TW403654B

TW403654B - Medical use of bromelain

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Publication number: TW403654B
Application number: TW084106855A
Authority: TW
Inventors: Tracey Leahanne Mynott; Christian Engwerda
Original assignee: Cortecs Ltd
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-07-04
Publication date: 2000-09-01
Also published as: CN1151119A; EP0766565A1; FI965204A; WO1996000082A1; AU2749395A; NO965564L; KR970703784A; NO965564D0; GB9412711D0; IL114331A0; ZA955292B; CA2193654A1; JPH10502073A; FI965204A0

Description

403654 A7 B7 五、發明説明（/ ) (請先閲讀背面之注意事^^填寫本頁) 本發明與菠Μ蛋白酶於多種疾病和狀況的治療用途有闞，那些疾病是由细胞内的信號所介導的。尤其是，本發明與菠蘿蛋白酶於治療例如癌症和自身免疫疾病等的疾病和狀況的治療和作為免疫抑制W的用途有》。此外，菠蘿蛋白釀可Μ被用作為疫苗佐朗。菠»蛋白酶是植物 Broneliaceae的姐嫌中存在的蛋白水解酶的一個鐮稱。菠蘿蛋白藺是由風梨（ Ananas cobosus )的莖的各個部分產生的一種混合物。它至少包含二種蛋白水解酶*也包含非蛋白水解性的_類，包括酸性磷酸和過氧化酶；它也可能包含澱粉酶和纖維素酶的活性。除此之外，也存在有各種其他的成分。菠鼸蛋白酶在K前已經被用於治療多種病況，包括發炎和尤其是腹瀉的治療。菠蘿蛋白釀於治療有傳染性的腹瀉的治療使用巳於W0 — A- 9 3 0 1 8 0 0中有說明。其中主張菠籮蛋白藺的作用在於Μ蛋白水解作用破壞腸内對病原體的受體。而W0 — Α- 880 1 5 0 6的主張是菠«蛋白釀把病原«從腸内受體處脫鐮。經濟部中央標準局負工消费合作社印製目前已發現，除了對於有傳染性的腹瀉•菠驩蛋白醸對於治療非有傳染性的腹瀉也是有用的。當然，埴項作用不是能夠由W0 — Α— 9 3 0 1 8 0 0中所主張的作用檐制所解釋的。

Taussig e t a 1 ，Taussig e t a 1 ，P 1 ant a Medica ，1985 ， 538 - 539 和 Maurer et al ， Planta Medica 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 403654 五、發明説明（l) ，1 988 · 3 7 7 - 38 1兩者均主張菠蘿蛋白醣是可以用於抑制腫痗生長的，而且Taussig et al把埴項作用歸因於菠蘿蛋白酾的一種成分或多種成分中有過氧化酶活性。但是他們沒有產生檐制作出其他的解釋。然而， Maurer et al主張菠蘿蛋白酶是能夠誘發白血症细胞株的分化，而這種能力由蛋白水解活性所產生的。這樣再一次表明，菠蘿蛋白酶作用的櫬制是不易瞭解的。菠籮蛋白酶於治療其他狀況，例如發炎，也是不能得到令人滿意的解釋。在W0 — A- 9400147中，各種實驗都顯示蛋白水解酶，尤其是菠»蛋白酶•是有能力抑制分泌的。那些應用也揭示了菠驩蛋白酶能減少毒素的结合活性，而且能抑制毒索所引起的分泌效應，瑄些毒素例如是不附热的毒素（ LT)和霍亂毒素（CT )和也包括例如酎熱的毒素（ST )的毒素。事實上，一般認為ST 的作用撗式與 LT和CT 的作用棋式是非常不同的。這些觀察可Μ被一個事實所解鞸，就是菠蘿蛋白酶混合物的一個成分，莖部菠籮蛋白酿蛋白酶類*似乎是有能力調控循環的核苷酸的代謝途徑。除此之外，菠蘿蛋白酶也已經被發現具有抑制由鈣（Ca2 + )-依賴性途徑所引起的分泌作用。 LT和ST兩者都是由大腸桿菌的腸道毒性菌種（ETEC)所產生的。有一些 ETEC菌種也會產生鞭毛黏附蛋白，被稱為群落化作用因子抗原。這些黏附蛋白可Μ促進 ETEC菌種於附著小腸的黏膜之上，從而促進群落化作用和腸毒素 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨OX297公釐）請先閣讀背面之注頁訂經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 403654 37 —— __ _ ..._______ 五、發明説明（々）的遞送作用。腹瀉疾病的情況最後是依賴於腸毒素的生產和有效率的遞送。那些滕毒素通過信號途徑的活化作用而剌激细胞的分泌。在细胞裡面的内在信號是由”第二信使”所攤帶。人體中的每個细胞不斯地被來自環境的各種信號所衝擊。正常的细胞收到並且處理逭些信號，這些信號可能促進生長，分化或死亡或控制细胞其他的功能，例如是腸的上皮细胞分泌液«。因此，逭些信號是了解這些決定细胞命運和在细胞中進行的遇程的闞鍵。信號的接收是通過细胞表面具有不同生物化學的活性的受體，而且细胞會把逭些信號傳遞至反應蛋白質去。這些蛋白質又處理瑄些信號和轉導他們到位於细胞裡面的其他分子。瑄一壤串的生物化學反應是在细胞與生長因子之間的反應之後和在發生细胞反應之前進行的。埴個通種被稱為信號轉導作用。經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 大多數的细胞信號的傳送是經由：GTP — 结合蛋白霣，各種蛋白激酶，蛋白磷酸化酶，修飾胞類的_ •和例如是Ca2 +和瑁腺苷單磷酸（環化AMP或cAMP)等的第二信使。埴些指令最後會在细胞核中的轉錄因子所解釋，那些轉錄因子會啟動细胞的蛋白質的基因表達和其後的拥譯作用。至少有三種信號傳通途徑是對分泌作用是重要的。其中一條途徑採用第二信使，即環化AMP。另一個途徑是使用第二信使環化烏嘌呤單膦酸（環化GMP或CGMP )。埴二 -5- 本紙张尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Α7 Β7 403654 i、發明説明（屮）個信使被稱為環化核苷酸。至於第三僩途徑用來傅遞信虢的是（Ca2 + -依頼性途徑），它是需要Ca2 +作為第二信使。W0 — A — 9400 1 47 主張莖部菠》蛋白藺蛋白的醣類是有能力的避免腹瀉的，方法干擾環化核苷酸和Caz +—依賴性途徑•從而影響分泌作用。本發明人現在已經研究並且得知有其他的细胞內信號途徑*而且有令人驚訝的發現，就是除了環化核苷酸途徑，菠蘿蛋白酶也會影響到其他细胞內的信息途徑•特別是被肌酵磷酸鹽，蛋白霣激蘭和/或蛋白質璘酸酶所諝控的途徑。因此，本發明的第一重點是提供菠蘿蛋白醑作為细胞內調控信息途徑的製劑，該细胞內的調控信息途徑是依賴肌酵磷酸》，蛋白質激酶和/或蛋白質的磷酸藺的作用的 Ο 在本發明的内容，肌酵磷酸鼸是指任何的磷酸化肌酵分子，不管其磷酸化的程度或磷酸鹽基團的位置。肌酵磷酸》的例子包括磷脂釀基一4,5 —雙磷酸（PIP2 )和肌醇一1,4,5 -三磷酸（IP3 )。蛋白質激酶和蛋白質磷酸藺是指任何具有把無活性的蛋白質形式藉著加入或除去瞵酸分子而轉變成有活性的形式的分子。已經研究到的是，菠驩蛋白酶對控制依賴肌酵璘酸鹽，蛋白質的激或蛋白質磷酸化酶的信息途徑是特別有用的。這些信息途徑可Μ導致產生一些非突觸细胞外的信息分本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項#'填寫本頁) 訂經濟部中央棣準局貝工消費合作社印製 J0S6S4_^__ 五、發明説明（；）子，例如後絜加懕素和凝血素，及尤其是影響细胞的生長和增殖的信息分子*例如白介素（interleukins)和其他的生長因子。經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項¥填寫本頁) 為了生長或埔殖，正常的细胞需要一些信號，疽些信號是由其他的细胞所產生的生長因子所提供的，那些其他细胞是位於附近或身臞的其他部份。逭與癌细胞自主的行為成一對比，癌细胞主要是由它們自已内生產生的信虢所主宰的。參與细胞的生長控制可Μ被突變作用增強或修，埴些突變可以改變蛋白霣的结構或生產異常大量的正常蛋白霣。因此，在癌细胞中，接收和處理信誠的细胞器變成有缺陷，而且细胞不能適當地處理和對這些信號作出反應。具有缺陷的生長抑制性信號例如是那些由有缺陷的腫瘤抑制基因所產生的信號，是不能對生長剌激性信«產生平衡作用。因為瑄些缺陷•在信息级W通程中是不會傳遞瑄些生長抑制信號的，而且细胞不能夠抑剌它們自己的增殖。在失去腫痼抑制基因活性的時候，癌症便會產生。同樣地，细胞接收到由於剌激信號途徑缺陷所產生的Mlft剌激信號時，便舍表現過度增殖。致癌基因是那些能夠產生使改變功能的蛋白霣的基因，而它們活化後會使细胞產生強力和不停的增殖信號。致癌基因可Μ跛壞那正常時對细胞增殖小心霣翼的平衡分子控制機制，致使產生惡性的细胞生長。蛋白質胳胺酸磷酸化醣，例如是 ν — src和相醐的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公嫠） 403654 a7 _B7__ 五、發明説明（合） v — abl蛋白霣，已經證明是在實驗性和人類癌症中最認為有W的蛋白質之一。c 一 src是一種激酶，已知可Μ在正常的细胞和被其他激釀所譎節的细胞中找到。在癌细胞中， ν — src的調節作用已經喪失。由於在c- src 和 ν — src蛋白質之間有數個胺基酸的差異，v - src 激酶是持鑛活性過高。瑄些突變蛋白質賂胺酸釀的活性並無抑制，可Μ對细胞生長的控制構成有害影響。包含c-src的正常细胞只將會在有生長因子剌激的情況下才埴搛做 ;癌细胞•其中包含v — src ，顧示出經由外部供應的生長因子已取得獨立性•闻時，再不對外部的生長抑制信號作出反應。因此，產生了癌症和腫癯的结果。經濟部中央標準局貝工消费合作社印製蛋白質路胺酸璘酸化作用的级馨反應（或激酶級聯反應）對所有信虢轉導作用中各偁調節反應都扮演重要的角色。許多生長因子的受賵具有胳胺酸激醣活性，而且，當被活化的時候，其會觸發多细胞的蛋白質及賂胺酸殘基的磷酸化作用。這些辚酸化作用通程的结果是引起目檷蛋白質獲到或喪失一些功能。P21c - ras在介導從受*賂胺酸磷酸化酶接收的促细胞分裂和分化信號的遇程中扮演重要的角色（Wood et al . * Cell, 68 ，1 0 4 1 — 1 0 50 ， 1992 ; Thomas et al · ， Cell, 68 ， 1031 - 1040 ， 1 9 9 2 )，使磷酸化醣活化•瑄些磷酸化醸包括蛋白質激醣 C ( PKC ) Raf ，细胞分裂素—活化的蛋白霣（MAP)，和 S6 激醏族（Cantley et al . ，Cell，64 ， 281 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 A7 B7 五、發明説明（1 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 —302,1991 )中的一些成員。埴些磷酸化酶能整合來自多種膜受《的信號。信息途徑中的主要元素把受«啟始信號轉導到细胞核。逭儸主要元素目前巳知為细胞分裂素一活化的蛋白質激酶（MAPk )類。HAPk是絲胺酸/蘇胺醸磷酸化酶，其可 Μ在细胞內被多種生長因子和的腫瘤促進子活化。逭些磷酸化酶中，研究成果最多的是Ρ42ΜΑΡΚ和 Ρ44ΜΑΡΚ (亦分別稱為 ERK2 和 ERK1 ，pp42^apk / erk2 和 pp44*apk / erkl/ Bpk ，亦已知為與微管職合的蛋白質激蘭；_ 鞘脂的蛋白質（MBP )激酶；和RSK I和I I )。 MAP激蘭的基質包括PP9 0和70Srsk磷酸化激酶和幾種轉錄因子，特別是Jun ( Pulvereretal ·， Nature · 353 ， 670 — 674 ， 1991 ) ， Myc 和 P62TCF 。那些影響轉錄活性的蛋白質是在癌化過程中廣為人知的。 MAP磷酸化_活化的櫬制是非常複雑的。M APk的存在於休止细胞形式是去磷酸化形式，當胳胺酸和蘇胺酸殘基被磷酸化的時候會被活化（Boulton et al * ，C e 1 1 ，65 ，663 — 675 ，1991)。在體外，瑄個活化作用幾乎能夠完全地倒逆過來*只要任一殘基被去磷酸化（ Anderson et a 1 · «Nature* 3 4 3 ，6 5 1 - 6 5 3 • 1990 )。根據*近的報告》PAC1是可M抑制MAP激藺所讕節的報告基因表達（Ward et al · ，Natu 請先閲面之注項. t 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654_B7_ 五、發明説明（s ) r e · 3 6 7 ： 6 5 1 - 6 5 3 ( 1994 )。當 MAP 澂藺的賂胺酸和蘇胺酸讕節部位的磷酸化作用均是被一個具有二元特異性的MAP激酶的激酶（MKK或MEK)所介専的。MEK 於是被ΜΑ P激釀的激酶進行的磷酸化作用所調節 •該M A P激蘭的激酾包括致前癌基因產物 Raf (

