CN115015424A - 一种高效液相色谱指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents

一种高效液相色谱指纹图谱构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱指纹图谱构建方法及其应用，属于化学检测技术领域。本发明公开的沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法针对含有多种活性物质的沙蒜软胶囊可实现同步的样品活性物质提取，相比于现有技术有所简化，后续高效液相色谱检测的效率显著提升，可实现沙蒜软胶囊的短时活性成分整体质量监测控制及评价。

Description

一种高效液相色谱指纹图谱构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱指纹图谱构建方法及其应用。
背景技术
CN 113662923 A公开了一种沙蒜软胶囊及其制备方法，该产品由沙棘籽油、大蒜油、银杏叶提取物等组分混合配制得到，其含有黄酮类、大蒜素、维生素E、植物甾醇类等多种活性物质，具有显著的降血脂功效。
现阶段工业生产中，对于这种保健品中多种活性成分的鉴定及阶段性监控具有重要意义，以活性成分为基础构建药品的指纹图谱可保障保健品在大批量生产时仍具备稳定性，从而把控生产质量。传统工艺中，对药品(或保健品)指纹图谱的构建往往需要采用多种检测手段才能实现，以沙蒜软胶囊为例，现有技术中NY/T 3950-2021规定植物源性食品中10种黄酮类化合物的测定需要使用高效液相色谱串联质谱法进行，再进行指纹图谱的构建；NY/T 1800-2009公开了大蒜及制品中大蒜素的测定采用气相色谱法测定；GB5009.82-2016公开食品中维生素A、D、E的测定采用液相色谱发测定；GB/T39995-2021公开甾醇类物质的测定，需要使用高效液相色谱串联质谱法等。这些方法需要多次将沙蒜软胶囊处理并检测单类活性物质，检测周期长，对于药品工业化生产时的质量把控及工艺调整具有严重的局限性。同时，对于诸如维生素E这类特殊的活性成分的检测，还其需要经历皂化、提取、洗涤、浓缩等多个前处理步骤后才能进行色谱测定，耗费成本高且操作繁琐。
现有技术中急需一种可同步检测沙蒜软胶囊多种活性成分，可实现其活性成分整体质量监测控制及评价的指纹图谱构建方法。
发明内容
基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，该方法针对沙蒜软胶囊的7种活性成分：槲皮素、异鼠李素、山奈素、大蒜素、维生素E、谷甾醇、豆甾醇可实现同步提取，相比于现有技术有所简化，后续高效液相色谱法检测效率显著提升；同时本发明还针对得到的提取待测样品的高效液相色谱检测方法进行了优化，检测结果准确度更高，可实现沙蒜软胶囊的短时活性成分整体质量监测控制及评价。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：将沙蒜软胶囊待测样品以无水乙醇溶解并超声提取后，加入提取液混合均匀，在98～100℃下水浴回流30～60min，随后经冷却、稀释、过滤，得到样品待测液；所述提取液为盐酸溶液与甲醇的混合溶液，所述甲醇与盐酸溶液的体积之比为(2.5～3.5)：1；
(2)高效液相色谱检测：配制参照物溶液，将参照物溶液和样品待测液进行高效液相色谱检测；所述参照物溶液包括槲皮素溶液、异鼠李素溶液、山奈素溶液、大蒜素溶液、维生素E溶液、谷甾醇溶液、豆甾醇溶液；
(3)比较样品待测液和参照物溶液的色谱图，对沙蒜软胶囊待测样品进行定性或定量分析。
在对沙蒜软胶囊样品进行前期提取处理时，由于沙蒜软胶囊等这类药品(或保健品)中含有多种不同性质的活性物质，需要针对这些物质采用特定的提取方式进行前处理提取，本发明对于样品先进行无水乙醇超声提取，随后采用特殊的提取液进行回流提取，通过两步法可有效提取出沙蒜软胶囊中的大蒜素、维生素E、槲皮素、山奈素、异鼠李素、豆甾醇以及谷甾醇这7种关键活性物质，两步流程缺一不可；同时，发明人还对回流提取时的提取液组成进行了效果考究，实验发现，随着盐酸溶液和甲醇的配比发生变化，各活性物质的提取效果也直接发生变化，若配比不当，可能还会破坏其中的活性物质，而只有在两者体积比保持在(3.5～4.5):1时，样品的提取效果可保持优异。
优选地，所述步骤(1)中沙蒜软胶囊待测样品以无水乙醇溶解时沙蒜软胶囊待测样品的质量与无水乙醇的体积之比为(0.8～1.2)g：(8～12)mL，超声提取时的时间为12～18min。
采用上述优选的配比及条件对待测样品进行第一步超声无水乙醇提取，可有效将样品中的大蒜素、维生素E、豆甾醇、谷甾醇等几种极性相似活性物质提取高效出来。
优选地，所述提取液中，盐酸溶液为盐酸的水溶液，所述盐酸溶液中盐酸的质量分数为25％，甲醇与盐酸溶液的体积之比为4：1。
更优选地，沙蒜软胶囊待测样品的质量与提取液的体积之比为(0.8～1.2)g：(23～27)mL。
发明人发现，当提取液的两种组分配比中甲醇含量较多时，由于甲醇仅能提取游离的黄酮类物质，槲皮素、山奈素等活性物质的提取效果较弱；随着盐酸溶液的含量增多，由于天然的黄酮类物质以黄酮苷存在，而黄酮苷在盐酸的作用下水解为游离黄酮类物质，可被甲醇充分提取，然而由于大蒜素、维生素E等活性物质在酸性环境下不稳定甚至被破坏，因此盐酸溶液的含量过多也会造成提取效率的降低。经发明人实验筛选，以两种提取成分体积比为4:1时样品的各活性物质的综合提取效率最高。
