CN115015554A - 一种高通量3d类器官中蛋白表达的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法，包括以下步骤：(1)培养、收集3D类器官、鉴定类器官、加入胰蛋白酶消化基质胶，PBS洗涤回收细胞；(2)提取3D类器官蛋白，RIPA裂解液与细胞沉淀混合，置于0‑4℃冰浴裂解，并用超声破碎，使样本充分裂解；(3)提取3D类器官蛋白，测定蛋白浓度，浓度大于0.25ng/ul可进行高通量蛋白检测。本发明所述方法可实现类器官微量样本高通量蛋白表达检测，具有节约类器官样本，缩短检测时间，灵敏度高、经济实惠的优点，为类器官的临床应用以及科学研究提供一种新的检测方法。

Description

一种高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法

技术领域

本发明属于生物医药与医学研究领域，具体涉及一种高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法。

背景技术

类器官(Organoids)，属于三维(3D)细胞培养物，其包含代表器官的一些关键特性，与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织结构并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

蛋白质(protein)是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。机体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展都息息相关，因此机体蛋白质表达检测在生命科学以及临床研究中尤为重要。目前的蛋白质传统检测方法主要包括免疫印迹法(Western)和酶联吸附实验(ELISA)，其杂交原理都是抗原抗体识别作用，利用不同抗体分子标记实现蛋白质的检测，具有灵敏度高，特异好的优点。

随着技术的发展及科研的需要，对3D类器官的研究也就越深入，类器官与真实器官具有高度的结构和功能相似性，同时具有简化性及易获得性，是由多体系细胞组成的体外三维培养物，是干细胞驱动而以自组织的方式而构建形成，因此可以用作临床研究中的器官代替品。在培养过程中，细胞在体外生长依赖于细胞黏附和细胞骨架，需要相应环境的支持，促使类器官形成三维特性，通常使用可以支持细胞生长和可以黏附的固体细胞外基质。目前，常用的细胞外基质主要有天然细胞外基质、基质胶、细胞外基质-化学水凝这三类，其中基质胶是使用最为广泛的一种。由此可见，类器官具有培养环境特殊、体积小和内部结构复杂等特点，这些特殊结构和特点，导致在类器官研究中，无法满足传统免疫印迹法(Western)和酶联吸附实验(ELISA)检测蛋白质表达方法实验要求，因此检测3D类器官的蛋白水平表达非常困难，对于高通量蛋白表达检测那更是无法实现，其主要有以下几个问题：

1.培养类器官的样本通常来源都是病人的穿刺或手术的样本，比较稀少和珍贵，组织样本在经过磁珠、流式等方式分离的少量出干细胞，最后培养成数量有限的类器官。经典检测蛋白表达Western和ELISA的实验中，要求至少达到50ng蛋白，才能进行一个指标特定蛋白表达指标的检测，而以96孔培养板为例子，接种5x10⁴个细胞培养D15-D20天的类器官，最多只能提取15-30ng总蛋白，达不到Western和ELISA实验要求。

2.在Western Blot检测方法中，需要将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某一种特定抗原的蛋白质表达，该实验过程中需要24-48小时，才能完成一个抗体指标检测，对于多个蛋白指标的检测，需要重复多次实验，此过程耗时较长，无法实现高通量检测。

3.目前研究中采用毛细管Western来解决微量蛋白表达检测问题，比如Wes全自动蛋白表达分析系统，但此方法体系常应用于组织样本和2D细胞培养中，并不能直接套用于类器官样本中，因为类器官的培养依赖于相应环境细胞外基质的支持，其中基质胶在类器官培养中使用最为广泛，它是由富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出BasementMembrane Matrix基底膜基质胶，主要成分有Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、硫酸肝素糖蛋白、巢蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，基质胶是富含丰富的蛋白，直接采用毛细管Western检测类器官蛋白表达，由于基质胶的影响，会增加本底蛋白总量，导致检测数据不准确，甚至无法检出。

4.在类器官的研究中，去除细胞外基质胶的方法，主要是去除基质胶保留类器官球体，试剂的价格都比较昂贵，并且在裂解过程中需要在4℃反应60-180min，裂解时间过长，不利于大批量的进行实验。