Anderson et a 1 · ，Biochea · J · ，2 7 7 ，5 7 3 - 576 ，1991 )，而HEKK則被蛋白霣激醣C ( PKC )所調節 Ο 本發明人現在已經發現菠«蛋白醣具有能力干擾對生長作用重要的信息途徑•特別是能引致產生例如 IL _2 、血小板衍生生長因子（PDGF )和類胰鳥素生長因子（ IGF )等的生長因子的信息途徑。經濟部中央標隼局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) T -淋巴细胞可Μ用來作為顯示促進细胞生長機制棋式的一儒细胞棋型。Τ -淋巴细胞的生長是由生長因子的產生、受艚功能，细胞質的信號處理和细胞核内基因反應所調節的。因為這些钿胞容易取得，而且介白素2 (IL 一2)和生長增殖所需的Τ _细胞生長因子的作用有詳细的資料* Τ-淋巴细胞一般使用作為增殖的棋型。 Τ 一细胞生長因子和其他類型的细胞•都需要剌激，使增殖所需的一連串的反應得到啟動。包含數十值計的白血球或淋巴细胞的免疫糸統可Κ分為甬大類：Β淋巴细胞和 Τ淋巴细胞。Β—细胞的作用可以保護宿主免受细胞外病原體的破壤，而Τ 一细胞的作用可Μ保護宿主免受细胞内病 -10- 本紙張尺度適用中國圃家標準（CNS > 格（210X297公釐） A7 _B7_ 五、發明説明（3 ) 原體的破壞。分別使用B—细胞受體（BCR )和T -细胞受《 ( TCR )可以辨別B—细胞和 T 一细胞上不同抗原的不同形式。 T细胞的活化是一個複雜的逢程，其需要蛋白質胳胺酸激活性產生细胞生長和分化作用。活化的作用獬要TC R和T 细胞表面的其他分子與抗原细胞之間的交互作用而辨識到抗原。當T 细胞遇到適當的抗原和次生的共同剌激性信《的時候，T 一细胞會Μ兩種主要的方式作出反應。其一是增大和分裂•從而使细胞數目蝤加Κ應付抗原。另一方法是分泌淋巴因子或姐嫌介素，一些蛋白質Μ直接抑制病原«或使其他的细胞也參與免疫反應。姐雄介素介白素2 ( interleukin 2 ，籣稱IL - 2 )是Τ细胞生長因子，它在調節免疫反應的作用中扮演闞鐽性的角色。經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 (讀先閲讀背面之注意事1填寫本頁) 休止 T —细胞不能夠正常地對IL 一 2作出反應，因為埴些细胞不能在它們的细胞表面表達產生可檢澜水平的高親和力IL 一 2受體。誘發高親和力IL — 2受«的表達是需要抗原剌激的，因而對I L_2產生反應。因此，由T细胞受體（TCR) Μ及輔助剌激信號所提供的起始激活信號通過產生IL_2和表達IL一2受體而啟動了 T细胞活化作用◊後鑛的T细胞it殖作用是由I L 一 2 與其IL-2受體之間的相互作用而驅動的。如果T细胞只接收到TCR的信號· T细胞會變成無變應性或死亡（稱為凋亡）。如果T细胞只接收到輔肋剌激信號，則T细本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 五、發明説明（β) 胞會保持靜止狀態（或不作出反應）。所有上述的事件皆痛要賂胺酸磷酸化作用，因為萑白霣賂胺酸激酶的抑制劑能夠抑制大部份（如果不是全部）與T C R剌激有關的後饋反應（Mustelin et al .,

Science, 247, 1584-1587, 1990; June et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 8 7, 7 7 2 2 - 7 7 2 6 , 1 9 9 0 ) 。TCR 介導的蛋白質賂胺酸活性的誘發會使包括TCR z e t a 鐽的許多细胞蛋白質產生賂胺酸磷酸化作用（ Baniyash et al., J. Biol. Chen., 263, 18225-18230, 1988)，磷脂酶 C gl (PLCgl) ( Weiss et a 1 . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5484-5488 , 19 91) » CD 5 (Davis e t al., Proc. Natl. Acad.

Sci . USA, 89 , 6 3 68- 6 37 2 , 1 992)，原致癌基因 vav (Bustelo 和 Barbacid， Science, 256, 1196-1199, 1 9 9 2 ),含 valosin 蛋白霣（VCP) ，ezrin(Egerton et al ·， EMBO J . , 11， 3533-3540 和 J. Ι··ιιιιο1·, 149, 1847-1852， 1992) ZAP-70 (Chan et al.， Cell, 71, 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項务填寫本頁) 6 4 9 - 6 6 2 , 1 9 9 2 )和 MAPk ( Ne 1 et ' a 1 . , J · I ·ιιιηο 1., 1 4 4, 2 683- 2 689 , 1 9 9 0 ) 〇

P LC g 1的胳胺酸磷酸化作用可M產生催化活化作用，從而產生磷脂鼸基肌酵（PI )途搜中的第二信使。 PLC切断磷脂醯基肌酵4,5 —雙磷酸（PIP2 )，產生肌酵 1，4,5 —三磷酸（IP3 )和1 , 2 -二醣甘油（DAG -12- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠） A7 B7 403654 五、發明説明（ο ) 請先閲讀背 Λ 之注意事 % )。這些分子然後用作细胞内的第二信使，誘發Ca2 +的增加和PKC的活化作用。在PKC活化作用之後•原致癌基因 Ras 被活化，Raf - 1 激酶的活性《加，而且 MAPk 被磷酸化。MAPk 活化引起原致癌基因c-fos與 c-jun形成二聚物，因而形成轉錄複合物AP-1。逭個AP-1複合物與DNA上的物霣结合啟動I L — 2的轉錄作用。圖1籣要說明與PI途徑的TCR活化作用有圔的反應，瑄傾途徑會導致I L_2基因轉錄和I L 一 2的產生菠蘿蛋白已知為具有抑制激酶级脚反應的能力，而該激酶级聯反應是與生長剌激作用有闞的。在瑄俪信虢途徑中的因子是r· a s蛋白質，在人類腫瘠中有25%到30 %可以找到其異常形式的蛋白質。菠蘿蛋白酶是能夠阻斷包括MAP激_的蛋白質的賂胺酸磷酸化作用的。經濟部中央標準局員工消费合作社印製由於它有能力阻庸ΜΑ P澂》和其他蛋白霣的賂胺酸磷酸化作用，菠蘿蛋白醏是可K作為抗癌_。埴是因為它能夠阻斷一些生長因子通度生產•瑄些生長因例如是成雄維母细胞和上皮细胞的血小板衍生生長因子（PGDF) 和上皮生長因子（EGF)。除此之外，因為它有能力阻止T细胞的增殖，它也可 Μ作為免疫抑制劑，從而避免移植器官被宿主排斥，或作為自身免疫疾病的治療物質，瑄些自身免疫疾病例如耱尿病，多發性硬化和類風濕性Μ節炎。這俚發現與W0 - Α - 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） A7 B7

Afla654 五、發明説明（ 9301800中的說明成強烈的對比，其中提及含有如菠驩蛋白酶的蛋白釀類的組成物是具有非特異性的免疫剌激劑的活性。我們已經發現疲籮蛋白酶事實上是能夠用來激或抑制組鏃介素的製造，視乎我們是否把它用於處理活化的细胞 (例如那些巳經接收剌激信號的细胞）或抑制（靜止的或休息）细胞。它因此可Μ是用作為免疫抑制謂*例如防止產生組孅排斥作用，或免疫剌激劑*例如疫苗的佐嫌。菠蘿蛋白酶也可以用來防止或治療中毒性休克，方法是利用其能夠抑制組纗介素的製造和酪胺酸磷酸化作用。菠蘿蛋白酾也能夠來治療過敏症。如上面已經討論遇的，菠«蛋白釀是各種成分的一種混合物。雖然在WO -Α- 94 00 147中已有說明莖菠蕹蛋白酶是負貴介導環化核苷酸途徑的菠蘿蛋白酶的成分*但是仍不清楚莖菠蘿蛋白醣是否在激藺途徑發生作用的菠篇蛋白酶，抑或是菠蘿蛋白藺混合物的一些其他成份才有此作用0 然而，埴並不影響本發明的實施，因為本發明的粗製菠鏈蛋白酶混合物是能夠影響MAP激酶的磷酸化作用（或活化作用）的。菠蘿蛋白醣的投藥方式可K有多種，包括經腸道，例如口胆，典的，頰的，或肛門等方式的投藥。或是非經腸的投蕖方式，例如是靜脈內*肌肉内或腹腔內注射等方式本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS > Α4規格（210Χ2.97公釐）請先閲讀背 A 之注旁訂經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 4036S4 at __B7_ 五、發明説明（Ο ) 。然而，口服途徑是較缠合的。當進行口服投藥的時候，為了要使菠蘿蛋白酶經邊胄部能夠保持活性，較佳的是把該醣製成經腸道保謂製劑。其他口服的配方包括糖漿，醮劑，和硬的和软的明膠囊，埴些也可以是有腸塗雇的。菠蘿蛋白酶活性在一宽的酸鐮值範醒（pH 2-9 )内是穩定的。因此*可K不需要有腸保護（或腸塗曆）達到保護處於酸性瓖境的菠«蛋白醸。然而，也可Μ對其進行保護，Μ免其被酸蛋白酶消化（酶解）。菠蘿蛋白酶可以因此與埋衝劑一起進行投藥*該鍰衡劑例如是碳酸氫鹽。菠蘿蛋白®的劑量一般是MRorer 單位，FIP單位， BTU (菠蘿蛋白酶賂胺酸軍位）· CDU (賂蛋白消化單位 )* GDU (明膠消化單位）或MCU (乳凝结單位）等進行測量。其他Rorer單位的蛋白酶類活性的定義是能夠在酸鹼值 7和25 t的條件下把胳蛋白基質水解，使其每分鐘在 280nm的吸光率增加0.00001 。一個FIP軍位的菠蘿經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注^^項私填寫本頁) 蛋白醣活性是指一檷準製劑的數最，此數量的酶能夠在標準的狀況之下Μ起始速率水解缠當的賂蛋白（控制FIP ) ，其並不會被指定的蛋白質的沈澱試劑沈灘出來，其能產生與liumole賂胺酸在 275nm 相同的吸光率。BTUs • CDUs ，GDUs和MCUs的定義在文獻中有說明，如下所述 -15- ^紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐) 五、發明説明（ d· A7 B7

