CN115025100A - 有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，有效成分为慧花牡荆苷B，慧花牡荆苷B也可以为唯一有效成分，有效成分可以添加药用辅料制备成制剂，制剂剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液中的一种。

Description

有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，有效成分为慧花牡荆苷B。
背景技术
患有糖尿病的患者中，其微血管并发症，特别是糖尿病肾病(DN)非常普遍。DN的特征是特定的肾脏形态和功能改变。其中，DN的早期表现为肾小球超滤过，肥大，微量白蛋白尿，基底膜增厚和肾小球系膜扩张。晚期DN的特征是肾小球滤过率(GFR)逐渐下降，大量蛋白尿，肌酐清除率下降以及肾小球和肾小管间质纤维化。肾小球系膜细胞是肾小球中的主要细胞群，也是肾小球基质蛋白的主要来源，肾小球系膜细胞的功能障碍与糖尿病肾病的发展密切相关。在发展为明显的肾病的过程中，肾小球系膜细胞会通过凋亡而丢失，从而导致肾功能不全。DN的发展涉及多种致病机制，包括高血糖，高血脂，高血压，蛋白尿，氧化应激，细胞因子和遗传易感性等多种因素可导致糖尿病肾病肾脏损害的进展。棕榈酸(Palmitic acid,PA)是体内游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)组成中最丰富的饱和脂肪酸之一，是饮食的主要成分，也可以从碳水化合物重新合成。众所周知，肾小球系膜细胞对脂毒性敏感，系膜细胞是肾小球系膜的主要成分，也是糖尿病的主要靶点，为了应对糖尿病因素，如高血糖、氧化应激和过量游离脂肪酸(FFAs)，系膜细胞获得激活的表型，然后经历肥大和增殖或发生凋亡，导致肾功能障碍，即脂毒性诱导的系膜细胞凋亡与肾功能衰竭的发生有关。因此，抑制肾小球系膜细胞的脂毒性是防治糖尿病肾病的一条潜在的治疗途径。
发明内容
本发明的目的在于：(1)有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用。(2)有效成分为慧花牡荆苷B。(3)有效成分慧花牡荆苷B添加药用辅料制备成制剂。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，有效成分为慧花牡荆苷B。
所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，慧花牡荆苷B为唯一有效成分。
所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，将有效成分添加药用辅料，制备成剂型。
所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液中的一种。
如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，有效成分慧花牡荆苷B能提高人肾小球系膜细胞的活力。
所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，有效成分慧花牡荆苷B能升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。
所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，有效成分慧花牡荆苷B能减低促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Cleved-caspase3的表达。
慧花牡荆苷B，CAS：11027-63-7，分子式：C22H26O11，分子量：466.439，购于湖北诺克特药业股份有限公司。
附图说明
图1为慧花牡荆苷B对人肾小球系膜细胞活力的影响；
图2为慧花牡荆苷B对人肾小球系膜细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase3的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：取慧花牡荆苷B 20g,加淀粉，制备成片剂。
实施例2：取慧花牡荆苷B 20g,加糊精，制备成颗粒剂。
实施例3：取慧花牡荆苷B 20g,加淀粉，制备成胶囊剂。
实施例4：慧花牡荆苷B对人肾小球系膜细胞活力的影响
4.1人肾小球系膜细胞的培养：于液氮中取出人肾小球系膜细胞(HMC细胞)，快速将其用37℃水浴融化，将完全融化的细胞悬液用移液枪吸入无菌EP管中，加入适量的DMEM低糖培养基，混匀后用低速离心5分钟，吸弃上清液，加入4ml培养基吹打混匀后移入无菌培养瓶，于37℃细胞培养箱中培养。观察细胞生长情况，当细胞密度达70％-80％左右时即可以传代。吸去培养瓶内旧培养液，用无菌PBS洗涤3次，以去除残余的血清。加入1ml0.25％的胰酶细胞消化液，轻摇培养瓶使胰酶充分接触细胞，放入培养箱37℃消化1min，显微镜下观察，当细胞开始皱缩呈现圆颗粒状时，加入含血清的完全细胞培养基以终止消化，吹打下细胞，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入培养液，轻轻吹打细胞至混匀，将混匀后的细胞悬液分装至2-3个培养瓶继续培养。
4.2分组：分为棕榈酸PA模型组(600μmol/L)、正常对照组、治疗组(棕榈酸PA+慧花牡荆苷B，其中棕榈酸PA浓度为600μmol/L，慧花牡荆苷B分别为0，200，400，600，8000，1000μmol/L)。
