CN115073658A - 一种温敏性材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种温敏性材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种温敏性材料及其制备方法和应用，该温敏性材料以N‑异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰胺为原料，经过自由基沉淀聚合法合成得到聚(N‑异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的微凝胶。本发明采用的原料价格低廉，合成简便，得到的温敏性材料无毒无害、生物学相容性好。通过将温敏性微凝胶旋涂的二氧化硅玻片表面成功培养细胞，并通过简单的降温使细胞自动从基底上脱落。该细胞收获的方式过程中不使用胰酶，避免了酶解对细胞造成损伤，在最大程度上保留细胞的活力。在细胞的批量生产、干细胞收获、组织工程修复和图案化细胞培养等方面有非常重大的应用价值。

Description

一种温敏性材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种温敏性材料及其制备方法和用于收获培养细胞的应用，属用于细胞培养材料技术领域。
背景技术
在组织工程和再生医学工程中，大量的细胞培养传代时需要使用酶解，胰酶消化法是在蛋白酶水解的作用下破坏细胞之间的连接蛋白导致细胞的解离，切断整联蛋白和纤维连接蛋白之间的连接，这种细胞收获的方法存在明显的弊端，即容易使细胞功能缺失或者降低细胞的活力。
聚(N-异丙基丙烯酰胺)是一种温敏性高分子材料，在其修饰过的基底上的温度高于其临界溶解温度时，表面相对输水；而当温度低于临界溶解温度时，表面相对亲水。采用细胞在输水表面上粘附和增殖，但是在亲水表面上自动分离的性质，通过简单降低细胞的培养温度就能将细胞从基底上分离出来。
然而，纯的聚(N-异丙基丙烯酰胺)温敏细胞收获的效果不好，通常需要与其他物质进行共聚。其中包括将聚(N-异丙基丙烯酰胺)于疏水性物质或者亲水性物质进行共聚，共聚能够明显缩短细胞的脱附时间。但是缺乏共聚物质不同加入时间和共聚方式对聚(N-异丙基丙烯酰胺)温敏细胞收获的影响。
发明内容
发明目的：本发明为解决上述问题，本发明的第一目的是提供一种温敏性材料，该材料能够在收获细胞时最大程度保留细胞外基质，以解决细胞胰酶收获过程中出现的细胞损伤的问题。本发明的第二目的是提供该温敏性材料的制备方法，并且探究了不同合成方式对细胞收获的影响，主要是对多巴胺甲基丙烯酰胺的加入时间和加入方式的探究。本发明的第三目的是提供该温敏性材料在收获培养细胞中的应用。
技术方案：本发明所述一种温敏性材料，所述温敏性材料是包括以N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰胺为原材料，通过自由基沉淀聚合法制备得到的微凝胶。
其中，所述微凝胶的平均粒径在37℃时为50-90nm。
本发明所述的温敏性材料的制备方法，包括以下步骤：
将N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、多巴胺甲基丙烯酰胺、促进剂和表面活性剂溶解到水中，在氩气保护下加热搅拌反应，加入引发剂，继续反应，透析，将获得的溶液冻干，得到白色的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)微凝胶。
其中，交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。
其中，促进剂为四甲基乙二胺。
其中，表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
其中，引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾。
其中，N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、多巴胺甲基丙烯酰胺、促进剂、表面活性剂和引发剂的质量比为100：1：(0.1-10)：2.9：12.9。
其中，在氩气保护下加热搅拌反应时的温度为65-80℃，反应时间为30-60min，加入引发剂后继续反应的时间为4-6h。
其中，在氩气保护下加热搅拌反应时的搅拌速率为200-600rpm。
其中，多巴胺甲基丙烯酰胺的制备方法，包括以下步骤：
将十水硼酸钠溶于水中，加入碳酸氢钠，搅拌，在冰浴条件下通入氩气搅拌反应，分数次加入盐酸多巴胺，在氩气保护下搅拌，加入甲基丙烯酸酐的四氢呋喃溶液，继续搅拌反应，调节反应液pH，移除冰浴，恢复室温后继续反应，在反应的过程中保证反应体系pH≥9，反应结束后加入乙酸乙酯洗涤并萃取多次，离心，收集上清液，在上清液中加入无水硫酸钠，静置，将得到的溶液旋蒸，搅拌条件下将旋蒸后溶液一滴一滴的加入到正己烷中，抽滤，得到沉淀，真空干燥，得到多巴胺甲基丙烯酰胺。
其中，十水硼酸钠、碳酸氢钠、盐酸多巴胺的质量比为8：4：5。
其中，在冰浴条件下通入氩气搅拌反应的时间为30-60min。
其中，盐酸多巴胺与甲基丙烯酸酐的四氢呋喃溶液固液比为0.25-0.5g/mL。
其中，恢复室温后继续反应的时间为12-18h。
其中，调节反应液pH为9。
其中，静置的时间为24-36h。