BTU 一菠籮蛋白釀賂胺酸單位是指某數ft的酶能Μ每分鐘釋出 1 wmo I的賂胺酸的數量，測定的條件是一定的（例如，於PH5和30Ό下經酸變性失活的血紅素基質的醣解之後）。

CDU 是指一定數量的藺，其能在371C和p H7的條件下把摞準的賂蛋白基質進行酶解，並每分嬗釋出1 /imo 1的賂胺酸。

GDU 請先閱之注 %真1: 填寫本頁訂經濟部中央標準局員工消費合作社印袈指一定的藺活性*其能在 45t：和ρΗ4·5的條件下對禰準的明謬溶液進行 20分鐘的酶解之後•釋出1 w g ( 的胺氮數量。 1100 BTU / 克=750 CDU / 毫克=1 200 GDU / 克精確的劑量將會是由翳師或臨床醫豳所決定和控制· 但是可Μ發琨適當的劑量是由 50到4000 GDU /天，例 _ 1 6 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4規格（210Χ 297公釐） 403651五、發明説明（I?) A7 B7 如 100到 1000 GDU/天。每日的繭悬可以一次或多次（例如每天兩次，三次或四次）給予。一個特別的較癦合的劑量將是 10mg /公斤（給予70〇Bg 的劑霣相當於給予一般的成人 2 8 0 0 BTU )。本發明現在Μ下面的實施例進一步說明。各實施例會提及一些附園，其中：是舉例說明那些T -磷脂»基肌酵（PI )途徑的细胞受體活化作用有闞的反應，其會導致 IL— 2基因轉錄作用和IL 一 2的產生。 _ 請先聞讀背 Λ 之注經濟部中央標準局貝工消費合作社印製免疫浸潰試驗，用來檢拥在T细胞雜交瘤GA 1 5中的蛋白質是否存在有MAP激酶。在試驗中，GA 15 經通任何鈣離子載體或PMA 或離子載體與PMA的姐合或MPB S處理（控制組）進行剌激。细胞可以經過菠Μ蛋白酶或 P B S處理。画 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） 403654 A7 B7 五、發明説明（免疫浸潰試驗，用來檢測是否有ΜΑ P激酶存在。在試驗中•從GA15 得到的蛋白霣經過鈣雕子載體或PMA 或離子載體與PMA的姐合或以PBS處理（無剌激性的控制組）進行剌激。搛本可K經過菠蘿蛋白酶或PBS處理。於 —定時距内拥試ΜΑ P激酶的活性。表示於受菠蘿蛋白醣或 PBS剌激的T 一细胞所產生 MAP激酶的活性。 _ 免疫浸漬試驗，其顯示一 MMAPk (Erk 1)中高度保守序列的肽所產生的多克隆抗體能夠辨認Mr 4 2 0 0 0 和 4 4 0 0 0兩種的蛋白霣。經濟部中央橾準局wc工消费合作社印製 IBH 國以M APk抗體進行免疫浸瀆試驗，其顯示蛋白霣的磷酸化作用在經菠蘿蛋白酶處理的细胞中部份地被阻撕之後產生電泳移動率的改變。 18- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 五、發明説明（、Ί ) 画 A7 B7 表示菠》蛋白酶處理對IL 一 2 ，IL — 4和IFN — 7 mRNA於體外GA15细胞的累積。GA15细胞以菠驩蛋白酶«理*在KPMA ( 20 ng /奄升）和鈣離子載體 A2 3 1 87 ( 5 0 0 ng /毫升）剌激的時候，樓聚比較少的

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4和 I FN

m R N A 請先閱面之注意事 ί

L 圓顏示脾臓的 τ -细胞Μ菠騙蛋白鼸處理，在以2C11 (aCD3e )和 CD28 ( aCD28 )剌激時會產生比較少的 IL - 2 ° 圈表示S»蛋白酶處理對IL 一 2 ，IL 一 4和7 — INF mRNA於體外脾臓T -细胞中的累積。Μ菠蘿蛋白酶處理的牌臓的Τ 一细胞，在Μ固定化抗CD3e (4//g /ml)和可溶性抗CD—28 (10«g/ml)軍株抗β剌激時，會積聚比較少的 IL 一 2 ， IL_ 4和 I FN - 7 m R N A ° 19 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS > A4規格（210x297公釐）訂經濟部中央標準局貝工消费合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β) _ 10 : 顧示菠》蛋白醻的處理並以固定化抗CD3e ( 4 U g/ml)和可溶性抗CD-28 (10ws/ml)軍株抗《剌激時，會埔加脾臟T_细胞的壜殖。豳 1 1 a 和 1 1 b : 顧示菠軀蛋白酶處理會增加抗CD3e (a)和抗一 CD28 (b)軍株抗«與牌臓的T 细胞表面结合，逭可以由FACS對FACS的分佈曲媒向右移得知。 12：顯示菠驩蛋白酶增加抗CD 3 e軍株抗體與GA15细胞表面结合。圈 13a和 b : 表示脾臓的T -细胞中的賂胺酸璘酸化蛋白質的免疫浸潰試驗。園 13a顯示菠蘿蛋白醸處理會誘發對5 6和 58 kDa蛋白質進行蛋白霣路胺酸磷酸化作用。_ 13b顯示菠蘿蛋白酾處理會抑制16 lsDa蛋白質的蛋白霣賂胺酸磷 -20- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------1/^-- (請先閱讀背面之注意事I填寫本頁) -訂 A7 B7_ 五、發明説明（β) 酸化作用。圏14 : 表示菠«棗白酶處理對1L 一 2 ，IL 一 4和IFN — 7 mRNA於髖外GA15细胞中累積的影響。篇蛋白蘼處理的脾臓的细胞，在以固定化抗CD3e (4w s/ml)和可溶性抗00—28 (10#g/ml)單株抗體剌激時，會積聚更多的 IL 一 2 ， IL 一 4和 IFN - 7 m R N A ° 臞 15 : 表示菠蘿蛋白酶對羊紅的血球（SRBC )於饈内抗SS 反應的影響。被疲驩蛋白酶處理的小鼠會有比較多的B细胞，並產生抗SRBC的抗體。材料和方法细胞株

ThO细胞雜交瘤GA15 被用於研究賂胺酸磷酸化作用的實驗。GA15是由胸腺® BW5147與Th2克隆F4融合而產生的，其對KLH與I— Ab有特異性（Int .Iiaunol ·， -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）請先閲 is 之注項訂經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 <03654 ^—一：•、發明説明（ A7 B7 5 ，323 — 330 ，1993 )。把细胞組嫌培養液（TCM) 中培養，其中含有由 RPMI 1640培着液（Biofluids · Rockville . MD )輔 M10%胎牛血清（ Inovar Biologicals, G a i t h e r s b u r g ，M D ) ，5 0 ·Μ 2 -氳疏基乙酵，4·Μ毅胺醣酸，和50 Ug/奄升良他徽素。動物請先閱讀背 * 之注 t-i 旁研究菠蘿蛋白酶預處理對分離鼠類脾臓的T 细胞產生 IL - 2的影響。雄性的 C57BL/ 6NCrlBR小鼠是由直爾斯河實驗室躏得的（Wilmington ，MA，USA)。使用年青的小鼠（3 到4個月大）和老化的小鼠（20到26 個月大）於成對實驗。有腫窗、可見皮虜損害♦或明顯的疾病的小鼠是不會用作實驗的。在研究IL-2、IL - 4和 IFN - 7 m R N A累積的實驗研究中是使用雌性的 Balb / c小鼠，其是購自 A. Tuck and Sons Ltd (英圔）公司。使用的小鼠年龄是在6至10個星期之間。促效作用劑大戟二帖酸酯的结構是與 1，2 —二黼甘油（DAG ) 相W，因此會引起 PKC的活化作用，從而誘發Raf _ 1 的過度嫌酸化作用（Morrison e t al · * Proc .Natl -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

iT 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 403651 五、發明説明（d ) .Acad . sc i .USA* 85 ，885 5 - 8859 ，1 988 )，亦可 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) M 使 MAP 激酶活化（Chung et al ·，Mol. Cell. Biol .’ll ，1868 — 1874 ，1991)。離子載髓壜加细胞内的细胞質游離鈣*那些游離鈣會與鈣調素和PKC結合。在賂胺酸璘酸化作用實驗中，使用大戟二帖酸簾1 2 和肉豆蔻酸醮1 3 -乙酸（PMA)和鈣離子載« A23187 來剌激细胞。大戟二帖酸_離子載體處理T _淋巴细胞會協同地棋擬到第二信使二醢甘油（DAG )和肌酵1，4,5 一三磷酸（IP3 )的作用，因此簠現產生TCR剌激的許多特激（ Truneh et a 1 · N a t u r e ，313 ，318 — 3 2 0 ，1 98 5 )，例如IL 一 2分泌，IL - 2受鱷表逹，和T细胞增殖等。小鼠脾臓的Τ 一细胞的分離 Μ頸椎脫位方法殺死動物，並Μ無菌方式取出脾臓。