因此在类器官的蛋白表达检测中，基质胶的充分去除、实现微量样本的检测、实验成本的控制、实验过程耗时以及实现高通量检测，都是类器官的蛋白表达检测中需要迫切解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法，该方法实现类器官微量样本高通量蛋白表达检测，具有节约类器官样本，缩短检测时间，灵敏度高、经济实惠的优点，为类器官的临床应用以及科学研究提供一种新的检测方法。

本发明的技术方案是：

高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法，包括以下步骤：

(1)培养、收集3D类器官、鉴定3D类器官模型，加入胰蛋白酶(Trypsin)裂解基质胶，PBS洗涤回收细胞；

(2)提取3D类器官蛋白，RIPA裂解液与细胞沉淀混合，置于0-4℃冰浴中裂解，并用超声破碎，使样本充分裂解；

(3)提取3D类器官蛋白，BCA试剂盒测定样品蛋白浓度≥0.25ng/ul，进行高通量蛋白检测；

步骤(1)中所述3D类器官包括：1)临床样本来源培养的类器官、动物来源培养的类器官、细胞系来源类器以及IPS细胞来源类器官；2)药物刺激类器官和未经药物刺激的类器官；

优选地，所述药物刺激类器官包括：LPS、病毒、药物、多肽等。

步骤(1)中所述3D类器官模型为三维立体的球状结构。

对3D类器官模型验证，包括以下步骤：(i)3D类器官的形态观察；(ii)HE病理染色，鉴定类器官内部的细胞形态与结构；(iii)免疫荧光鉴定3D类器官内部结构的细胞类型。

步骤(1)所述收集类器官样品，包括以下步骤：加入基质胶体积5到10倍胰蛋白酶，37℃消化5-30min，10％血清终止反应并重悬细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

所述步骤(2)中RIPA裂解液是含有2mM的AEBSF(4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride)，蛋白在0-4℃冰浴中裂解，裂解时间为10min-15min，并采用超声再次破碎3-5次，离心，收集上清-80℃冻存。

所述步骤(2)中超声破碎法的方法：在冰上条件下，工作电压400W，超声时间为3s，间隙时间为2s，工作次数为3次。

步骤(2)中的RIPA裂解程度，细胞团状沉淀变成混悬状浊液时，离心后，无肉眼可见的沉淀。

所述步骤(3)中检测，采用试剂盒Jess/Wes Separation Module试剂盒和Wes全自动蛋白表达分析系统。

本发明的有益效果：

本发明首次利用胰蛋白酶消化3D类器官进行基质胶的充分裂解，并且利用Wes全自动蛋白表达分析系统进行微量样本的特定蛋白高通量检测，有以下优点：

1.与目前使用3D类器官回收液相比，本发明采用胰蛋白酶的价格更便宜，100ml的价格为100-200元。其次，胰蛋白酶是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸，是特异性最强的蛋白酶。因此在培养的3D类器官中加入胰蛋白酶后，胰蛋白酶能快速的水解基质胶中的蛋白，只需要5-15min实验时间，而3D类器官回收液的消化比较柔和，则需要30-180min才能完成基质胶的消化。最后，胰蛋白酶在消化的过程中，还能使细胞间的蛋白水解从而使细胞离散，即能把类器官的3D结构消化为离散的单细胞状态，可以回收本底干净的细胞样品，然而类器官回收液，只能消化基质胶中的蛋白，并不能消化类器官的3D结构，达到离散细胞的状态。总之采用胰酶消化回收3D类器官样本便宜实惠、耗时短、消化效果好、回收的样本本底干净等优点，能有效防止了因为基质胶蛋白引起的蛋白表达的无法检出、错误检测、假阳性、本底表达高的问题，能使检测的数据更能说明科学问题。

2.本发明利用Wes全自动蛋白表达分析系统可以实现类器官微量样本的同时测定多个特定蛋白表达，达到蛋白高通量检测的需求，具有需要样本更少，操作时间更短、结果更好的优点

3.在分子生物蛋白表达检测实验中，Western Blot是公认的经典实验方法，但在该实验操作过程中会接触大量的有毒有害试剂，如SDS-PAGE、甲醇、丙烯酰胺等，并且还需要摸索转膜的实验条件，步骤繁琐，消耗时间很多，数据结果稳定性不好等问题；本发明采用Wes全自动蛋白表达分析系统，不接触有毒有害试剂，具有使用安全、利于环保的优点，可以更好保护工作人员的健康安全，并且避免了难控的转膜条件，以及复杂的数据分析等缺点。