4.3采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒测定人肾小球系膜细胞活力：取处于对数生长期的HMC细胞，按照4.1的方法消化细胞，用细胞计数仪进行细胞计数，于96孔培养板中以8000个/孔接种HMC细胞，每孔体积100ul，并在板四周边缘孔中加入200ulPBS，待细胞生长至70％时用无血清的DMEM低糖培养基饥饿细胞24小时，同步化细胞后用于实验。按照前面所述分组进行实验。给药干预24h后，配制CCK-8检测液(无血清DMEM低糖培养基：CCK-8原液＝10：1)，弃去原培养液，加入CCK-8检测液，每孔100ul，继续于细胞培养箱中培养1-4h后终止培养，将96孔板于摇床上低速避光振荡10min，以确保96孔板颜色均匀。将96孔板置于酶标仪中，调节波长至450nm处，然后测量每孔的OD值，以此计算每组细胞的存活率。细胞存活率＝(OD给药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)100％。实验中每组设4个复孔，并独立重复3次，见图1。
4.3实验结果：棕榈酸PA干预处理后细胞活力显著降低，表示造模成功，给药后并且随着慧花牡荆苷B浓度的增加，细胞活力逐渐升高。因此说明慧花牡荆苷B能提高人肾小球系膜细胞活力。
实施例5：慧花牡荆苷B对人肾小球系膜细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase3的影响
5.1人肾小球系膜细胞模型建立：人肾小球系膜细胞复苏后用低糖DMEM培养基培养，加10％胎牛血清，1％双抗(青霉素、链霉素)，在37℃、5％CO2条件下培养。细胞生长至约80％融合度时进行传代。将细胞种植于6孔板中，当细胞生长至70％融合度时进行棕榈酸PA(600μmol/L)干预模型建立，更换无糖DMEM培养基，培养6小时。后续根据不同培养条件予加慧花牡荆苷B(终浓度为40ng/ml)，继续培养24小时，并进行相关检测。分为正常培养组(不进行PA处理)、棕榈酸PA组、慧花牡荆苷B组(棕榈酸PA后加慧花牡荆苷B继续培养)，继续培养24小时后进行相关检测。
5.2 Western blot过程
1)制胶：根据目标蛋白分子量配制不同浓度的分离胶及5％浓缩胶；
2)上样：胶凝固后，拨去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，每个泳道10ìL变性蛋白样品；
3)电泳：恒压80V，电泳跑胶30min，当出现72KDa时，将电压调至120V，再跑胶约50min，待溴芬蓝到达分离胶底部时，电泳停止；
4)切胶：根据marker位置，切出目的蛋白分子胶条；
5)转膜：目的分子胶条处于负极侧，PVDF膜位于正极侧，4℃，电流300mA，转膜90min；
6)封闭：转膜结束后，TBST润洗PVDF膜一次，然后浸泡于封闭液(5％脱脂牛奶+TBST)中，室温，摇床振荡孵育1h；
7)一抗孵育：封闭液稀释抗体，将封闭好的PVDF膜放入抗体孵育盒中，每个条带加入2mL按比例稀释后的抗体，4℃条件，水平摇床振荡孵育过夜；
8)二抗孵育：PVDF膜室温复温30min，TBST洗膜3次，510min/次。用封闭液稀释相应二抗，室温孵育1h。
9)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；
10)显色：用Millipore公司的Immobilon Western Chemiluminescent HRPSubstrate试剂盒进行显色，使用化学发光成像仪进行化学发光；
11)用Image J分析蛋白条带的灰度值，统计分析。
5.3结果：WB检测显示，与Control组比，在PA的作用下，HMC细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2含量降低，促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Cleved-caspase3的含量增加，PA诱导人肾小球系膜细胞凋亡，慧花牡荆苷B处理后，抗凋亡蛋白Bcl-2含量升高，促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Cleved-caspase3的含量降低，说明慧花牡荆苷B处理的小胶质细胞可减少PA干预后人肾小球系膜细胞细胞的凋亡，保护肾功能，从而对细胞产生保护作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，有效成分为慧花牡荆苷B。
2.如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，慧花牡荆苷B为唯一有效成分。
3.如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，将有效成分添加药用辅料，制备成剂型。
4.如权利要求3所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液中的一种。
5.如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，有效成分慧花牡荆苷B能提高人肾小球系膜细胞的活力。
6.如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，有效成分慧花牡荆苷B能升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。
7.如权利要求1所述有效成分在制备治疗糖尿病肾病药品中的应用，其特征在于，有效成分慧花牡荆苷B能减低促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Cleved-caspase3的表达。
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CN112336819A (zh) * 2019-08-07 2021-02-09 朱维涛 一种治疗糖尿病及其并发症的中药

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