於培養液中製備單细胞懸浮液，培養液中含有由 RPMI 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 1 64 0 所組成（GIBC0 實驗室，Grand Island · ΝΥ)和輔 Μ 1 〇 % 熱失活的胎牛血清（FCS)(GIBC0實驗室）和2 M的L -毅胺醣酸，5 xlO-5 Μ的2-ΜΕ，和抗生素（50奄克/毫升良他徽素和10 U /毫升青撇素）。在 5 xl〇7淋巴细胞/毫升中把紅血球在溶解媛衡液（ 140 ·Μ ΝΗ4 C1 ，17 nM Tris，酸鐮值為 7.2 )中溶解。 -23- 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ~ 403^54 五、發明説明（θ) 溶解作用是Μ加入TCM 終止，並把Τ 细胞置於附觴棉（ Polysciences ，Warrington ，ΡΑ)中於 3 7 "C下培育 1 小時（Julius et al ，，Eur .J .Immunol .3 : 645 ( 1973 ))使其純化。把T细胞於流出液中收集· M流式细胞計量技術拥定*其中含有>90% Thy_l+和 < 5 96 MHC 類 11+ 细胞。對於測董小鼠T —细胞的IL — 2生產，使用了單株抗體（BAb )作為促效作用劑模擬在T的表面發生的细胞和抗原送示细胞之間的分子交互作用。軍株抗體2C11 (抗 CD3e鏈）被用於與TCR受體交《，和棋擬的抗原肽/主要組嫌相容性（MHC)剌激作用的同效作用。利用抗CD28單株抗體（27 · 5 1)經遇CD28分子提供了一個輔助剌激信號。CD28與抗體連结和TCR 的交聯作用已被顯示可以啟動一些特異性的信號轉専反應，而產生IL一2和T细胞增殖。其他的試劑經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 試劑是從下示的来源處購得：羊血细胞（S R BC) 從 TCS Biologicals ( Buckingham ，英國）；抗—C D3e —鍵軍株抗體（145 — 2C11)從 Phaningen ( San Diego · CA );抗 CD28 «Ab ( PV —1 )和多株地鼠 Ig6 (控制姐地鼠IgG )是從C. _ 2 4 _ 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Οχ297公釐） 403654_五、發明説明（乃） A7 B7

Jun博士（（ NMRI ， Bethesda * MD);山羊抗地鼠 IgG Ab ，大戟二粘酸豳1 2 —肉豆蔻酸_一 1 3 —乙酸（ PMA)，鈣離子載體 A2 3 1 87 全部是由 Sig«a ( Dorset ，英國）購得；小鼠抗磷酸賂胺酸軍株抗體（4G 1 0 )是從 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) _得；山羊抗小鼠IgG Ab與辣根邊氧化酶的结合物是由 Southern Biotechnology Associates (Biraingha·, AL) 處購得；山羊抗地鼠 IgG Ab與费光素異疏氰酸酿（ FITC )的结合物是由 Cappel ( Durha·，HC)購得； RNAzol B是由 Cinna / Biotecx實驗室（休斯頓，TX )取得；RNAguard， dNTP 兩者部是從由 Pharmacia Biotech ( St Albans · H e r t s )購得；MM L V -反轉錄醣，鼸櫬引物兩者都是從 GIBCO BRL ( Gaithersberg · MD )購得；Biotaq聚合酶是從Bioline (倫敦，英國）取得；粗製菠《蛋白酶萃取物（E .C. 3.4.22.4)(批次號 TAD8TK1125 )是從 Miles Scientific ( Elkhart » IN)處購得。請先閱之注 ί if 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 6A15细胞處理和剌激在璘蛋白實驗中，GA15 ( 1 X 106细胞）在第二信使剌激之前K菠篇蛋白酶（15 « g /毫升或50 « g / 毫升•於磷酸邇生理嫒衡液中稀釋，酸鐮值7.4)預處理 -25- 本紙張尺度適用中國國家揲準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654__^_ 五、發明説明（χψ) 3 0分鐘。然後把细胞Μ重禊離心沉濉（1500轉/每分， Sorval 1 RT 6 0 0 0 Β冷凍離心機；DuPont )濟洗兩次，並於RPMI中和再製成懸浮液。控制組细胞是只KPBS液處理過的。细胞經通剌激不同的時間，使用鈣離子載《 ( 1 u Μ )，PMA ( 1〇 ng/奄升）或雛子載髓與ΡΜΑ —起。在剌激之後，那些细胞被溶解，並進行拥定胳胺酸磷酸化蛋白質*程序如下面所述。脾臓Τ一细胞中IL一2生產的澜量在测量IL一2生產量的試驗中，把鼠的脾臓Τ 细胞於96井穴的平底撤滴定板（Corning, Corning, NY, USA) 中培養，每個井六分配1 個细胞。把细胞K固定化（

结合於板上）的抗小鼠CD3e 單株抗« (145 — 2 C 1 1 ) (Leo et al., Proc .Natl .Acad .Sci .DSA * 84 ，1 3 74 ，1987 ) ( 100 Wg /奄升）和可溶性的經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事f#i填寫本頁)

抗 CD28 單株抗讎（37 . 51) ( Gross et al. , J • Inaunol · »144 ，3 2 0 1 ，1 9 9 0 ) ( 1 0 w g / 奄升 )。在提供固定化抗小鼠CD3e軍株抗體時•把145 — 2C11腹水於PBS中稀釋，將其5 0 W 1加入微培養板內，於4 下培育16小時，然後MPBS清洗三次井穴。把培養物置於控制濕度和 5%C02的培育器中於37ϋ下 -26- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 403654_b7__ 五、發明説明（Λ) 培育24小時，然後再把上清液取出進行I L 一 2活性的分析。IL—2的活性是利用IL一2依賴性细胞株CT L 一 L進行測量的，方法如前面所述（（Gillis et al • ， J . I Btnuno 1 * ， 120 ， 2 0 2 7 ， 1 978 ) ° 籣要的說明是，上清液於4 x l〇3 CTL -L细胞/井穴和96 — 井穴的平底撤培養板中進行連鑛的稀釋。在 24涸小時之後，加入0.5 «Ci/井穴〔3H〕胸腺哺啶於细胞中，並再培着1 6小時。收集细胞並且利用液態閃爍計數方法测定细胞的增殖狀況。計算單位是使用重組鼠類的 IL - 2 (Phamingen » San D i egο ，C A ，美國）作為禰準。

在測量 IL - 2 ， IL _ 4和 IFN — 7 m R N A 累積的實驗中，和FACS 分析實驗中*细胞是在 37C和 RPMI 1640 中培養 30 nin，RPMI 1640 中含有 50 //g / 奄升菠II蛋白酶•细胞密度為1Q7细胞/奄升。控制姐的處理细胞是在相等鳍積的磷酸生理鑀衡液（0.1 Μ ·酸鐮值 7.4 ； PBS )(即菠Μ蛋白酶的稀釋液）中進行培育的。經濟部中央標準局貝工消費合作社印11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在培育之後，把细胞K RPMI 1 640濟洗3次，然後再懸浮於T C Μ之中。用於mRNA拥定的细胞培養在研究組纗介素mRNA的累積的實驗中，把GA15雜交痛培養於24井穴的平底板内（Nunc ，Rosskilde ，丹 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央揉準局員工消费合作杜印製 403654 五、發明説明（>) 麥），在每井穴内置有2.5 X 106细胞，2奄升培養液體積，培養時間為4 小時。把脾臓的T细胞置於6井六的平底板內（Flow Laboratories, McLean, VA)，在每井穴内置有5 X 1Q6细胞，4毫升培養液體積，培養時間為 24小時。在研究增殖的實驗中，把脾臓的T 细胞K重覆三次方式置於96井穴的平底板（Nunc)內，每井穴内置有 10s涸细胞* 200微升培養液髖積，培着時間為36小時。於這些培養物中加入〇 · 5 Ci 〔 3H〕 TdR 16小時，然後利用玻璃纖維濾片收槊细胞，並計算细胞摻入〔3H 〕TdR的數量。所有的試劑都是用TCM來稀釋，除了使用固定化的抗C D 3 e單株抗體是利用P B S來稀釋單株抗體。把試劑加入到培養板内，以覆蓋井穴的底部，在4 Π 下培育1 6小時，然後利用PBS 濟洗3次。所有的细胞都是在37 t!和控制濕度和5%C〇2的條件下培育的。流式细胞計量技術在染色之前，把细胞（106 )在冰上培育30分鐘，培養液是1 奄升螢光活化细胞篩選（FACS)緩衝液 (1%熱致失活？05的？85液，0.02%以柯3)中，其含有5 0%的過濾馬血清。然後M FACS鍰衡液淸洗一次。把细胞置於100 w 1的FACS中進行染色，置於冰上30 »in，並有抗CD3 e軍株抗艚、抗CD2 8軍株抗SS、或 -2 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A*規格（210χ2,97公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂 403054 at ___ B7 五、發明説明（糾）地留il gG控制組抗應（全部都是1 〇w g/m 1 ) *而且MF AC S級衡液清洗一次。與胞表面特異性结合的抗艚的檢测方法是把那些细胞置於100 «1 FACS媛衝液中，與FITC —结合抗地鼠IgG ( 10 « g /橐升）在冰上培育30 min，然後M FACS緩衢液洗滌一次。把细胞再懸浮於 1%多聚甲醛（稀釋於FACS媛衝液），而且儲存在4 Ό之下。把畑胞以Becton Dickinson FAC S c an 流式细胞計量儀 ( Becton Dickinson ， Mountain View* CA)進行分析。使用前向和側向分散器設定淋巴细胞的《道，然後把數據Μ對數尺度進行繪圖。組孅介素mRNA的PCR分析 IL 一 2 ，IL 一 4和 IFN — 7 mRNA 的累積的測量方法是使用前述的半計量化RT — PCR 測定法（ Svetic et a 1 ，J · Immunol · 14 7 ： 2 3 9 1 — 2 3 9 7 ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1991))。簡要地說，把RNA由细胞和脾臓的組嫌中分離來（ Chonczynski和 Sacchi * Annal. Biochem . 162 :156 - 159 ( 1987 ))，使用 RNAzol B ，依照製造商的指示（Cinna/Biotecx實驗室），並把mRNA 利用檷準的程序（Sambrook et al ，Molecular Cloning :實驗室手冊，第二販，Cold Spring Harbor Laboratory Press» Cold Spring Harbor, NY. ( 1989 ))，其中使 -29- 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 403654 at _____B7_ 五、發明説明（4 ) 用3/ig從樣本取得的雄RNA，最後的反應容積是25« 1 。PCR是把每餾樣本簠覆二次方式進行*最终的反應容積是1 ，其中使用了 2 · 5/i 1的反轉錄mRNA 樣本作為cDNA棋板。對IL - 2 » I L - 4 · IFN - 7有特異性的寡核苷酸和持家基因Η P R T和其他P C R 的參與成員的處理均如前述（Svetic et al ( 1991 ) 前引述文獻）。進行的所有P C R中均有在9 5¾下逸行變性步嫌1 分鏟。退火步驟是在5 5 υ下進行1分鐘。延展步驟是在 7 下進行2分鐘。對每種組嫌介素和RNA樣本進行分析，Κ決定PCR循環的數目多寡•目的是要保證擴大作用的產物能夠被檢测到，然後反應才被終止。但是應逮低於飽和濃度。PCR的產物檢測方法利用瓊脂糖凝膠霣泳對擴大DNA進行大小區分，並把DNA轉移到Hybond N+ 耐觴膜之上，遇程是根據製造商的指示（ Aaershani » B u ck i nghamshi re ，英國）。經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經擴大的組纗介素mRNA可M使用姐嫌介素特異性寡核苷酸（Svetic et al ( 1991 )前引述文獻）得到顧示，該組镟介素特異性寡核苷酸是具有辣根過氧化酶的檷記HRP)的，而且與ECL化學發光作用檢測条統發生反應，如製造商所說明（Amersham)。特異性信號是由放射自顯影底片（柯達， Rochester， NY)記錄，並且KSharp JX - 3F6計算機光密度計量儀（Sharp *日 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 40365 彳五、發明説明（β) 本）進行分析，所用的軟體是 Phoretix 1 - D软« ( International Phoretix ， Newcastle ，英 Η) ° 由HPRT產物產生的信號強度是用來保證目禰c DNA 平均載入到P C R。通常，由HPRT產物產生的信號是在另一相異處理組中所得的信號的1 0%強度範圍內，另一相異處理組是Μ相同方式受剌激细胞中分離樣本。由組纗介素產物產生的信號強度是與每涸樣本中由HPRT產物所產生的信號比較而計算的。细胞的免疫浸潰法细胞磷賂胺酸浸潰法的實驗程序已有說明（Tho«as et al . , Cel 1，68 ，1 0 3 1 — 1 0 4 0 ，1 992 )。篛要地說，把1 X lfl6 GA15细胞溶解於冰冷的溶解嫌街液中（50 m Μ T r i s，酸 Κϋ 值 7.4 ，150 m M NaCl * 4·Ν EDTA · 196 T r i ton X — 100 ，4mM 正釩酸鹽，經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) UM PMSF ，50iM NaF ，10 «g /奄升亮肽素），並持續不蹰的旋轉 30 ·ίη。把细胞溶解物分雛（（1 4 , 0 0 0 xg2 in )，而且懸浮於SDS-SPAGE樣品緩衡液中，並且煮沸5 lin 。把包含相等數量的蛋白質樣品利用12.5% SDS -聚丙烯醣胺凝膠進行分離。把那些分離蛋白質K電泳方式轉移到硝基雄維素（BioRad )，並且把缠沒有结合的结合位置阻騰，阻蹰溶液是包含 5%小牛血清白蛋白 -31- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS } A4規格（210X297公釐） 403654 A7 B7 五、發明説明（V )

