CN103087976A - 一种促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法，该促进细胞贴壁生长的材料包括一可用于细胞培养的固体基质以及一贴附于该固体基质上的贻贝粘蛋白，该制备方法为将贻贝粘蛋白溶液加入到培养容器或悬浮培养载体中，使贻贝粘蛋白自动贴附到固体表面后使用。本发明提供的方法和材料可以促进细胞快速贴壁和爬行，可常温保存，能耐受射线灭菌，可降低培养体系的血清用量，尤其适用于无血清培养环境。

Description

一种促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养材料及制备方法，尤其涉及一种使用贻贝粘蛋白为主要原料制备的促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法。
背景技术
由于动物细胞具有合成和分泌复合蛋白质的能力，动物组织培养在生物技术工业上发挥重要作用。动物细胞培养中，多数细胞的生长具有贴壁依赖特性。涉及贴壁依赖性细胞的哺乳动物细胞培养和分析用容器通常由玻璃或聚合物构成，其经常需要额外的表面处理以允许细胞粘附到容器表面。表面处理方法通常包括物理方法和化学方法。物理处理主要是借助于容器表面的特性，采用射频真空等离子体、直流辉光放电和微波等离子体处理等实现。化学处理通常是在表面施加吸附层，通过吸附、接枝或等离子体聚合技术。改变表面自身组成和化学基团的表面处理已成功用于制备适于培养多种类型哺乳动物细胞的聚合物的固体基底。然而，使用某些类型的哺乳动物细胞如多能干细胞和人胚肾（HEK293）细胞时，弱粘附和培养方面有明显的限制。
对于贴壁难度较大的细胞，在细胞加入培养容器之前，通过使用胞外基质蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸、聚鸟氨酸或聚乙烯亚胺在固体基底表面制备吸附层来促进细胞粘附。然而，制备吸附层很耗时，并且通常得到非无菌的固体基底，其储存寿命比裸露固体基底更短。
另外一种动物细胞的体外培养多采用含血清的培养基进行培养，但成本高，血清成分不明确，不利于下游产物纯化，更重要的是，血清中含有的潜在的病毒（如疯牛病毒）会带来污染等缺点。在无血清的条件下培育的哺乳类动物细胞会丧失细胞贴壁特性，在培养基要添加例如粘连蛋白、胰岛素或转铁蛋白等促进细胞贴壁的成分，否则细胞容易地从载体中脱落下来而无法生长与存活。
中国专利公开号CN1391604中公开了一种用于培养哺乳动物细胞的无血清培养基，该培养基增加大豆水解产物作为无血清动物细胞培养组成，能够起到提高被培养细胞培养稳定性、提高终细胞密度的作用。但大豆水解产物中除蛋白外还含有其他成分，影响细胞的增殖和生长，且给被培养细胞下游产品的分离带来困难。
综上所述，如何制备一种可促进细胞贴壁生长的材料，使其可适用于贴壁难度较高的细胞培养并且可以克服上述现有技术的缺点（制备耗时长、适用性差、成本高、下游产品分离困难等），是本领域亟待解决的问题。
另外，中国专利公开号（CN101348520、CN101348518、CN101585874）以及PCT国际申请号（PCT/CN2012/073167）中所公开的几种分离纯化贻贝粘蛋白的方法，均属于本发明记载的内容。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法，其不但能使细胞快速贴壁、爬行、生长，还具有常温保存、可整体灭菌、操作简易、成本低等优点。
为实现上述目的，本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料，包括：可用于细胞培养的固体基质；以及可贴附于该固体基质上的贻贝粘蛋白。
其中，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
其中，该固体基质为培养容器或悬浮培养载体。
其中，该培养容器为培养板、培养瓶、培养皿或细胞培养反应的插件等。
其中，该悬浮培养载体为微载体、微球或膜片等。
本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配制成一定浓度的溶液，加入到步骤(a)中的该固体基质中，并将其干燥，即形成该促进细胞贴壁生长的材料。
其中，该贻贝粘蛋白可以是溶液也可以是干粉。
其中，该贻贝粘蛋白溶液由酸性、中性或弱碱性溶剂配制。
其中，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
其中，该固体基质为一培养容器或悬浮培养载体。
其中，该培养容器为培养板、培养瓶、培养皿或细胞反应器插件。
其中，该悬浮培养载体为微载体、微球或膜片等。
其中，步骤(b)的干燥方式采用室温晾干或烘干，烘干温度应不使固体基质破坏。