附图说明

图1为小鼠来源肺组织类器官的分离培养示意图；

图2为类器官的培养与鉴定；

图3为类器官蛋白提取示意图；

图4为高通量检测3D类器官蛋白表达实验步骤；

图5为小鼠来源3D类器官高通量蛋白表达检测实验结果

图6为临床肺腺癌3D类器官高通量蛋白表达检测实验结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

一.试剂

1、试剂：EpCAM(Abcam，货号：ab187276)；

Dispase(品牌：Corning Biocoat，货号：354235)；

LysoTracker(life technologies，货号：L7526)

Mouse Embryonic Fibroblast(MEF)培养基(R&D,货号：AR005)

Matrigel(Biocoat，货号：354234)

DNA酶Ⅰ(sigma，Catalog Number：D-5025)

12-230kDa Jess/Wes Separation Module,8x25capillary cartridges 12-230kDa Wes分离试剂盒(ProteinSimple,货号：SM-W004)

胰蛋白酶(GIBCO,货号：R001100)

2、样品来源：C57BL/6小鼠购买于中国人民解放军陆军特色医学中心动物中心；肺腺癌临床样本来源于中国人民解放军陆军特色医学中心胸外科。

二.实施例

实施例1 C57BL/6小鼠肺组织AEC2s细胞分选及3D类器官的培养

(1)取6-8周龄C57BL/6小鼠肺组织，延气管注射10U/mLDispase酶1ml，37℃水浴消化45min。

(2)眼科剪剪碎组织，玻璃移液管重悬细胞悬液，使用200目过滤筛过滤悬液，1000rpm离心5min。

(3)弃上清，留细胞沉淀，加入2-5ml红细胞裂解液，室温裂红5min，然后1000rpm离心5min。

(4)弃上清，细胞沉淀加入2ml含有2％血清的HBSS重悬，加入等体积LysoTrackerGreen DND-26(100nM/ml)，37℃孵育45min，HBSS洗涤2次，1000rpm离心5min。

(5)加入直标抗体EpCAM,冰上孵育20min，HBSS洗涤2次，1000rpm离心5min，HBSS(2％血清)重悬细胞沉淀，200mu过滤筛过滤细胞悬液。

(6)上述细胞悬液进行LysoTracker⁺EpCAM⁺流式细胞分选，分选结束后离心机1000rpm离心5min。

弃上清，首先加培养基重悬细胞沉淀，细胞浓度为1.5x10⁵个/ml，然后细胞悬液与基质胶(Matrigel)1:1混合，最后取100ul混合物接种于96孔板培养，隔天更换培养基并观察生长状态，细胞分离步骤参见图1。

注：上述所有步骤均在无菌环境中操作，且消化所需要的酶提前37℃预热。

实施例2 肺类器官的培养与鉴定

(1)C57BL/6小鼠的肺类器官培养至第5、10、15天时，将其放置在带有Olympus DP71照相系统的Olympus IX 71显微镜下观察并拍照，结果如图2(类器官的生长规律)，从图中可以看出ACE2s细胞增值分化形成的肺类器官，呈球形结构，随着培养时间的增加，球体直径逐步增大。

(2)培养第15天的类器官，制备石蜡切片，进行HE染色，结果如图2(HE染色)，从图中可以看出由ACE2s细胞培养的肺类器官内部结构，主要是有实心球体结构和空心囊状结构构成。

(3)肺类器官石蜡切片，进行SPC和aqp5免疫荧光染色检测，结果如图2(免疫荧光鉴定)，从图中可以看出由ACE2s细胞培养的肺类器官中，均有SPC和aqp5阳性的细胞。

实施例3 肺类器官样本的细胞裂解与蛋白提取(参见图3)

(1)培养15天的肺类器，药物刺激(药物刺激为100ng/ml LPS，刺激时间为0h、12h、24h、48h)，去除培养基，PBS洗涤3次。

(2)加入胰蛋白酶(胰蛋白酶的体积为基质胶体积的5-10倍)，消化5min，加入等体积含有10％血清的培养基终止消化，吸取细胞悬液1000rpm离心5min，PBS洗涤3次，离心，尽量去除上清，只留细胞沉淀。