( Sigaa ，姐份 V;BSA) 0.05% UP — 40 ， 170 mM (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) “(；1，和50||»11'1'13(酸鐮值7.5)。把免疫浸漬物置於抗磷賂胺酸單株抗體（4G10 ;IgG2bk)中溫育，軍株抗體澹度是1 w g/m 1 ，目的是要檢測胳胺酸磷酸化蛋白霣。结合的軍株抗體可以利用辣根過氧化酶一结合山羊抗小鼠IgG來進行檢拥。免疫反應性的測定是使用ECL 化學發光作用反應（ Anersha· 公司·，A r 1 i n g t ο η

Heights ，IL)，並把特異性信號記錄於放射自顬影底片上。用於檢测MAP 激蘭的分離蛋白霣的免疫浸潰法是使用兔子抗大鼠MAP激酶 R2 ( erkl - CT )多克隆IgG ，，然後使用辣根通氧化酶一结合山羊抗兔子IgG 。抗MA P激醣抗臁是用來辨認 42 kda · 43 kda，和 44 kda的 MAP激酶，其是分別由erkl基因，*apk基因和npk基因所鱺碼的。在ctCD3e和otCD28 BAb剌激後進行的蛋白質胳胺酸磷酸化作用的分析經濟部中央標準局負工消費合作社印製在進行剌激作用之前5分鐘，把细胞於3 71C下懸浮在RPMI 1640中，密度為 5_ ΙΟχΙΟ7细胞 /毫升。使用的PMA和鈣離子載體A23 187的灌度分別是20 和 50 0 ng /毫升。CD3e和 CD28 BAbs 之間的交W程序是把T 细胞置於冰上培育30 min，其中每種單株抗體的數量是有 1〇 Wg /奄升。把過量抗體清洗之後，把细胞懸 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 r-4〇3G54 i、發明説明（V)

浮在RPMI 1640 (全部是 4*C)，细胞密度為 5 — 10X 1〇7细胞/毫升。交驊作用是在37 1進行•使用10 «yg /奄升山羊抗地鼠IgG 。把细胞如麵註和内文中所示剌激多次。剌激作用是K加入冰冷終止鑀街液结束，其中含有的最终濃度為 0·5% Triton X—100， 2 5 m M Tris*pH7*2，75mM N a C 1 ，4〇〇 m Μ E D T A » 1 0 m M 氣化納，400 mM 正訊酸納，lOmM 焦鱗酸纳，74mg/ml 的亮肽素*740mM PMSF 和74wg/ml的抑肽酶。於4Ό下進行溶解作用後*把樣本於4¾下Ml 2，〇〇〇 r p m (1 3*2 0 0 g)的速度（重力 )進行雕心1 5¾。把细胞核組份離心後的上濟液收集，並加入相等體積的2x SDS —PAGE樣品嫒街液（ 50iM Tr i s，酸_值 7 ，700 mM 2 - ME，50% ( v / v )甘油，2% ( w / v ) SDS *0.01% ( w / v)溴酚藍）。把蛋白質在100C下溶解5 «in，並且 MSDS - PAGE方法進行测定。羊紅血细胞测定法在實驗的第1、4、和6天，小鼠接受以3x200 wl靜脈内（i ·ν·)注射200/zg的菠蘿蛋白釀或相等體積的0·9% NaCl (菠蘿蛋白酶的稀釋液） -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） ----------Λ1^-- (請先閱讀背面之注$項ί:填寫本頁) ..訂 /i,· 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印装 A7 B7 40365^ 五、發明説明（^) ------------ (請先閲讀背面之注意事項^填寫本頁) 。在實驗的第4天，兩組處理組均接受以1 〇◦ w 1的腹腔內注射（ί ♦ P .) 107 SRBC或相等體積的0 · 9 % N a C 1 (SRBC的稀糈液）。小鼠是在第7天被殺，取出脾臓，Μ前述製備细胞的程序分雄脾细胞。分泌對S R BC抗原有特異性的抗艚的Β细胞數目的测定是基於Jerne 和 Nordin的方法’如Weir (1 986)中所說明的。簡要的說，該澜定法是在160 « 1中，含有 5 X 105脾细胞，6 X 106 SRBC，和1 : 27天竺鼠補體的RPMI 1640培養液。把反應混合物放置於一個室中，該室是由兩片玻片與雙面膠帶所姐併而成再Μ 蠟加以密封。把樣本置於37t：下培育1小時*然後進行空斑形成單位（PFC)的計數（即是能夠分泌對SRB C有特異性抗體的B细胞）。结果實施例1 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝菠驩蛋白酶於GA15對離子載體和和大戟二帖酸酯 -誘發賂胺酸璘酸化作用的效應

對菠蘿蛋白酶預處理對T细胞在被胳胺酸磷酸化酶细胞基霣的第二信使剌激作用的效應作了評估。使用特異性抗磷胳胺酸抗體的免疫浸潰法顧示在5分鏟的剌激作用後，有幾個蛋白質帶是有賂胺酸璘酸化作用，該剌激是PMA -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） A7 4〇ae54_E_ 五、發明説明（y) *離子載體，或PMA和離子載《结合（PMA+ Ca)。大約42kda的主要的蛋白質帶最為明顯可見。PMA+ Ca有協同作用效應，於磷酸化帶的強度增加（圃2)。菠蘿蛋白藺對賂胺酸磷酸化作用的效應評估是根據其抑制 42 kda帶出規的能力，可Μ利用抗磷胳胺酸抗«的免疫浸漬法加Κ檢測。當被所有的第二信使促效作用物剌激時，Μ菠驩蛋白醣預處理 GA15 细胞可Μ阻斷42kda 蛋白質的賂胺酸磷酸化作用。利用磷貉胺酸免疫浸潢法不能檢測到該帶的存在。由於PMA和C a的協同作用，所有後續的實驗都採用瑄個姐合。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 我們繼鑛研究磷酸化作用的動力學和測定菠蘿蛋白酶是否有抑制賂胺酸磷酸化作用的能力，在5分鐘的時間内該能力是否與時間有翮，或是否能夠完全抑制路胺酸磷酸化作用。我們看到的結果是菠驩蛋白酶沒有完全地抑制磷酸化作用，但是可以阻延賂胺酸磷酸化作用（圔3)。磷酸化作用的動力學於是可以根據放射自顬澎BI (躔4)進行光密度測置而加似量化。賂胺酸磷酸化作用受到了，這個帶的磷酸化作用沒有到達與沒有處理控制組相同的強度，而且在1 8 0分鑪内完全地被去璘酸化。除了 42 kda蛋白質，對於其他一些仍然未經確認的蛋白質的抑制作用也可Μ在细胞被第二信使促效作用物剌激時被觀察到。然而，正如抗磷胳胺酸免疫浸潰法结果所示，菠蘿蛋白酶沒有影響極為豐富的细胞轔蛋白的嬙播酸 -35- 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 403654_B7_ 五、發明説明（4) 化作用。主要42 kda璘酸化箝的鑒定如在上面提到的，MAPk族的幾個成員的賂胺酸殘基經過生長因子的處理後被磷酸化*而且大戟二帖酸_和鈣鏟子載體也有相同的效應。由於文獻中描述的 MAPk分子量與我們實驗中的主要的蛋白質帶的胳胺酸磷酸化蛋白質相當，因此我們假設於GA15细胞觀察到的42kda蛋白霣就是MAPk 。我們因此使用用抗MAPk抗體去檢拥GA15细胞內的 MAPk。經濟部中央榡準局貝工消費合作社印策 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖5顳示針對來自MAPk (Erk 1)高度保守肽序列的多株抗體可以辨認到Mr 42,000和44,000的兩僩蛋白霣（分別認為是erk 1和 erk 2)。-該 42 kda蛋白質顬示的«泳移動性與在受剌激T 一细胞中檢測到的含磷賂胺酸蛋白質相同。該44 kda也與一種蛋白霣有相互《係，該蛋白霣是有被胳胺酸磷酸化的，而且與 PMA加上«子載體的剌激無W。48 fed a的一個蛋白質和其他的低分子量蛋白質也可K被檢测到，然而這些帶也可以在控制姐中被檢拥到*也沒有加入抗MAPk *因此其反應性相信是非特異性的。利用抗 MAPk抗體進行的免疫浸潰法顯示所有測試樣本皆有相似的強度，顯示在菠蘿蛋白酶處理過的细胞所觀 -36- 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 40365^ 3；五、發明説明（κ) 察到的胳胺酸磷酸化作用的強度的減少並不是因為蛋白質存在的水平的差異。電泳移動率我們也研究過於我們的實驗中被磷酸化的42 kda帶是否MAPk，採用的方法是利用檢测磷酸化MAP激醣，其具有阻延霣泳移動率的特性。利用抗 MAPK抗體對细胞溶解物Μ免疫浸潰法進行分析。利用抗 ΜΑΡΚ抗«的免疫浸漬法结果顯示與正常ΜΑ P k磷酸化作用的試驗比較，其電泳移動率有遷移。這個電泳移動率的遷移遢會在被菠蘿蛋白酶處理通的细胞中受到部份阻礙（圔6 )。菠蘿蛋白醣對於«外GA15中的IL 一 2 ，IL 一 4 和 IFN—7 mRNA生產的效應經濟部中央標準局負工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ上顯示的是，GA1 5 T细胞_交痼經遇菠艚蛋白酶處理後，當细胞受到ΡΜΑ 和鈣離子載體Α23187剌激時，會產生賂胺酸磷酸化作用的改變。尤其是，菠蘿蛋白酶顯著地滅少一種 42 kD a蛋白質的胳胺酸璘酸化作用，該蛋白質稱為MAP激藺。為了要決定是否由菠籮蛋白醣產生的胳胺酸《酸化作用的改變會引致任何的功能性變化，我們澜1GA15中組嫌介素mRNA的累稹狀況。菠蘿蛋白酶對IL 一 2 ，IL 一 4和IFN— 7生產的 -3 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 2.97公嫠）經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7 及、發明説明（V) 影響是在培養 4小時之後利用RT_ PCR测定法测定的 mRNA的累積而测量，該mRNA是具有逭些組孅介素的纗碼。GA15细胞是ΜΡΜΑ A2318 7進行剌激。這涸組合 (PMA和 A23187 )直接的激活细胞信息途徑，因此遴開所有的细胞表面的分子。採用相對地短的培着期（4小時 )的目的是為了要保證姐嫌介素mRNA累積是特異性剌澂的結果，而不是新合成組嫌介素的自分泌效應。在只有T CM的细胞培蕃物中不會檢测到姐雄介素的 m RNA。在PMA和 A23187剌激之後，與控制姐（MP B S處理）比較（圈7)，所有的姐嫌介素mRNA的累積在Μ疲蘿蛋白醣處理的 GA 15细胞中都比較低。逭儡姐嫌介素mRNA累積的分別在IL _ 4更為明顯·Μ菠《蛋白酶處理的细胞的結果明顯較低（n = 3 ， Ρ < 0.05 )。因為MAP激醣的賂胺酸磷酸化作用是與組嫌介素基因轉錄作用有關（Pelech ，Curr . Biol ♦ 3 : 513 ( 1993 ))，我們假設逭個姐雄介素mRNA索積的減少是由於MAP激酶的賂胺酸磷酸化作用減少所致。菠蘿蛋白酶對IL 一 2於脾臓的T细胞中生產的效應我們然後研究菠蘿蛋白酶是否能夠影響姐嫌介素於正常的 T—细胞中的生產，該正常的T一细胞是在K细胞表面的分子受到剌激時從小鼠（鼠科）脾臓中分離出來 _ 3 8 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 14^. ••訂 40365^ A7 B7 五、發明説明（糾）的。第一個剌激（PMA + A2 3 1 87 )直接激活细胞信息途徑•並且因此避開所有的细胞表面的分子。固定化cxCD 3 e和可溶性抗C D 2 8軍株抗體的組合會提供一個初級的信號和一僩輔助剌激信號。此初级信號是通遇T -细胞受體（經由 CD3e -鐽）的。而輔肋剌激信號是通過C D 28去激活细胞信號级聯反應。這兩個剌激的组合（PMA + A23 187 ； aCD3e+ aCD28)已於前面顯示，其提供了一個最佳的T -细胞活化（Truneh et al · ，N a t u r e，313 ： 3 18 — 320 ( 1985 ) ; Lins 1ey和