本发明所述的温敏性材料在收获培养细胞中的应用。
本发明还包括所述温敏性材料在收获培养细胞中的应用方法，包括以下步骤：
(1)二氧化硅玻片的预处理：使用等离子体机处理后，再利用聚乙烯亚胺(PEI)修饰二氧化硅玻片；
(2)将权利要求1或2所述的温敏性材料制成微凝胶溶液，将微凝胶溶液涂覆到预处理过的二氧化硅玻片上，真空干燥，得到涂有温敏性材料的二氧化硅玻片；
(3)将涂有温敏性材料的二氧化硅玻片用于培养细胞。
其中，步骤(1)中，二氧化硅玻片的预处理是将二氧化硅玻片用无水乙醇和超纯水洗涤之后，用等离子体机处理，浸泡PEI溶液中，用清水洗涤，真空干燥之后备用。
其中，用等离子体机处理时，处理时间为1-3min，PEI溶液的浓度为1-2％，PH为5-6。
其中，步骤(2)中，微凝胶溶液的浓度为0.5-1wt％，每0.785cm2的二氧化硅玻片面积旋涂50-100μL的微凝胶溶液。
本发明将多巴胺甲基丙烯酰胺直接与N-异丙基丙烯酰胺在水溶液中共聚时，多巴胺甲基丙烯酰主要分布在最中间，形成壳核结构；本发明探究了多巴胺甲基丙烯酰胺加入的方式对细胞温敏收获的影响，结果表明较晚时间加入多巴胺甲基丙烯酰胺时，由于儿茶酚基团对细胞的粘附作用，细胞不能降温脱附；将多巴胺甲基丙烯酰胺溶解在乙醇中相比，直接加入能够产生更好的温敏细胞收获效果，这是由于直接加入巴胺甲基丙烯酰胺主要存在于微凝胶的中间能更大程度上够促进细胞降温脱附。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：
(1)纯的聚(N-异丙基丙烯酰胺)用于培养细胞，通常需要大于1h，才能够将细胞从基底脱附下来。而本发明聚(N-异丙基丙烯酰胺)的表面性质可以通过与多巴胺甲基丙烯酰胺共聚调节，能够很明显提高其降温温敏细胞收获的效果，因此是一种理想的生物医用材料。
(2)本发明中巴胺甲基丙烯酰胺共聚可以促进细胞在37℃在材料表面的粘附，同时能够缩短细胞在20℃时细胞脱附的时间。
(3)本发明采用的合成原料价格低廉，合成简单，可以进行规模化生产。本发明采用的培养基底的制备方式简便，与其他细胞收获技术相比，可以简化生产的工序。
(4)本发明所得到的细胞培养材料无毒无害生物学相容性好，通过温敏性微凝胶旋涂的二氧化硅玻片表面成功培养细胞，并通过简单的降温使细胞自动从基底上脱落。该细胞收获的方式过程中不使用胰酶，避免了酶解对细胞造成损伤，在最大程度上保留细胞的活力。在细胞的批量生产、干细胞收获、组织工程修复和图案化细胞培养等方面有非常重大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1获得的多巴胺甲基丙烯酰胺1H-HMR光谱图；
图2为实施例1聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)的1H-HMR光谱图；
图3为对比例1聚(N-异丙基丙烯酰胺)的1H-HMR光谱图；
图4为对比例2(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)的1H-HMR光谱图；
图5为实施例1、对比例1和对比例2和对比例3中的材料用于细胞培养获得L929细胞(小鼠成纤维细胞)在降温前后的形态图；
图6为对比例1、实施例1和对比例2获得rBMSCs(大鼠间充质干细胞)细胞在降温前后的形态图。
图7为实施例1、对比例1和对比例2微凝胶在37℃的平均水合粒径图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
以下方式所采用的原料来源说明：N-异丙基丙烯酰胺购于阿拉丁(上海)有限公司；其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
称取8g(20.9mM)十水硼酸钠溶于100mL的超纯水中，再称取4g(47.6mmol)的碳酸氢钠加入其中。用磁力搅拌器充分剧烈搅拌，转入冰浴条件并通入氩气30min。然后分数次加入5g(26.3mmol)的盐酸多巴胺，在氩气的保护下搅拌。随后取5g甲基丙烯酸酐(33.6mmol)加入20mL的四氢呋喃混匀，使用分液漏斗缓慢加入到上述冰浴多巴胺中。使用5mol/L的NaOH将上述溶液的PH调至9.0。移除冰浴，恢复室温反应24h，在反应的过程中保证反应体系PH≥9，且在氩气的氛围下进行。反应结束后加入乙酸乙酯洗涤并萃取多次，离心后获得的上清液收集，加入20g无水硫酸钠静置24h后合并乙酸乙酯。获得的溶液利用旋蒸仪旋蒸至50mL，在磁力搅拌的条件下，将产物溶液一滴一滴的加入到500mL的正己烷中。将正己烷中的溶液抽滤获得沉淀，将沉淀放在真空干燥箱中干燥24h密封备用，从而获得多巴胺甲基丙烯酰胺。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(0.5mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应5h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)微凝胶固体。