更优选地，所述步骤(1)中水浴回流的时间为30min。
在上述优选条件下，待测样品的目标活性物质提取效率最高，在30min水浴回流处理后的提取程度已经趋于稳定，因此高效液相色谱的检测效率考虑，以30min处理时间最佳。
优选地，所述步骤(1)中稀释时所用稀释溶液为甲醇。
优选地，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的色谱柱为C18色谱柱。
优选地，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的流动相条件为：
以甲醇为流动相A，以质量含量为0.4～0.8wt％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～5min，流动相A与流动相B的体积比为40:60；5～7min，流动相A与流动相B的体积比渐变至50:50；7～20min，流动相A与流动相B的体积比保持50:50不变；20～22min，流动相A与流动相B的体积比渐变至60:40；22～30min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；30～35min，流动相A与流动相B的体积比渐变至85:15；35～45min，流动相A与流动相B的体积比保持85:15不变；45～50min，流动相A与流动相B的体积比渐变至95:5；50～60min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；60～62min，流动相A与流动相B的体积比渐变至100:0；62～88min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；88～90min，流动相A与流动相B的体积比渐变至40:60。
优选地，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的UV检测波长为204nm、240nm、360nm。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的，流动相流速为0.8～1mL/min。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的流动相流速为1mL/min。
发明人实验发现，当洗脱流速在0.8～1mL/min时，活性物质可以达到理想的流动分离效果，而流速为1mL/min时，流动分离效果更佳，且洗脱耗时更短。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的UV检测波长设置条件为：0～30min，波长设置为360nm；30～51min，波长设置为240nm；51～88min，波长设置为204nm，88～90min设置为360nm。。
当待测样品进行前处理得到待测溶液后，得到高精密度、高准确性以及高稳定性的液相色谱检测结果还需要搭配特定的色谱条件。发明人发现，在进行梯度洗脱时，流动相A和B的洗脱程序不同，样品各活性物质的分离度也不同，而若选用洗脱程序不当，则容易造成活性组分的分离度差，指纹图谱准确率低；同时，洗脱时流动相的组成及洗脱流速也会对结果造成影响，需要综合考虑色谱测试时的条件。经试验筛选，以上述测试条件可有效提升液相色谱检测结果的准确性，将其进一步构建指纹图谱可实时用于对于诸如沙蒜软胶囊这种富含多种活性物质的保健品的生产和保藏、使用时监控及评价当中。
更优选地，所述高效液相色谱检测时的色谱柱柱温为35℃。
优选地，所述步骤(2)中配置参照物溶液的具体步骤为：分别取槲皮素、异鼠李素、山奈素、大蒜素、维生素E、谷甾醇、豆甾醇溶解于甲醇中，定容，分别得到槲皮素、异鼠李素、山奈素、大蒜素、维生素E、谷甾醇、豆甾醇的参照物溶液。
更优选地，所述步骤(2)中配置参照物溶液的步骤为：称取10.28mg槲皮素、11.4mg异鼠李素、9.87mg山奈素、81.39mg大蒜素、59.97mg维生素E、20.1mg谷甾醇、10.56mg豆甾醇分别置于100mL容量瓶中加入甲醇溶解，摇匀，定容，依次得到浓度为102.8μg/mL的槲皮素参照物溶液、浓度为114μg/mL的异鼠李素参照物溶液、浓度为98.7μg/mL的山奈素参照物溶液、浓度为813.9μg/mL的大蒜素参照物溶液、浓度为599.7μg/mL的维生素E参照物溶液、浓度为201μg/mL的谷甾醇参照物溶液、浓度为105.6μg/mL的豆甾醇的参照物溶液。
对于参照物溶液的配制，可以采用上述优选的技术方案进行实施例，但并不局限于此，也可采用可获得相同性质的参照物溶液的方法制备获得，在实际配制时，对于沙蒜软胶囊这一检测对象，可以采用不同活性物质对应的原料进行参照物溶液的配制，也可以直接采用商业标准对照品作为参照物溶液进行使用。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的流动相B为质量含量为0.4wt％磷酸水溶液。