Ledbetter ， Ann. Rev ♦ Iiiunol · ， 11 : 191 ( 1 9 9 3 )) •然而是通通一個不同的機制，即分別是直接的和間接的作用。對從鼠科脾臓的T 一细胞分泌進入培養上澄濟液之内的IL 一 2進行_定。如上所述，T细胞的剌激是把固定化抗 CD3e ·ΑΙ)在抗CD28 nAb的存在條件之下進行2 4小時的。那些在沒有抗髓或有只有抗 CD28或抗CD3e的培着可Μ作為控制姐。經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製圓8顯示單一實驗的结果。Τ细胞於沒有抗«或只有抗CD28的條件下培着，並不會產生可Κ檢拥的I L -2。同樣地，只有固定化的抗CD3 e只能產生僅僅可Μ 檢测數量的IL一2。由於最佳的Τ一细胞活化作用是霈要初鈒信號（通過 TCR的作用）和輔助剌激性信號的，Τ 细胞爾要在有兩種抗體存在的條件下培養。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）經濟部中央標準局—工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（从）抗 CD28和抗 CD3e的組合於培養中I L _ 2於T _细胞的生產董有實質的增加。經過剌激之後，覼察在年青和老化的老鼠中IL_ 2的生產董的差異。這現象在文獻中被廣泛地報導（由Thoaan和 Weigle ，1989综述）。再次，如在較早前GA 15實驗中所觀察到的，T细胞經通菠蘿蛋白酶預處理後*所產生的IL-2明顯少於只以P B S處理的 T _细胞。在老化和年青的小鼠中同樣減少。這個效應可 K在T细胞K最佳的方式被初级信號（通過TCR)和輔助剌激信號（通過CD28辅助分子）剌激時可Μ被觀察到。菠蘿蛋白醏的作用似乎與年龄無闞*因為從年青和老化的小親中分離出的Τ细胞皆有I L- 2生產減少的現象〇菠蘿蛋白醣對於體外脾臓的Τ 一细胞的IL 一 2 ，IL 一 4和 IFN — 7 mRNA生產的影響我們然後研究菠驩蛋白釀誘發的賂胺酸磷酸化作用的改變横式是否會影響到脾臓的T -细胞生產其他的組孅介素。我們研究菠蘿蛋白藺對IL 一 2 ，IL 一 4和IFN — ^ 生產，方法是测定具有瑄些物質編碼的mRNA的累積數最。把T 细胞在只有培養液或聯合固定化抗CD3e 和可溶性抗CD28單株抗«的條件下培養 24小時。K 只有T CM的條件下進行的细胞培養並沒有檢测到組嫌介 -40- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、νφ 403654 A7 _B7 _ 五、發明説明（W ) 素 m R N A。經過剌激之後，經菠籮蛋白藺處理的T 细胞的所有組嫌介素mRNA的累積是一致低於控制組的（圖9)。組嫌介素mRNA累積的那些差別在IL - 4最為明顬，顧著地（n== 3 ， p< 0.05)少於K疲II蛋白酶處理畑胞，瑄些Μ菠驩蛋白藺處理畑胞是被抗 CD3e和抗 CD28