本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配成液体，加入到步骤(a)的该固体基质中，或将固体基质浸润于贻贝粘蛋白溶液中，温浴一段时间将溶液倒出或将固体基质取出后干燥，即形成该促进细胞贴壁生长的材料。
其中，该固体基质为一培养容器或悬浮培养载体。
其中，该培养容器为培养板、培养瓶、培养皿或细胞反应器插件。
其中，该悬浮培养载体为微载体、微球或膜片等。
其中，该贻贝粘蛋白可以是溶液也可以是干粉。
其中，该贻贝粘蛋白溶液由酸性、中性或弱碱性溶剂配制。
其中，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
其中，温浴温度为任意，优选10-40℃。
其中，温浴时间为任意，优选10-60分钟。
本发明提供一种能够促进细胞贴壁生长的培养材料及其制备方法。该培养材料是以固体基质上包被促进细胞贴壁生长的物质贻贝粘蛋白，能促进细胞贴壁爬行生长，具有使细胞贴壁快、爬行快、生长快、可室温保存、可整体灭菌、操作简便、成本低等优点，尤其适用于贴壁难度较高的细胞培养和无血清体系的细胞培养。
本发明所应用的贻贝粘蛋白（Mussel adhesive protein,MAP），也叫紫贻贝足丝蛋白（Mytilus edulis foot protein,Mefp）来自海洋贝类紫贻贝，它有在近海耐受波浪影响的能力，它在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面上，形成抗水的结合，从而将自己固定。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响。以贻贝粘蛋白为原料包被到固体基质表面形成细胞培养材料，能够发挥贻贝粘蛋白促进细胞吸附、耐水、生物相容性好等特点，可使该细胞培养材料具有促贴壁能力强、通用性强、不影响细胞生长及后续处理、使用过程操作简便、成本低等优点。
本发明的细胞培养材料能使干细胞、原代细胞、成骨细胞、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)、幼仓鼠肾细胞(Baby Hamster SyrianKidney,BHK)、小鼠成纤维细胞(L929细胞)、转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞（293细胞）等快速贴壁，迅速爬行生长；基础培养基添加本发明配方成分所培养出的细胞密度可达到与有10%血清培养基相媲美的使用效果，除促贴壁效果好外还可常温保存、能耐受射线灭菌，尤其适用于无血清培养环境。。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1a为本发明实施例1中BEK-21细胞于MAP包被板中培养2小时后生长情况；
图1b为本发明实施例1中BEK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养2小时后生长情况；
图2a为本发明实施例1中BEK-21细胞于MAP包被板中培养12小时后生长情况；
图2b为本发明实施例1中BEK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养12小时后生长情况；
图3a为本发明实施例1中BEK-21细胞于MAP包被板中培养48小时后生长情况；
图3b为本发明实施例1中BEK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养48小时后生长情况；
图4a为本发明实施例2中BHK-21细胞于MAP包被板中培养2小时后生长情况；
图4b为本发明实施例2中BHK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养2小时后生长情况；
图5a为本发明实施例2中BHK-21细胞于MAP包被板中培养12小时后生长情况；
图5b为本发明实施例2中BHK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养12小时后生长情况；
图6a为本发明实施例2中BHK-21细胞于MAP包被板中培养48小时后生长情况；
图6b为本发明实施例2中BHK-21细胞于空板（无MAP包被）中培养48小时后生长情况；
图7a为本发明实施例3中间充质干细胞于MAP包被板中培养2小时后生长情况；
图7b为本发明实施例3中间充质干细胞于空板（无MAP包被）中培养2小时后生长情况；
图8a为本发明实施例3中间充质干细胞于MAP包被板中培养12小时后生长情况；
图8b为本发明实施例3中间充质干细胞于空板（无MAP包被）中培养12小时后生长情况；