发明人经过实验发现，当流动相B中磷酸的质量含量提升，洗脱后检测得到的液相色谱图中的基线波动降低，质量含量达到0.4wt％时，活性成分在洗脱时已经可以达到较好的分离程度，在液相色谱图中各特征峰的分离度最好；而进一步提升磷酸的浓度，各特征峰的分离度略微下降，同时也不利于色谱柱的清洁和回收。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时色谱柱的规格为5μm×4.6mm×250mm。
优选地，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时UV检测波长的设置条件为：0～30min，波长设置为360nm；30～51min，波长设置为240nm；51～88min，波长设置为204nm，88～90min设置为360nm。
本发明的另一目的在于提供了所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法在构建沙蒜软胶囊指纹图谱中的应用。
本发明的再一目的在于提供所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法在沙蒜软胶囊的整体质量监测控制及评价中的应用。
本发明所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法进一步应用于构建指纹图谱，相比于传统技术方案对各活性物质进行逐个图谱的构建更加具有实用性和高效性，该指纹图谱实时性高，可有效利用于产品在规模生产、保藏及使用时的整体质量监测控制及评价中，同时，所述方法针对沙蒜软胶囊这一对象的适用性和专一性高。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，该方法针对含有多种活性物质的沙蒜软胶囊可实现同步活性物质提取，相比于现有技术有所简化，后续高效液相色谱检测效率显著提升；同时针对高效液相色谱检测时的实验条件进行特定优化，所得结果准确率高，可实现沙蒜软胶囊的短时活性成分整体质量监测控制及评价。
附图说明
图1为本发明实施例1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱及相关空白对照及参照物图谱；
图2为采用本发明实施例1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法针对同一待测样品进行检测所得到的液相色谱图谱；
图3为本发明实施例1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱的加标前后对照图；
图4为采用本发明实施例1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法针对14批次待测样品检测所得到的液相色谱图谱；
图5为采用实施例1、对比例1和对比例2所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱对照图；
图6为采用实施例1、对比例3～5所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱对照图；
图7为采用实施例1、对比例6所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱对照图；
图8为采用实施例1、实施例5所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱对照图；
图9为采用实施例1、实施例4和对比例7所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法得到的液相色谱图谱对照图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施、对比例所设计的实验试剂及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂及仪器。
实施例1
本发明所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法的一种实施例，所述方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：取20粒完美(中国)有限公司生产的沙蒜软胶囊挤出内容物并精确称取1g置于平底烧瓶中，以10mL无水乙醇溶解并超声提取15min后，加入25mL提取液A混合均匀，在98～100℃下水浴回流处理30min，随后冷却至室温，转移稀释至50mL容量瓶用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm尺寸的滤膜快速过滤，得到样品待测液；所述提取液为盐酸水溶液(质量分数25％)与甲醇的混合溶液，甲醇与盐酸溶液的体积之比为4：1；
(2)高效液相色谱法检测：
(2.1)配制参照物溶液：称取10.28mg槲皮素、11.4mg异鼠李素、9.87mg山奈素、81.39mg大蒜素、59.97mg维生素E、20.1mg谷甾醇、10.56mg豆甾醇分别置于100mL容量瓶中加入甲醇溶解，摇匀，定容，依次得到浓度为102.8μg/mL的槲皮素参照物溶液、浓度为114μg/mL的异鼠李素参照物溶液、浓度为98.7μg/mL的山奈素参照物溶液、浓度为813.9μg/mL的大蒜素参照物溶液、浓度为599.7μg/mL的维生素E参照物溶液、浓度为201μg/mL的谷甾醇参照物溶液、浓度为105.6μg/mL的豆甾醇的参照物溶液。