(3)加入100ul RIPA蛋白裂解液，所述RIPA蛋白裂解液为含有2mM蛋白酶抑制剂AEBSF(4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride)，0-4℃冰浴中裂解15min，超声再次破碎3-5次，12000rpm，4℃离心10min，轻轻吸取上清，-80℃冻存。

(4)采用BCA法测定蛋白浓度。

实施例4 类器官高通量蛋白检测

(1)BCA测定各组样本蛋白浓度后，根据试剂盒(ProteinSimple，货号SM-W004)的操作步骤，参见图4。

(2)C57BL/6小鼠类器官样本高通量检测结果如图5，从图中实验结果可见，LPS刺激肺类器官0h、12h、24h、48后wnt通路的激活与刺激时间呈正相关，由细胞膜表达的LRP6入细胞质，在通过P-β-caterin入核，最后lef1表达升高。

实施例5 临床样本肺类器官的分离与培养

(1)临床样本来源中国人民解放军陆军特色医学中心胸外科手术室，四例病例分别处于肺腺癌I期，II期，III期，IV期，均为肺腺癌手术切除肺组织样本，取癌旁体积大小为2-3cm³，转移至超净台中，PBS洗涤3次，每次3min。

(2)洗涤后的组织置于小烧杯中，眼科剪剪碎肺组织，加入10U/mLDispase酶5ml，37℃水浴消化45min。

(3)1640培养基重悬细胞悬液，使用200目过滤筛过滤，1000rpm离心5min。

(4)弃上清，留细胞沉淀，加入2-5ml红细胞裂解液，室温裂红5min，然后1000rpm离心5min。

(5)首先加培养基重悬细胞沉淀，稀释细胞浓度为1.5x10⁵个/ml，然后细胞悬液与基质胶(Matrigel)1:1混合，最后取100ul混合物接种于96孔板培养，隔天更换培养基并观察生长状态。

实施例6

肺腺癌患者癌旁手术样本肺类器官培养与鉴定同实施例2，肺腺癌患者癌旁手术样本肺类器官细胞裂解与蛋白提取同实施例3，肺腺癌患者癌旁手术样本类器官蛋白高通量蛋白检测如实施例4，结果如图6，从图中可知，不同肿瘤时期中，肺泡上皮ACE2s细胞类器官中，wnt通路中激活有差异，如细胞质中的GSK3β变化虽然不大，但是P-GSK3β、Axin2、MMP7却随着肿瘤进程而表达增加。

Claims (9)

1.一种高通量3D类器官中蛋白表达的检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)培养、收集3D类器官，进行3D类器官模型鉴定，加入胰蛋白酶(Trypsin)裂解基质胶，PBS洗涤回收细胞；

(2)提取3D类器官蛋白，RIPA裂解液与细胞沉淀混合，置于0-4℃冰浴中裂解，并用超声破碎，使样本充分裂解；

(3)提取3D类器官蛋白，BCA试剂盒测定样品蛋白，浓度≥0.25ng/ul进行高通量蛋白检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述3D类器官包括：1)临床样本来源培养的类器官、动物来源培养的类器官、细胞系来源类器以及IPS细胞来源类器官；2)药物刺激类器官和未经药物刺激的类器官；

优选地，所述药物刺激类器官包括：LPS、病毒、药物、多肽等。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述3D类器官模型为三维立体结构。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对3D类器官模型验证，包括以下步骤：(i)3D类器官的形态观察；(ii)HE病理染色，鉴定类器官内部的细胞形态与结构；(iii)免疫荧光鉴定3D类器官内部结构的细胞类型。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述收集类器官样品，包括以下步骤：加入基质胶5到10倍体积的胰蛋白酶，37℃消化5-30min，10％血清终止反应并重悬细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中RIPA裂解液是含有2mM的蛋白酶抑制剂，蛋白在0-4℃冰浴中裂解，裂解时间为10min-15min，并采用超声破碎3-5次，离心，收集上清-80℃冻存。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超声破碎的方法：工作电压400W，超声时间为3s，每次间隔时间为2s。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的RIPA裂解程度，细胞团状沉淀变成混悬状浊液时，离心后，无肉眼可见的沉淀。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中检测，采用试剂盒Jess/WesSeparation Module试剂盒和Wes全自动蛋白表达分析系统。

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