图9a为本发明实施例4中Vero细胞于MAP包被微载体上培养24小时后生长情况；
图9b为本发明实施例4中Vero细胞于空白微载体上培养24小时后生长情况；
图10为本发明的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法流程图（一）；
图11为本发明的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法流程图（二）。
具体实施方式
本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料及其制备方法，其不但能显著促进细胞贴壁生长，还具有操作简易、成本低的优点。为使本领域技术人员更了解本发明，以下结合附图和具体实施例来对本发明进行说明，但以下所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明不以此为限。
本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料，包括：一可用于细胞培养的固体基质；以及一贴附于该固体基质上的贻贝粘蛋白，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
该固体基质可为一培养容器或一悬浮培养载体，培养容器可以是培养板、培养瓶、培养皿或其他能用于组织细胞培养的容器，悬浮培养载体可以是微载体、微球、膜片或其他等效替换。
请参考图10，如图所示，本发明提供一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配成液体，加入到步骤(a)中的该固体基质中，并将其干燥；即形成该促进细胞贴壁生长的材料。
其中，该贻贝粘蛋白可以是溶液也可以是干粉。
其中，该贻贝粘蛋白溶液由酸性、中性或弱碱性溶剂配制。
其中，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。该固体基质为一培养容器或悬浮培养载体，例如可为培养板、培养瓶、培养皿或其他能用于组织细胞培养的容器，亦可为微载体、微球、膜片等悬浮培养载体。步骤(b)中所述的干燥方式可以采用室温晾干或高温烘干，烘干温度应不能破坏固体基质材料。
本发明还提供一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配成液体，加入到步骤(a)的该固体基质中，或将固体基质浸润于贻贝粘蛋白溶液中，温浴一段时间后将其取出或将液体倒出后干燥，即形成该促进细胞贴壁生长的材料。
其中，该贻贝粘蛋白可以是溶液也可以是干粉。
其中，该贻贝粘蛋白溶液由酸性、中性或弱碱性溶剂配制。
其中，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。该固体基质可为培养板、培养瓶、培养皿或其他能用于组织细胞培养的容器，可为微载体、微球、膜片等悬浮培养载体，也可以是其他等效替换。
其中，温浴温度为任意，优选10-40℃。
其中，温浴时间为任意，优选10-60分钟。
实施例1
取0.68μg/ml的贻贝粘蛋白溶液加入到6孔培养板中，每孔加入量为1.43mL，则每个孔中贻贝粘蛋白的浓度为0.1μg/cm2。将培养板置于烘箱中40℃烘干，备用。
取BEK-21细胞分别于MAP包被板和空板（无MAP包被的对照组）中培养，分别于2、12和48小时观察细胞生长情况，培养基为DMEM，不添加血清。其结果如图1a、1b、2a、2b、3a、3b所示。
与对照相比，加贻贝粘蛋白包被的培养板，2小时后细胞已经贴壁并延展，48小时贻贝粘蛋白包被的培养板细胞已经长成单层。
实施例2
取0.5mg/ml的贻贝粘蛋白溶液加入到6孔培养板中，每孔加入量为1.425mL，则每个孔中贻贝粘蛋白的浓度为75μg/cm2。将培养板置于烘箱中55℃烘干。
取BHK-21细胞分别于MAP包被板和空板（无MAP包被的对照组）中培养，分别于2、12和48小时观察细胞生长情况，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。其结果如图4a、4b、5a、5b、6a、6b所示。
与对照相比，加贻贝粘蛋白包被的培养板，2小时后细胞已经贴壁并延展，48小时贻贝粘蛋白包被的培养板细胞已经长成单层。
实施例3
取贻贝粘蛋白溶液加入底面积25平方厘米的培养瓶中，使贻贝粘蛋白密度达到0.1μg/cm2。将培养板置于烘箱中20℃烘干。
取间充质干细胞分别置于MAP包被板和空板（无MAP包被的对照组）中培养，分别于2和12小时观察细胞生长情况，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。其结果如图7a、7b、8a、8b所示。