(2.2)将参照物溶液和样品待测液进行高效液相色谱检测；所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱(5μm×4.6mm×250mm)；
流动相：以甲醇为流动相A，以质量含量为0.4wt％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件如下表1；
表1
Figure BDA0003687328410000081
Figure BDA0003687328410000091
DAD检测器检测波长如下表2；
表2
波长变更时间(min) 波长(nm)
0 360
30 240
51 204
88 360
流速：1mL/min；
柱温：35℃。
同时，所述色谱测试时设置空白对照溶剂的阴性对照液，测试谱图如图1所示；可以看出，空白溶剂对特征峰无干扰，可以明显看出对应活性物质的特征峰，同时，也能看出谱图中也含有7个未知成分的特征峰。
为了验证所述方法的精密度，对同一原料按照相同方法制备额外7份(1～7号)待测样品，参照图1中参照物溶液的保留时间确认7份样品的对应共有含量，通过峰面积计算样品中洗脱的7种目标活性成分含量的RSD(％)(n＝7)，结果如表3所示，可以看出，各活性成分的RSD值均小于10％，表明实施例1所述方法重复性好，精密度高。同时，7份样品的测试谱图如图2所示，可以看出，除了7中目标活性物质的特征峰，另外7个未知物质也具有稳定性，可以定义所述未知物质为样品中的特有成分。
表3
Figure BDA0003687328410000101
进一步地，通过对待测溶液加标回收试验考察所述方法的准确度：取50粒完美(中国)有限公司生产的沙蒜软胶囊取出内容物放入适量的参照物溶液，根据上述制样方法平行制备7份待测溶液(1～7号)，根据上述相同色谱条件进行相同测试；计算各参照物的加标回收率，结果如表4所示，其中取2号样品进行加标前后图谱拟合对比，结果如图3所示。从表4可以看出，各参照物的加标回收率均达到了90～110％，根据GB/T 27417的要求，所述方法得到的液相色谱图准确度高。
表4
Figure BDA0003687328410000102
基于上述情况，对完美(中国)有限公司生产的沙蒜软胶囊收集14批不同批次产品(S1～S14)进行相同方法的检测，结果如图4所示，该批次液相图谱中共标识出14个共有峰，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，以中位法生成对照指纹图谱，以1号样品为参考图谱计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果得知14批产品液相色谱图的相似度＞0.95，批次液相色谱质量高，该批次沙蒜软胶囊的液相色谱可以作为标准指纹图谱使用切指纹图谱构建成功。
实施例2
本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(1)中水浴回流处理的时间为45min。
实施例3
本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(1)中水浴回流处理的时间为60min。
实施例4
本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2.2)中流动相B为质量含量为0.8wt％磷酸水溶液。
实施例5
本实施例与实施例1的差别仅在于，步骤(2.2)中流速为0.8mL/min。
对比例1
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述步骤(1)样品前处理的步骤为：取20粒完美(中国)有限公司生产的沙蒜软胶囊挤出内容物并精确称取1g置于平底烧瓶中，以10mL无水乙醇溶解并超声提取15min后，转移稀释至50mL容量瓶用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm尺寸的滤膜快速过滤，得到样品待测液；所述提取液A为盐酸水溶液(质量分数25％)与甲醇的混合溶液，甲醇与盐酸溶液的体积之比为4：1。
对比例2
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述步骤(1)样品前处理的步骤为：样品前处理：取20粒完美(中国)有限公司生产的沙蒜软胶囊挤出内容物并精确称取1g置于平底烧瓶中，加入提取液A混合均匀，在98～100℃下水浴回流处理30min，随后冷却至室温，转移稀释至50mL容量瓶用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm尺寸的滤膜快速过滤，得到样品待测液；所述提取液A为盐酸水溶液(质量分数25％)与甲醇的混合溶液，甲醇与盐酸溶液的体积之比为4：1。
对比例3
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述提取液为纯甲醇。
对比例4
