蛋白酶引起正常T细胞增生(图10)的一个可能的解释是它防止程序化的细胞死亡(细胞程序死亡)。细胞死亡的减少导致更多的细胞变得能掺入³H-TdR(用于测量增生)。细胞程序死亡是细胞受刺激破坏其自身的DNA并死亡的特定事件。在大多数免疫反应中，这是必须的事件(防止过多的细胞积累)。但在某些情况下也有免疫抑制后后，如在HIV感染和老化中(即：过多细胞死亡，剩余的细胞不足以抵抗感染)(Perandones等，J.Immunol.151：3521-3529(1993))。由于细胞程序死亡的起始依赖于特定的细胞信号事件，菠萝蛋白酶影响酪氨酸磷酸化(它可能涉及刺激或防止细胞程序死亡)的证据(图13a)也支持菠萝蛋白酶防止细胞程序死亡的可能应用。

防止寄生虫/病原菌在细胞中的侵入和存活：

寄生虫和病原菌的侵入及随后在细胞中存活取决于这些生物利用宿主细胞信号传递途径(Bliska等，Cell.73：903-920(1993))。具体地说，已证实沙门氏菌磷酸化MAP激酶，MAP激酶使细菌经巨噬细胞变成内谷体(Galan等，Nocture 357：588-589(1992))。然后细菌增生并破坏细胞。由于已表明菠萝蛋白酶修饰宿主信号传递途径(图13a)，特别是抑制(MAP激酶)酪氨酸磷酸化(图2)，因此我们相信菠萝蛋白酶的另一潜在应用是抑制寄生虫/病原菌侵入或其在细胞中的存活。

Claims (29)

1.菠萝蛋白酶在制备用于调节依赖于肌醇磷酸蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶的细胞内信号途径之试剂中的应用。

2.如权利要求1所要求的应用，其中信号途径依赖于肌醇磷酸。

3.如权利要求1或2中所要求的应用，其中该试剂调节控制细胞生长和增生的途径。

4.如权利要求3中所要求的在制备用于减少或防止细胞生产生长因子之试剂中的应用。

5.如权利要求4中所要求的在制备用于防止形成MAP激酶之试剂中的应用。

6.菠萝蛋白酶在用于治疗或控制由肌醇磷酸，蛋白激酶和/或蛋白磷酸酶介导的细胞内信号转导介导的疾病之试剂的制备中的应用。

7.菠萝蛋白酶在用于调节细胞因子生产的试剂之制备中的应用。

8.如权利要求7所要求的应用，其中的试剂刺激细胞因子生产。

9.如权利要求8所要求的应用，其中的试剂用作疫苗的免疫增强剂和/或佐剂。

10.权利要求7中所要求的应用，其中的试剂抑制细胞因子生产。

11.权利要求10中所要求的应用，其中的试剂是免疫抑制剂。

12.权利要求11中所要求的应用，其中的试剂用于防止或治疗组织排异，或防止自身免疫反应。

13.权利要求10中所要求的应用，其中的试剂用于防止或治疗毒性攻击。

14.菠萝蛋白酶在制备用于治疗或防止自身免疫疾病或受体产生的移植排异之试剂中的应用。

15.权利要求14中所要求的应用，其中自身免疫疾病是多处硬化或类风湿性关节炎。

16.菠萝蛋白酶在制备用于防止或治疗毒性攻击之试剂中的应用。

17.菠萝蛋白酶在制备用作疫苗佐剂的试剂中的应用。

18.菠萝蛋白酶在制备用于治疗癌症之试剂中的应用。

19.菠萝蛋白酶在制备用于防止或治疗过敏的试剂中的应用。

20.一种治疗或防止自身免疫疾病的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

21.一种治疗或防止移植排异的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

22.一种治疗或防止毒性攻击的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

23.一种诱导免疫刺激的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶和疫苗。

24.菠萝蛋白酶在制备防止细胞程序死亡之试剂中的应用。

25.一种防止细胞程序死亡的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

26.菠萝蛋白酶在制备用于抑制、防止或治疗寄生虫和/或病原菌感染的试剂中的应用。

27.一种抑制、防止或治疗寄生虫和/或病原菌感染的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

28.一种治疗癌症的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

29.一种防止或治疗过敏的方法，该方法包含给病人施用有效量的菠萝蛋白酶。

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