与对照相比，加贻贝粘蛋白包被的培养板，2小时细胞已经贴壁延展，12小时后细胞数量增加显著。
实施例4
取贻贝粘蛋白溶液加入悬浮有葡聚糖微载体（Cytodex-3,GE Healthcare）的容器中，使微载体表面的贻贝粘蛋白密度达到1mg/cm2。将培养板置于烘箱中20℃烘干后，灭菌。
取非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）分别置于MAP包被微载体和无MAP微载体上培养，于24小时观察细胞生长情况，培养基为199，添加10%胎牛血清。其结果如图9a、9b示。
与对照相比，加贻贝粘蛋白包被的微载体，24小时细胞已经基本长满微载体表面。
综上所述，本发明提供一种能够促进细胞贴壁生长的培养材料及其制备方法。该培养材料是以固体基质上包被促进细胞贴壁生长的物质贻贝粘蛋白，能促进细胞贴壁生长，具有促贴壁性强、操作简便、成本低等优点，尤其适用于贴壁难度较高的细胞培养。
本发明所应用的贻贝粘蛋白，也叫紫贻贝足丝蛋白，来自海洋贝类紫贻贝。它有在近海耐受波浪影响的能力，在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面上，形成抗水的结合，从而将自己固定。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响。以贻贝粘蛋白为原料包被到固体基质表面形成细胞培养材料，能够发挥贻贝粘蛋白促进细胞吸附、耐水、生物相容性好等特点，可使该细胞培养材料促贴壁能力强、通用性强、不影响细胞生长及后续处理、使用过程操作简便、成本低。
本发明的细胞培养材料能使干细胞、原代细胞、成骨细胞、CHO细胞、BHK细胞、L929细胞、293细胞等快速贴壁，迅速爬行生长；基础培养基添加本发明所培养出的细胞密度可达到与10%血清培养基相媲美的使用效果，除促贴壁效果好外还可常温保存、能耐受射线灭菌，尤其适用于无血清培养环境。。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (14)

1.一种促进细胞贴壁生长的材料，其特征在于，包括：
一可用于细胞培养的固体基质；以及
一可贴附于该固体基质上的贻贝粘蛋白。
2.根据权利要求1所述的促细胞贴壁生长的材料，其特征在于，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
3.根据权利要求1所述的促细胞贴壁生长的材料，其特征在于，该固体基质为一培养容器或一悬浮培养载体。
4.根据权利要求3所述的促细胞贴壁生长的材料，其特征在于，该培养容器为培养板、培养瓶、培养皿或细胞培养反应的插件。
5.根据权利要求3所述的促细胞贴壁生长的材料，其特征在于，该悬浮培养载体为微载体、微球或膜片。
6.一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配成溶液，加入到步骤(a)中的该固体基质中，并将其干燥，形成该促进细胞贴壁生长的材料。
7.根据权利要求6所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
8.根据权利要求6所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该固体基质为一培养容器。
9.根据权利要求8所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该培养容器为培养板、培养瓶、培养皿或细胞反应器插件。
10.根据权利要求6所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，步骤(b)的干燥方式采用晾干或烘干。
11.一种促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供一可用于细胞培养的固体基质及一贻贝粘蛋白；
(b)将该贻贝粘蛋白配成溶液，加入到步骤(a)的该固体基质中，或将步骤(a)的该固体基质浸润于贻贝粘蛋白液体中，温浴，之后将溶液倒出或将固体基质取出后干燥，形成该促进细胞贴壁生长的材料。
12.根据权利要求11所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该贻贝粘蛋白于该固体基质上的分布浓度为0.1μg/cm2-1mg/cm2。
13.根据权利要求11所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该固体基质为一悬浮培养载体。
14.根据权利要求13所述的促进细胞贴壁生长的材料的制备方法，其特征在于，该悬浮培养载体为微载体、微球或膜片。
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