将本实施例得到的多巴胺甲基丙烯酰胺和聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)进行1H-HMR分析，结果如图1-2所示，图1为实施例1获得的多巴胺甲基丙烯酰胺1H-HMR光谱图；由图1可以看出，其中a处的三个峰是苯环上的氢的峰，b、c处的峰分别是苯环和酰胺键中间的两个亚甲基上的H，d是酰胺键上的峰，e是甲基上H的峰，f是双键C上H的峰，g是苯环上的酚羟基上的氢。所有不同环境的氢所代表的峰面积积分与分子式中氢元素的组成一致，说明成功合成了多巴胺甲基丙烯酰胺(DMA)的聚合物。图2为实施例1聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)的1H-HMR光谱图；由图2可以看出，a和c处的峰是聚合物主链上的-CH2上的H，e处的峰是N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰-NH上H的峰，f上的峰是-CH上H的峰，d和g处的峰是N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰胺-CH3上H的峰。成功合成了聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)(PNIPAM-DMA)(100:0.5))的聚合物。
将本实施例得到的微凝胶固体用超纯水稀释为0.005wt％，然后利用动态光散射仪测量微凝胶在在37℃的平均粒径，结果如图7所示，本实施例得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)在37℃的平均粒径为64.37nm。
实施例2
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
同实施例1。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(1mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应5h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
实施例3
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
同实施例1。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(2mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应5h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
实施例4
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
同实施例1。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(0.5mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为80℃，转速为300rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应4h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
实施例5
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
同实施例1。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(0.5mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为65℃，转速为250rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应4h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
对比例1
1、聚(N-异丙基丙烯酰胺)的制备
将0.067g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到60mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入300μL 0.0254g的过硫酸铵(370mM)引发反应5h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
2、将聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)涂覆到二氧化硅玻片
将二氧化硅玻片放在旋涂仪上，上面均匀铺展50μL 0.5wt％的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)微凝胶溶液，浸润3min之后再以500rpm旋涂10s，以30000rpm旋涂1min。旋涂后的二氧化硅玻片放在真空干燥箱中加热至120℃ 2h。
将本对比例得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行1H-HMR分析，结果如图3所示，图3为对比例1聚(N-异丙基丙烯酰胺)的1H-HMR光谱图；由图3可以看出，a和c处的峰是-CH2上H的峰，e处的峰是-NH上H的峰，f是g是甲-CH3上H的峰。这表明成功合成了聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM(100))的聚合物。