Abs所剌激的。菠蘿蛋白酶在體外對脾臓的T -细胞增殖的影響如果經過菠蘿蛋白藺預處理的脾臟T 细胞中有出現姐織介素mRNA累積減少的情況，而且瑄些組嫌介素，特別是IL 一 2和IL— 4 ，對T细胞增殖甚為重要，則菠經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 蘿蛋白釀將會減低T 细胞增殖。因此，我們研究菠驩蛋白酶對T细胞增殖的影響，方法是測定3H — TdR摻入到受抗 CD3e和抗 CD28單株抗髓剌激的细胞中的數逢。令人驚訝的是，T 细胞的菠蘿蛋白酶預處理會引起T细胞增殖顯著的增加（n = 6 ; p < 0.05)，而不是預期中的滅少增殖（菌 1〇)。這些矛盾的作用的一個可能的解釋是，菠蘿蛋白酾減少組孅介素的製造，但是對生長因子的反應增加，那些生長因子例如IL 一 2和IL 一 4 (可能那些生長因子的细胞表面受體經過修飾，或是T 细胞信息級聯反應增加了基因表達作用）。 -4 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨0X297公釐） 403654 A7 B7 五、發明説明（π) 菠蘿蛋白釀對脾臓的Τ细胞表面分子的作用因為菠Μ蛋白瞎已知能夠除去特異性τ 一细胞表面分子(Hale 和 Haynes ， J · IbhuiioI ♦ ， 149 ： 3809 - 38 1 6 ( 1992 ))，因此我們可Μ利用滾式细胞計量技術研究菠蕹蛋白酶是否能夠除去菠蹁蛋白醣處理過的脾臓Τ 细胞上的CD3e和CD28分子。用於瑄些研究的單株抗《是與在上面描述剌激测定法中所用的相同。我們観察到的结果是，结合到脾臓Τ细胞表面的CD3e 是一致地比較Μ菠蘿蛋白酶處理的為高（圔11a)。抗CD28 mAb與CD28 的结合作用增加（可Μ從脾臓的T 细胞上檢拥到的水平得知）。埴些結果顯示，细胞表面分子被菠蘿蛋白酶處理除去與組嫌介素mRNA累積減少無闢，雖然單株抗體與 CD3e和 CD28分子的结合是與增加菠蘿蛋白酶處理细胞增殖有幫助。經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 菠蕹蛋白酶對GA15细胞表面分子的作用由於我們觀察到aCD3e 與脾臓的T —细胞的结合在菠蘿蛋白釀處理之後有增加，我們也研究菠蘿蛋白酶是否影響在GALS细胞上的CD3e和CD28分子。用於埴些研究的單株抗髓是與在上面描述剌激拥定法中所用的相同。再 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央樣準局負工消费合作社印製 403C54 at B7 五、發明説明（w) 一次*在菠蘿蛋白酶處理之後，*Ab 與GA15的表面CD3e 的结合作用稍為增加（由平螢光強度（線向右移）可以知道）（圔12 )。這個结果與較早前對脾臓的T 一细胞的観察一致。觀察到的增加是一鎇特異性反應*因為控制組的mAb的结合作用並沒有增加到超過背景结合水平，在菠驩蛋白藺處理和PBS處理的6A1 5也是如此。不太可能的是，抗 CD3e nAb與 GA15表面的结合作用是由於 CD3e 增加表達因的緣故，因為那些细胞只有經過菠蘿蛋白菌在 37 〇下處理30分鐘，並且所有的後續染色程序皆在 4 t進行。因此只非常小的细胞活動。可能的是* *Ab 與 CD3e的结合作用增加可能是由於菠蠤蛋白酶修飾了的分子暴露出比較多的抗原決定部位。菠蘿蛋白酶在骽外對正常鼠科脾臓T 细胞中的胳胺酸璘酸化作用較早前，我們研究菠篇蛋白酶對6A15细胞的賂胺酸璘酸化作用的影響。我們接著研究菠蘿蛋白酶處理對正常鼠科T 细胞的賂胺酸璘酸化作用的影響。T细胞是從健康的 Balb / c 小鼠的脾臓分離出來，而且是Μ ΡΜΑ 或 Α2 3 1 8 7 或固定化抗 CD3e和和可溶性的抗 CD28單株抗體對GA 15细胞進行剌激，如上面所述。在剌激作用和進行賂胺酸磷酸化作用的分析之前，脾臓的T 细胞於是被分雕， -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) *訂經濟部中央標準局員工消費合作4-S-製 403654 A7 B7 五、發明説明（·νζ) 並且於稍後置於包含 5 ng / «升ΡΜΑ的TCM中培養48 小時，如 Vandenberghe et a 1 ，J ♦ Exp · Med · 17 5 ： 95 1 960 ( 1 992 )中所述。置於PMA中孩先培養的原因是在休止的T 细胞中增加賂胺酸磷酸化作用的增加是很難檢测的（Vandenberghe et al ，（ 1 992 )如前引述 )° 在脾臟的T 细胞可K観察到胳胺酸磷酸化作用不同的棋式，比較先前於GA15 中觀察到還多（_ 13a和13b ) 。不管细胞有沒有受到剌激（_ 13b)，菠麵蛋白酶抑制低分子量蛋白霣（大約 16 kDa )賂胺酸磷酸化作用。沒有檢测到先前在GA15细胞中出現的42 kDa賂胺酸磷酸化 ΜΑ P激酶帶。對於這些细胞，可能獬要使用更加敏感的測定法來测量M A P激藺活性。脾臓的T 细胞和GA15细胞中的賂胺酸磷酸化作用模式之間的另外一個更明顬的差異是菠蘿蛋白酶處理會使蛋白質（圈13a )進行賂胺酸磷酸化作用，而在GA 15细胞在剌澹作用之後曾發現有抑制性的作用。當T细胞受到PMA和 A2 3 1 87或抗 CD3e和抗CD28 單株抗«剌激的時候，可Μ覼察到一個明顯的 56 kDa賂胺酸磷酸化蛋白霣。除此之外，一個稍大的 58 KDa胳胺酸磷酸化蛋白質也可以在逭些细胞中被檢測到。瑄些蛋白質的賂胺酸磷酸化作用是不會被檢測到的，除非T细胞被菠薄蛋白酶處理。在被抗CD3e和抗CD28單株抗體剌激之後 2到5分鐘，這些蛋白質進行賂胺酸磷酸化作用，而且在 -44- 本紙張A度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 403654 at _B7 ___ 五、發明説明（A ) 剌激之後保持磷酸化狀態至少30 lin (匾13a和13b > 。因為一些蛋白質的磷酸化作用是伴嫌细胞反應的活化作用，菠蕹蛋白醣能夠誘發T细胞胳胺酸磷酸化作用表示菠蘿蛋白藺可Μ激活這些细胞。較早前研究菠蕹蛋白酶對脾臓 Τ 一细胞增殖所得的结果表示瑄些细胞被菠驩蛋白酶激活〇實施例2 在前面的實施例中·我們注意到菠蘿蛋白酶會滅低於 GA15 细胞（Τ 一细胞雜交瘤）中的蛋白質磷酸化作用，特別是ΜΑ Ρ激藺。我們也観察到當受到大戟二帖酸釀和離子載體剌激的時候GA 15细胞經過菠蘿蛋白藺處理舍減少 IL — 2 ，IL — 4和IFN — 7。此外，我們也觀察到菠經濟部中央揉率局貝工消费合作社印袋 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 驩蛋白釀處理正常鼠科脾臓的Τ 一细胞在分別給予生理剌激（即a CD3e 和aCD28 經遇Τ -细胞受艚提供信號）和經過C D 2 8提供輔助剌激性信號的時候會引起相似IL 一 2 ，IL — 4和IFN-7減少。把這些結果一起考廉，滅少的賂胺酸磷酸化作用是與組鏃介素生成的減少有相關。然而，於匾13a所得的數據顯示增加的蛋白霣胳胺酸磷酸化作用，和脾臓的T 一细胞（園10 )的增殖的增加都表示菠蘿蛋白藺也是能夠剌激或活化T-细胞。我《進行一些進一步的實驗並研究菠蘿蛋白酶於GA 15 -4 5 — 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 40365^_B7_ 五、發明説明（0) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 细胞接受aCD3e和 a C D 2 8的剌激之後對組嫌介素m RNA 產生的影響（較早前於寳施例1研究過菠麯蛋白酶和PMA + A2 3 1 8 7對組纗介素製造的影響）。有趣的是，我們確實觀察到在细胞K菠艚蛋白酶處理並以抗 CD3e和抗CD28軍株抗«剌激時，组嫌介素m R ΝΑ製造是有增加的（圓14)。組嫌介素mRNA累積的模式是與實施例1所觀察到的情況相反，其中菠驩蛋白酶減少組嫌介素mRNA於 GA15细胞中的累積，GA 1 5细胞是接受大戟二帖酸_加上離子載體的剌激。再次，組嫌介素mRNA累積的差異KIL 一 4的情況最為明顯，以菠蘧蛋白釀處理被抗 CD3e和抗CD28軍株抗鬅剌激的细跑顬著地較高（η = 3 ， Ρ < 0.05 ) (較早前的结果是，菠蘿蛋白酶引致IL 一 4 mRNA 於被PMA + A23187剌檄的GA15细胞中的累積比較低（ η = 3 ， Ρ < 0.05 )。瑄些如上述的不同结果的一個經濟部中央標準局貝工消费合作社印製可能的解釋是在GA15细胞中，菠蘿蛋白酶處理會抑制直接由PMA + Α23 187剌激的信息途徑，但是能增加另一個與细胞表面分子（例如 CD3e和CD28 ) _合的信息级聯反應。菠蘿蛋白酶在體外對小親的作用 -4 6 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210 X297公釐Y ~ 403654 A7 B7__ 五、發明説明（<) (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 到目前為止，展示出來的數據部指示菠蘿蛋白酶對T 迪胞（剌激性和抑制性，視乎所研究的细胞類型）能夠有多種作用。我們已经顯示其對正常脾臓的T 细胞（主要是未受激活的 T细胞）和T细胞雜交瘤GA15 (活化的T 细胞的代表）之間胳胺酸磷酸化作用棋式的不同作用。除此之外•當使用细胞表面分子的结合物去剌激细胞時（也就是，抗CD3e和抗CD28單株抗«)，菠蘿蛋白酶處理會增加組缃介素mRNA於GA15细胞的累積，但是會減少組纗介素mRNA於正常脾臓的T 细胞中的累積，即使會使埴些细胞增殖作用增強。經濟部中央標準局員工消费合作社印製知道SI外培着的细胞観察到的差異*我們進一步研究菠蘿蛋白酾對完整動物的T 细胞功能的影響。研究菠蘿蛋白酶對T 细胞活化作用的影響的方法已有文獻描述*即使用測量對羊紅血细胞（SRBC )產生的T细胞一依賴性抗艚反應 (Weir， Handbook of Experinental IBiuno 1 ogy, 1-4, 4th edn. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK ( 1 98 6 ))。這個测定法直接测量在接受這個抗原免疫注射後，產生對SRBC特異性抗體的 B畑胞的數目（即空斑形成细胞（PFC ))。瑄個反應是依賴SRBC 一特異性T细胞的增殖和組嫌介素的製造，特別是IL -4 〇接受生理食鹽水（控制組）的小鼠產生非常少的 PFC ，不管是否在之前經過菠蘿蛋白酶或生理食鹽水處理也是 -47- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 403654 A7 B7__ 五、發明説明（a ) (請先聞讀背面之注^^項再填寫本頁) 如此（圖15 )。這顯示菠蘿蛋白釀處理並不引起PFC自發性的生產。在接受SRBC免疫注射的小鼠中，與控制組動物比較（_ 15)，接受菠蘿蛋白釀會引起PFC顯著增加（n=ll，p < 0.05)。這個结果的一個可能解釋是菠蘿蛋白酶處理畲引起SRBC —特異性T细胞的增殖的增加（類似在體內脾臓T -细胞的實驗中觀察到的增殖作用增加*圖10)，產生加強T细胞協助B细胞生產SRBC 一特異性 Ab的作用。然而，我們不能夠排除以下的可能性：菠蘿蛋白酶直接剌激的B细胞或一些其他與抗體反應有闞的细胞。不管實際的機制如何，這個结果表示菠蘿蛋白酶可Μ作為佐劑的新穎用途。討論經濟部中央標準局負工消费合作4^-製菠蘿蛋白酶已知是可Μ抑制在腸內各種第二信使的分泌效應，那些第二信使例如是環化AMP，環化GMP和Ca2 +。菠蘿蛋白醣作用的機制是未知的，但是其作用是與環化核苷酸於细胞內的累積密切相翡。

從菠蘿蛋白酶對腸细胞的作用，及其在第二信使和蛋白霣的瞵酸化作用所扮演的角色出發，我們測試了菠蘿蛋白酶在其他的细胞是否能夠抑制信號傳導糸統。特別是，我們檢査菠餚蛋白酶對組雄介素的製造（IL 一 2 ，IL —4和IFN - 及T -细胞增殖所必須的肌醇途徑和 -48" 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐）經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 403654 i、發明説明（θ) 胳胺酸磷酸化作用。我們的假設是，如果菠蘿蛋白酶影響细胞傳導信號的作用，則這個抑剌作用將會伴随有T -細胞不能產生組嫌介素、主要自分泌生長因子和增殖作用等〇這些结果顬示，當受到大戟二帖酸酯和鈣離子載體和抗细胞表面分子的抗體剌激的時候，菠艚蛋白酶能抑制或者剌激蛋白霣賂胺酸磷酸化作用。我們鑒定了其中一個受影響的蛋白質，其是MAPk (促细胞分裂素活化的蛋白質激酶）。幾個観察结果均支持我們的鑒定结果： 1) 在T -细胞受到大戟二帖酸酯和鈣離子載«的剌激時，MAPk成為磷酸化。在T 细胞受體和輔肋剌激性分子结合時ΜΑ P k也但被磷酸化。 2) 當接受大戟二帖酸蠢和離子載鱧的剌激時， 42 kda蛋白霣（輿文獻中的42 kda相符）於GA 1 5细胞中被磷酸化。當經遇菠II蛋白酶經過處理時，瑄錮蛋白霣並沒有被磷酸化或是磷酸化作用明顯地減少。 3) 使用特異性抗 MAPk抗體的免疫浸漬法產生一個 42 kda蛋白質的帶。 4) 免疫浸漬法顯示菠蘿蛋白藺引致42 kda蛋白質的電泳移動率受到阻礙*該蛋白質是MAPk的磷酸化作用的特徴。因為菠蘿蛋白酶對胳胺酸磷酸化作用和MAP k的抑制性作用，我們的假設是，這涸抑制作用是與受破壊的信 -49- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •Γ· 403654 A7 B7 五、發明説明（β) 號傳専作用有闞。MAPk對IL — 2製造是十分重要的，因為它能夠把其他的蛋白霣進行磷酸化，瑄些蛋白質例如 c -Jun是啟動IL-2轉錄作用所需要的。因此我們測試菠蘿蛋白酶對於鼠科脾臓的T细胞中進行的IL - 2製造的抑制能力。有趣的是细胞Μ菠蘿蛋白釀預處理*在接受抗CD3e mAb和抗CD28 nAb的剌激之後·與接受PBS處理的T-细胞比較，其會產生明顯較少的IL-2。菠蘿蛋白酶作用的機制是未知的。可能的是，它抑制賂胺酸磷酸化作用的方式是抑制賂胺酸激醣的活性，或是刺激的磷酸醏，使蛋白質進行去磷酸化作用（例如激活CD 4 5 )。不管作用的懺制如何》蛋白霣的賂胺酸湩讕節因子已知為具有免疫抑制繭性質（June et al ·， Proc · Natl • Acad ， Sci · U S A ， 87 ， 7722 - 7726 ， 1990 ) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項*'1填寫本頁) 。已知草徽素A為能夠抑制抗原受體一剌激T-细胞活化作用早期的生物化學的反應，亦與蛋白質的胳胺酸激活性的抑制作用相鼷。但是•草徽素不能夠抑制大戟二帖酸酯和雄子載體剌激的影響。菠蘿蛋白酶的作用是不同於先前報等的草撤素A，菠蘿蛋白酶能抑制T 一细胞受體剌激的作用（於抗體结合實驗中顯示）和第二信使的效應（大戟二帖酸_和雕子載艚）。菠籮蛋白酶與雷伯徽素有不同的作用。雷伯激素據報導是有免疫抑制性質的。與雷伯黴素不同的是，菠蘿蛋白 -50- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 A7 _B7_ 五、發明説明（β ) 酶抑制MAP激酶的賂胺酸磷酸化作用（Chung et al · • Cell 69 » 1 2 2 7 - 1 2 3 6，1 9 9 2 )。瑁胞徽素是另一個抑 (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 制calcinuerin 的免疫抑制劑，其作用亦是與菠蘿蛋白酶的作用不同。因為 herbUycin和雷伯徽素具有抑制蛋白質的胳胺酸活性和信號傅導作用的能力*它們也可以用於作為免疫抑制费I。在這項研究中，菠蘿蛋白酶顯示抑制T 细胞中的胳胺酸磷酸化作用，它能因此被預澜菠籮蛋白醣也有可能成為免疫抑制劑。