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述提取液为8.33mL盐酸水溶液(质量分数25％)与16.67mL甲醇的混合溶液。
对比例5
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述提取液为12.5mL盐酸水溶液(质量分数25％)与12.5mL甲醇的混合溶液。
对比例6
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述流动相梯度洗脱条件如下表；
Figure BDA0003687328410000121
Figure BDA0003687328410000131
对比例7
本对比例与实施例1的差别仅在于，所述流动相B为纯水。
试验例1
为了考究本发明所述待测溶液在制备时水浴回流时间的优选性，按照实施例1～3的方法各平行进行高效液相色谱法的检测，对所得高效液相色谱图通过峰面积计算样品中洗脱的7种目标活性成分含量的RSD(％)，结果如表5所示，可以看出，水浴回流时间从30～60min范围内制备得到的待测溶液进行检测的结果中各目标活性成分的RSD值均小于10％，表明在所述条件下的高效液相色谱检测方法稳定性均良好，测试结果均较稳定。
表5
Figure BDA0003687328410000132
试验例2
为了验证本发明所述高效液相色谱检测方法对于样品前处理步骤的优选性，采用实施例1、对比例1和对比例2的方法平行各制备两份待测溶液进行实施例1相同条件的高效液相色谱检测，结果如表6和图5所示，可以看出，采用实施例1方法得到的待测溶液中各活性物质的提取效率均较高，而对比例1方法对于槲皮素、山奈素和异鼠李素的提取效率较差，而对比例2方法则对于豆甾醇和谷甾醇的提取效率较差。
表6
Figure BDA0003687328410000141
试验例3
为了验证本发明所述高效液相色谱检测方法中提取液的组成的合理性，以实施例1、对比例3、对比例4和对比例5的方法各制备一份待测溶液进行实施例1相同条件的高效液相色谱检测，结构如表7和图6所示。可以看出，对比例3所述的提取液为纯甲醇，待测溶液中槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量不足，提取效率较差；采用甲醇和盐酸溶液的体积比为4:1时的提取液对应的实施例1方法提取得到的待测溶液中各活性物质的提取效率均较高，这是因为甲醇只能提取游离的黄酮类物质，而在酸性环境下，样品中的黄酮苷将水解为黄酮类物质，从而充分被甲醇提取；然而，对比例4和5两个方法的检测结果中各活性物质的提取含量反而不如实施例1方法，其中大蒜素、维生素E、豆甾醇以及谷甾醇提取效率显著降低，主要是由于这几种组分在酸性环境本身不稳定，随着酸性提升，这几种组分会受到破坏；同时，在提取液总添加量一定的情况下，盐酸溶液的增多也相对减少了甲醇的比例，进而导致其他活性物质的提取效率也变低。
表7
Figure BDA0003687328410000142
Figure BDA0003687328410000151
试验例4
为了验证本发明所述高效液相色谱检测方法中高效液相色谱检测时洗脱条件的优选性，将实施例1和对比例6的检测结果进行对比，结果如图7所示。可以看出，采用非优选的对比例6方法中的洗脱条件对同一待测溶液进行处理，其得到的高效液相色谱图难以分离出上述提及的14种特有物质(包括7种目标活性物质和7种未知特有成分)，同时分离效果较差；而实施例1方法得到的谱图中各特征峰的分离效果较高。
试验例5
为了验证本发明所述高效液相色谱检测方法中高效液相色谱洗脱时流速选择的优选性，将实施例1和实施例5的检测结果进行对比，结果如图8所示。从图8可以看出，两种方法选用的流动相流速不同，但均能实现较为优异的分离效果(各分离度均大于1.5)，如表8所示；其中当流速为1mL/min时，部分目标活性物质对应特征峰的分离度下限更高(各特征峰的最小分离度为2.71)，因此采用实施例1对应的流速其效果最佳。
表8
Figure BDA0003687328410000152
Figure BDA0003687328410000161
试验例6
为了验证本发明所述高效液相色谱检测方法中高效液相色谱洗脱时流动相选择的优选性，将实施例1、实施例4和对比例7的检测结果进行对比，结果如图9和表9所示。从图9和表9可以看出，采用纯水作为流动相B进行洗脱时，在50min后得到的曲线基线波动较大，特征峰间的分离度不佳，而实施例1和实施例4的效果远优异于对比例7，说明当流动相B选择为浓度0.4～0.8％的磷酸水溶液可有效洗脱分离出14种特有物质，其中实施例1所述条件得到的结果中部分特征峰的分离度下限更高，以0.4％的磷酸水溶液作为流动相B的分离效果更好。
表9
Figure BDA0003687328410000162
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (15)

1.一种沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：将沙蒜软胶囊待测样品以无水乙醇溶解并超声提取后，加入提取液混合均匀，在98～100℃下水浴回流30～60min，随后经冷却、稀释、过滤，得到样品待测液；所述提取液为盐酸溶液与甲醇的混合溶液，所述甲醇与盐酸溶液的体积之比为(2.5～3.5)：1；