将得到的微凝胶固体用超纯水稀释为0.005wt％，然后利用动态光散射仪测量微凝胶在在37℃的平均粒径，结果如图7所示，本实施例得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺)在37℃时的平均粒径为85.6nm。
对比例2
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
称取8g(20.9mM)十水硼酸钠溶于100mL的超纯水中，再称取4g(47.6mmol)的碳酸氢钠加入其中。用磁力搅拌器充分剧烈搅拌，转入冰浴条件并通入氩气30min。然后分数次加入5g(26.3mmol)的盐酸多巴胺，在氩气的保护下搅拌。随后取5g甲基丙烯酸酐(33.6mmol)加入20mL的四氢呋喃混匀，使用分液漏斗缓慢加入到上述冰浴多巴胺中。使用5mol/L的NaOH将上述溶液的PH调至9.0。移除冰浴，恢复室温反应24h，在反应的过程中保证反应体系PH≥9，且在氩气的氛围下进行。反应结束后加入乙酸乙酯洗涤并萃取多次，离心后获得的上清液收集，加入20g无水硫酸钠静置24h后合并乙酸乙酯。获得的溶液利用旋蒸仪旋蒸至50mL，在磁力搅拌的条件下，将产物溶液一滴一滴的加入到500mL的正己烷中。将正己烷中的溶液抽滤获得沉淀，将沉淀放在真空干燥箱中干燥24h密封备用。从而获得多巴胺甲基丙烯酰胺。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(0.5mM)(溶解于2mL的无水乙醇中)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到58mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入0.0254g 300μL的过硫酸铵(370mM)引发反应5h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
将本对比例得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)进行1H-HMR分析，结果如图4所示。图4为对比例2聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)的1H-HMR光谱图；由图4可以看出，a和c处的峰是聚合物主链上的-CH2上的H，e处的峰是N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰-NH上H的峰，f上的峰是-CH上H的峰，d和g处的峰是N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰胺-CH3上H的峰。表明成功合成了聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)(100：0.5mM)(PNIPAM-DMA(100：0.5))的聚合物。
将得到的微凝胶固体用超纯水稀释为0.005wt％，然后利用动态光散射仪测量微凝胶在在37℃的平均粒径，结果如图7所示，本实施例得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)在37℃时的平均粒径为63.2nm。
对比例3
1、多巴胺甲基丙烯酰胺的制备
同对比例2。
2、聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的制备
将0.679g N-异丙基丙烯酰胺(100mM)、0.009g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(1mM)、25.8μL促进剂四甲基乙二胺(2.9mM)和0.216g表面活性剂十二烷基硫酸钠(12.6mM)溶解到58mL的超纯水中，放入二颈瓶中，通入氩气30min，设置反应温度为70℃，转速为600rpm。30min后加入300μL的0.0254g过硫酸铵(370mM)引发反应4h。4h后将0.0067g多巴胺甲基丙烯酰胺(0.5mM)(溶解于2mL的无水乙醇中)加入溶液中继续反应1h。反应得到的溶液放在7000Da的透析袋中，在超纯水中透析一周，每日换水至少三次。最后将获得的溶液使用冻干机冻干三天得到白色的微凝胶固体。
实施例6细胞培养和收获
1、二氧化硅玻片的预处理
将直径为1cm厚度为1mm的二氧化硅玻片用无水乙醇和超纯水洗涤之后，再等离子体机处理3min(60w)，使其表面亲水，然后浸泡在1％的PEI(PH 5.4)溶液中两天以上。将浸泡之后的二氧化硅玻片用大量的清水洗涤，真空干燥之后备用。
2、将实施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备温敏性材料涂覆到二氧化硅玻片
将二氧化硅玻片放在旋涂仪上，上面均匀铺展50μL 0.5wt％的实施例1得到的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)微凝胶溶液，浸润3min之后再以500rpm旋涂10s，以30000rpm旋涂1min。旋涂后的二氧化硅玻片放在真空干燥箱中加热至120℃ 2h。采用相同的步骤，将对比例1、对比例2和对比例3得到的温敏性材料涂覆到二氧化硅玻片上。得到4组涂有聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的二氧化硅玻片。