Herbimycin A已知可Μ誘發許多種畑胞株的分化，在其中一個情況中*其是與蛋白霣的賂胺酸激活性的抑制作用有關的（Kondo et al . ，J · C e 1 1 · Biol · ，190 *285 - 293 « 1989 ) ° 在上面討論的結果顯示菠蘿蛋白酶的許多潛在用途。經濟部中央梂準局貝工消费合作社印製菠蘿蛋白酶影響T 细胞賂胺酸磷酸化作用的模式的事實顯示由這個信息機制產生的细胞反應可Μ被菠»蛋白酶所調節。除此之外，菠蘿蛋白醣對不同的哺乳動物细胞類型和在瑄些细胞中的賂胺酸磷酸化作用的影響，菠蘿蛋白酶能夠調節逭些细胞中由信息機制所產生细胞性反應。除菠蘿蛋白酶對賂胺酸磷酸化作用的影響之外•我們已知Τ 细胞經菠蘿蛋白酶處理能夠修飾细胞表面的受體，以增加與结合物的结合作用。Μ前，只知菠«蛋白酶影響Τ 细胞的方式是切斷表面受體（H a 1 e和 Haynes * ( -5 1 - 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 A7 B7 五、發明説明（切） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1992 )如前引述）。因此，我們相信的是，我們已經發琨兩個新的機制（除了切斷细胞表面分子），經由這些機制菠驩蛋白酶影響T 细胞（也躭是，修飾胳胺酸瞵酸化作用和增加特異性细胞表面受«與生理上的结合物之間的结合作用）。基於這些结果*令人相信的是，菠蘿蛋白酶能夠被用來修飾下列各項细胞的過程；修飾（改變）組孅介素生產。我們有直接的證據顬示菠蘿蛋白酶能剌激（圖 14 ) 或抑制（圖7 ·8和9)於Τ细胞中的組纗介素製造過程經濟部中央標準局貝工消费合作社印袋。使用菠蘿蛋白酶剌激組镟介素製造的潛在用途包括作為免疫加強劑，可Μ施用於免疫妥協或受寄生蟲/病原體感染的的人士，亦可Μ作為疫苗的佐劑（直接證據見圖15 )或化學療法。使用菠蘿蛋白酶抑制組嫌介素製造的潛在用途包括作為免疫抑制劑以防止移植手術後的組孅排斥現象，也可Μ防止自身免疫反應。此外，菠蕹蛋白酶可Μ用於防止中毒性休克（發炎性組嫌介素的生產與中毒性休克有闞）。蛋白質的磷酸化作用，包括MAP激藺，是對中毒性休克十分重要的。賂胺酸激抑制劑在體内已知能夠抑制中毒性休克（Novogrodsky et al ，Sc ί enc e · 2 6 4 ： 1 3 1 9 - 1 3 2 2 (1994 ))。同樣地，菠蘿蛋白 -52- 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403654 a? _B7__ 五、發明説明（rl ) 醣可K用來防止過敏反應。發炎姐纗介素和其他细胞的產物（例如組雄胺）是在接觸到過敏原時由细胞釋放出來的。誘發细胞分泌發炎產物的信息級聯反應是包含賂胺酸磷酸化作用的。 Τ细胞增殖或分化作用的剌激。經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 我們有直接的證據顧示，菠蘿蛋白酶能剌激正常的脾臟Τ 细胞的增殖（圖10)。未完全分化的Τ细胞進行增殖會分化成一種能夠產生特異性類型組纗介素的细胞。我們相信菠蘿蛋白酶也能夠促進瑄個分化過程。使用菠蘿蛋白酶剌激Τ 细胞增殖的潛在應用目的是與增加組纗介素製造相»。然而，除了增加Τ 细胞的增殖外，增殖作用也可 Κ產生比較多能夠產生組嫌介素的细胞，而且將會有更多的畑胞一细胞相互作用發生。除了產生組纗介素外，瑄些相互作用也是免疫反應中十分重要的部份。促進细胞的分化的另一個優點是可Μ應用於白血病，或τ 一细胞癌中，在瑄些疾病中未分化的Τ -细胞數目會增加（注意··我們不認為菠蘿蛋白酶將剌激異常的Τ 细胞增殖*根據從Τ 一细胞雜交瘤的GA 1 5细胞所得的數據，菠蘿蛋白釀抑制這些细胞的增殖）。阻止Τ细胞死亡 -53- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) 格（210 X 297公釐） 403654 A7 _B7__ 五、發明説明（θ ) 菠蕹蛋白酶增加正常的T 细胞增殖作用（臞10 )的一偁可能解釋是它能規麵细胞死亡（apoptosis )。细胞死亡的減少將導致有比較多的细胞會有效摻入H2 — TdR (它是用來測量增殖作用的）。Apoptosis 是一涸特異性反應，其中的细胞受到剌激破壊他們自己的DNA而且死亡。它是大多數免疫的反應（遴免太多细胞的累積）中所必須的，但是在一些情況也能有免疫抑制作用的结果，例如HIV 感染和老化（也就是，太多细胞死亡而且不足K應付感染）( Perandones et a 1 ，J · I nauno 1 · 151 ： 3 5 2 1 — 3 5 2 9 ( 1 99 3 ))。因為 apoptosis 的開始是依賴特異性的信息反應，我們的證據顯示菠蘿蛋白醸影響胳胺酸磷酸化作用（圖 13a )，這個作用與剌激或防止 apoptosis有翮，而且也支持菠蘿蛋白酶在防止apoptosis 方面的用途。防止寄生螽/病原體入侵和於细胞内的存活經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 寄生蟲和病原體的入侵，和後來的於细胞內的存活，是視乎這些生物如何利用宿主的信息途徑（Bliska et al ，C e 1 1 . 73 : 903 — 920 ( 1993 ))。尤其是，沙門氐菌會抑制MAP激酶。MAP激酶可Μ使巨噬细胞把细菌內呑（ Galan et al ，Nature，35 7 : 588 - 589 -54- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 403654 a? B7五、發明説明（d ) (1992 ))。细菌會增殖和破壊细胞。因為菠蘿蛋白酶已知能修飾宿主的信息途徑（圖13a)，而且尤其是能抑制MAP激釀（圖2 )的賂胺酸磷酸化作用，我們相信疲蘿蛋白酶另一個潛在用途是能夠抑制寄生蟲/病原體的入侵或它們在细胞内的存活。 ------------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

4036&4 έΐ C8 D8 六、申請專利範圍 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 1 ·—種包含菠蘿蛋白酶的藥學組成物，其是用於調節细胞內依賴肌酵磷酸豔，蛋白質激商和/或蛋白質播酸醣的信息途徑。 2· 如申請專利範画第1項的藥學組成物，其中該信息途徑是依賴肌酵磷酸鼸的。 3 · 如申請專利範圃第1項或第2項的藥學組成物，其中的作用物能夠調節控制细胞生長和増殖的途徑。 4 · 如申請專利範圃第3項的蕖學組成物，製劑中的作用劑是用於減少或防止细胞生產生長g子。 5 · 如申請專利範圍第4項的藥學組成物，製劑中的作用劑是用於防止形成MAP激酶。 6 · —種包含菠蘿蛋白藺的藥學組成物，其是用於治療或控制由肌醇磷酸鹽，蛋白質的激和/或蛋白質磷酸醏所介導的妞胞内的信號傳導作用所介導的疾病。 7 · 一種包含菠蘿蛋白藺的藥學組成物，作為調節組孅介素的製造。經濟部中央標準局Λ工消费合作社印策 8· 如申請專利範圍第7項的蕖學組成物，其中的作用劑剌激組纗介素的製造。 9 · 如申請專利範圍第8項的蕖學組成物，其中的作用劑是用作為免疫加強劑和/或疫苗佐劑。 1 0 · 如申請專利範園第7項的藥學組成物，其中的作用劑可Μ抑制組織介素的製造。 11· 如申請專利範圍第10項的藥學組成物，其本紙張尺度適用中國國家椹準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）

4036&4 έΐ C8 D8 六、申請專利範圍 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 1 ·—種包含菠蘿蛋白酶的藥學組成物，其是用於調節细胞內依賴肌酵磷酸豔，蛋白質激商和/或蛋白質播酸醣的信息途徑。 2· 如申請專利範画第1項的藥學組成物，其中該信息途徑是依賴肌酵磷酸鼸的。 3 · 如申請專利範圃第1項或第2項的藥學組成物，其中的作用物能夠調節控制细胞生長和増殖的途徑。 4 · 如申請專利範圃第3項的蕖學組成物，製劑中的作用劑是用於減少或防止细胞生產生長g子。 5 · 如申請專利範圍第4項的藥學組成物，製劑中的作用劑是用於防止形成MAP激酶。 6 · —種包含菠蘿蛋白藺的藥學組成物，其是用於治療或控制由肌醇磷酸鹽，蛋白質的激和/或蛋白質磷酸醏所介導的妞胞内的信號傳導作用所介導的疾病。 7 · 一種包含菠蘿蛋白藺的藥學組成物，作為調節組孅介素的製造。經濟部中央標準局Λ工消费合作社印策 8· 如申請專利範圍第7項的蕖學組成物，其中的作用劑剌激組纗介素的製造。 9 · 如申請專利範圍第8項的蕖學組成物，其中的作用劑是用作為免疫加強劑和/或疫苗佐劑。 1 0 · 如申請專利範園第7項的藥學組成物，其中的作用劑可Μ抑制組織介素的製造。 11· 如申請專利範圍第10項的藥學組成物，其本紙張尺度適用中國國家椹準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 4〇3〇s4 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍中的作用劑是一種免疫抑制劑。 (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) 12· 如申請專利範圍第11項的藥學組成物，其中的作用劑是用於預防或治療組級排斥其或用來預防自身免疫反懕。 13· 如申讅專利範圍第10項的蕖學組成物，其中的作用劑是用於預防或治療中毒性休克。 14· 一種包含菠蘿蛋白醣的藥學組成物，用於治療或預防自身免疫疾病或移植物遭宿主的排斥。 1 5 · 如申請專利範圍第14項的藥學組成物，其中的自身免疫疾病是多發性硬化症或類風濕性闉節炎。 16· —種包含菠蘿蛋白酶的藥學組成物，用於預防或治療中毒性的休克。 17· —種包含菠蘿蛋白酶的蕖學組成物，用於作為疫苗的。 18· —種包含菠蘿蛋白酶的藥學組成物，其是用於治療癌症。經濟部中夬揉窣局員工消费合作社印策 19· 一種包含菠蘿蛋白酶的藥學組成，其是用於預防或治療過敏症。 2〇· 一種包含菠蘿蛋白醏的蘖學組成物，其是用於預防细胞凋亡（apotosis)。 21· —種包含菠蘿蛋白醏的藥學組成物，其是用於抑制，預防或治療寄生蟲和/或病原體的感染。 -2- 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS > A4規格（210X297公釐)