(2)高效液相色谱检测：配制参照物溶液，将参照物溶液和样品待测液进行高效液相色谱检测；所述参照物溶液包括槲皮素溶液、异鼠李素溶液、山奈素溶液、大蒜素溶液、维生素E溶液、谷甾醇溶液、豆甾醇溶液；
(3)比较样品待测液和参照物溶液的色谱图，对沙蒜软胶囊待测样品进行定性或定量分析。
2.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述提取液中，盐酸溶液为盐酸的水溶液，所述盐酸溶液中盐酸的质量分数为25％。
3.如权利要求2所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述提取液中，所述甲醇与盐酸溶液的体积之比为4：1。
4.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，沙蒜软胶囊待测样品的质量与提取液的体积之比为(0.8～1.2)g：(23～27)mL。
5.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，水浴回流的时间为30min。
6.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，稀释时所用稀释溶液为甲醇。
7.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，配置参照物溶液的步骤为：分别取槲皮素、异鼠李素、山奈素、大蒜素、维生素E、谷甾醇、豆甾醇，溶解于甲醇中，定容，分别得到槲皮素、异鼠李素、山奈素、大蒜素、维生素E、谷甾醇、豆甾醇的参照物溶液。
8.如权利要求7所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，槲皮素参照物溶液中，槲皮素的质量浓度为102.8μg/mL；异鼠李素参照物溶液中，异鼠李素的质量浓度为114μg/mL；山奈素参照物溶液中，山奈素的质量浓度为98.7μg/mL；大蒜素参照物溶液中，大蒜素的质量浓度为813.9μg/mL；维生素E参照物溶液中，维生素E的质量浓度为599.7μg/mL；谷甾醇参照物溶液中，谷甾醇的质量浓度为201μg/mL；豆甾醇参照物溶液中，豆甾醇的质量浓度为105.6μg/mL。
9.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，沙蒜软胶囊待测样品以无水乙醇溶解时沙蒜软胶囊待测样品的质量与无水乙醇的体积之比为(0.8～1.2)g：(8～12)mL，超声提取时的时间为12～18min。
10.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的色谱柱为C18色谱柱。
11.如权利要求10所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的色谱柱柱温为35℃，色谱柱规格为5μm×4.6mm×250mm。
12.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的流动相条件为：
以甲醇为流动相A，以质量含量为0.4～0.8wt％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～5min，流动相A与流动相B的体积比为40:60；5～7min，流动相A与流动相B的体积比渐变至50:50；7～20min，流动相A与流动相B的体积比保持50:50不变；20～22min，流动相A与流动相B的体积比渐变至60:40；22～30min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；30～35min，流动相A与流动相B的体积比渐变至85:15；35～45min，流动相A与流动相B的体积比保持85:15不变；45～50min，流动相A与流动相B的体积比渐变至95:5；50～60min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；60～62min，流动相A与流动相B的体积比渐变至100:0；62～88min，流动相A与流动相B的体积比保持不变；88～90min，流动相A与流动相B的体积比渐变至40:60。
13.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高效液相色谱检测时的UV检测波长为204～360nm。
14.如权利要求1所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的，流动相流速为0.8～1mL/min。
15.如权利要求11所述沙蒜软胶囊的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中高效液相色谱检测时的UV检测波长设置条件为：0～30min，波长设置为360nm；30～51min，波长设置为240nm；51～88min，波长设置为204nm，88～90min设置为360nm。
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