3、将实施例1、对比例1、对比例2和对比例3得到的涂有聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)的二氧化硅玻片分别用紫外灭菌2h，用PBS(1X pH 7.4)冲洗之后放在48孔板中，加入200μL的密度为40000cells/mL的L929(用1640培养基培养)细胞在37℃5％的CO2环境下培养24h。24h之后将1640培养基吸走，每孔加入200μL的4℃的新鲜1640培养基，放在20℃的室温条件下降温30min观察细胞形态的变化。结果如图5所示，图5为实施例1、对比例1、对比例2和对比例3中的材料用于细胞培养获得L929细胞(小鼠成纤维细胞)在降温前后的形态图；结果表明，实施例1和对比例2中材料培养细胞能够实现细胞的降温脱附，而对比例1和对比例3中的材料培养细胞，降温之后细胞的形态没有明显的变化。
图6为实施例1、对比例1和对比例2获得rBMSCs细胞在降温前后的形态图。具体实施步骤与L929细胞培养和降温收获一致，只是将培养基换成DMEM。结果表明，实施例1中材料培养细胞能够实现细胞的降温脱附，而对比例1和对比例2中的材料培养细胞，降温之后细胞的形态没有明显的变化。(其中对比例3由于对L929细胞的效果就比较差所以没有做rBMSCs细胞的实验)。
巴胺甲基丙烯酰胺是一种具有粘附特性的物质，同时其又具有输水性。对比例2中将多巴胺甲基丙烯酰胺溶解在乙醇中与N-异丙基丙烯酰胺共聚时，聚(多巴胺甲基丙烯酰胺)均匀分布在微凝中，由于巴胺甲基丙烯酰胺的疏水性和粘附性，会促进细胞在37℃的粘附，同时能够实现细胞的降温脱附。本申请发明实施例1将多巴胺甲基丙烯酰胺直接与N-异丙基丙烯酰胺在水溶液中共聚时，多巴胺甲基丙烯酰主要分布在最中间，形成壳核结构，这样的结构由于大量的多巴胺甲基丙烯酰胺存在于中间，能够促进细胞的亲疏水的传递，从而促进细胞的脱附。而对比例3将多巴胺甲基丙烯酰胺在最后一小时加入时，聚(多巴胺甲基丙烯酰胺)分布在微凝表面，由于多巴胺甲基丙烯酰胺的粘附特性，限制了聚(多巴胺甲基丙烯酰胺)温敏性，从而细胞无法脱附。

Claims (10)

1.一种温敏性材料，其特征在于，所述温敏性材料是包括以N-异丙基丙烯酰胺和多巴胺甲基丙烯酰胺为原材料，通过自由基沉淀聚合法制备得到的微凝胶。
2.根据权利要求1所述的温敏性材料，其特征在于，所述微凝胶的平均粒径在37℃时为50-90nm。
3.权利要求1或2所述的温敏性材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、多巴胺甲基丙烯酰胺、促进剂和表面活性剂溶解到水中，在氩气保护下加热搅拌反应，加入引发剂，继续反应，透析，将获得的溶液冻干，得到白色的聚(N-异丙基丙烯酰胺co多巴胺甲基丙烯酰胺)微凝胶。
4.根据权利要求3所述的温敏性材料的制备方法，其特征在于，交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，促进剂为四甲基乙二胺，表面活性剂为十二烷基硫酸钠，引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾。
5.根据权利要求3所述的温敏性材料的制备方法，其特征在于，N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、多巴胺甲基丙烯酰胺、促进剂、表面活性剂和引发剂的摩尔比为100：1：0.1-10：2.9：12.9。
6.根据权利要求3所述的温敏性材料的制备方法，其特征在于，在氩气保护下加热搅拌反应时的温度为65-80℃，反应的时间为30-60min，在氩气保护下加热搅拌反应时的搅拌速率为200-600rpm，加入引发剂后继续反应的时间为4-6h。
7.权利要求1或2所述的温敏性材料在收获培养细胞中的应用。
8.一种权利要求7所述温敏性材料在收获培养细胞中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)二氧化硅玻片的预处理：使用等离子体机处理后，再利用聚乙烯亚胺修饰二氧化硅玻片；
(2)将权利要求1或2所述的温敏性材料制成微凝胶溶液，将微凝胶溶液涂覆到预处理过的二氧化硅玻片上，真空干燥，得到涂有温敏性材料的二氧化硅玻片；
(3)将涂有温敏性材料的二氧化硅玻片用于培养细胞。
9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，步骤(1)中，二氧化硅玻片的预处理是将二氧化硅玻片用无水乙醇和超纯水洗涤之后，用等离子体机处理，浸泡PEI溶液中，用清水洗涤，真空干燥之后备用。
10.根据权利要求4所述的温敏性材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，微凝胶溶液的浓度为0.5-1wt％，每0.785cm2的二氧化硅玻片面积旋涂50-100μL的微凝胶溶液。
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