CN109444281B - 一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法 - Google Patents

一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及物质成分检测技术领域，尤其是涉及一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法。所述检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：乙醇水溶液作为提取溶剂提取青钱柳叶得到青钱柳叶提取物，青钱柳叶提取物与DPPH自由基进行避光反应，分别测定反应前后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图，对比反应前后的高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分。本发明通过对青钱柳叶进行提取，采用体外自由基的检测方法，能够有效地在体外环境下寻找青钱柳叶粗提物中的抗氧化物质，使青钱柳活性物质的研究具有一定的导向性，结合制备色谱还可进行活性物质的分离、纯化。

Description

一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法
技术领域
本发明涉及物质成分检测技术领域，尤其是涉及一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法。
背景技术
青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)为胡桃科青钱柳属的单种属植物，是冰川四纪幸存下来的珍稀树种之一，目前仅存于中国。现代药理研究发现，青钱柳叶含有许多对人体有益的生理活性物质，如酚类、萜类、多糖等成分。并且，青钱柳叶中含有抗氧化物质，具有较强的清除氧化自由基的活性。但要明确其抗氧化活性的效应成分则需进行繁琐的分离纯化、结构鉴定工作，并分别验证其活性，且有些天然产物的活性在分离纯化的过程中容易降解，不利于青钱柳叶中抗氧化成分的快速筛选。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，能够清晰、直观的检测出青钱柳叶中抗氧化成分，为筛选药效指标成分及其质量评价提供一定的指导作用。
一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：
乙醇水溶液作为提取溶剂提取青钱柳叶得到青钱柳叶提取物，青钱柳叶提取物与DPPH自由基进行避光反应，分别测定反应前后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图，对比反应前后的高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分。
在对成分复杂的中药材提取物的抗氧化活性进行评价时，难点在于无法准确的得知粗提物中何种化合物具有抗氧化活性。抗氧化剂主要是通过清除机体内过多的自由基来阻断其过氧化的过程，抗氧化剂消除自由基的能力能够反映出其抗氧化活性的强弱。本发明通过对青钱柳叶进行提取，采用体外自由基的检测方法，能够有效地在体外环境下寻找青钱柳叶粗提物中的抗氧化物质，使活性物质的研究具有一定的导向性，从而进行后续的活性物质的分离、纯化。
优选的，高效液相色谱的检测条件包括：流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为0.8-1.2mL/min，检测波长为360nm，柱温为40-45℃。
黏度较小的乙腈-水体系作为流动相时基线稳定、分离度好、峰形对称，因此乙腈-水体系更适合对化学成分复杂的青钱柳叶粗提物进行分析，且乙腈的末端吸收要低于甲醇的末端吸收。流动相中加入体积分数0.01％的甲酸可以减小拖尾、改善峰形，提高分离度。
青钱柳叶的醇提物中化学成分较多且部分物质结构相近，采用等度洗脱方式很难将色谱峰分开，因此液相色谱的分离采用梯度洗脱，根据谱图的成图效果及色谱峰的分离情况，对梯度洗脱时流动相的起始浓度、流动相的混合浓度、梯度时间进行不断调整，以提高峰的分离度。
优选的，梯度洗脱程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A。
优选的，色谱柱为ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm。更优选的，色谱柱品牌为Waters X-bridge ODS C18。
Sunfire ODS C18柱的吸附力较弱，达不到完全分离要求；而Phenomenex ODS C18柱的吸附力过强，虽能满足完全分离要求，但出峰时间晚，分离时间较长；而Waters公司的X-bridge ODS C18柱不仅能够完全分离，而且峰形尖锐且基线更为平稳、出峰时间更早，所以优选X-bridge ODS C18柱进行后续的分离分析。
DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是目前使用最为广泛的一种自由基，采用DPPH-HPLC法能够快速找到青钱柳叶粗提物中具有抗氧化活性的成分，为以后的分离纯化起指导作用，而且省时省力、操作简单易控、结果直观明了、响应快速准确、具有良好的重现性，为抗氧化成分的快速、准确筛选提供了可能。
优选的，避光反应的条件包括：温度为37±2℃，反应时间为30±5min。
优选的，乙醇水溶液作为提取溶剂，对青钱柳叶进行超声辅助提取。超声辅助提取能够促进青钱柳叶中活性成分的浸出，并且采用超声提取能够明显缩短提取时间，大大提高了提取的效率，超声提取更为简单、便捷。
优选的，超声辅助提取的条件包括：超声功率为400-600W，提取温度为60-80℃，提取时间为30-60min；优选的，超声功率为500W，提取温度为70℃，提取时间为45min。
超声时间的长短会影响到液相色谱图中色谱峰的响应值(峰面积)，在研究过程中发现，时间少于45min时，色谱峰的峰面积随超声提取时间的延长而增加，然而45min之后，色谱峰峰面积基本不再增加，超声辅助提取45min作为最优提取时间。
优选的，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80％，优选70％。优选的，提取时，料液比为1﹕(20-30)，优选为1﹕25。采用特定的提取料液比，对青钱柳叶进行提取，得到的提取物中有效成分含量高。
在研究过程中，以水、35％乙醇作为提取溶剂，色谱图上部分色谱峰响应值相对较低，而以甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂时，各峰在色谱图上的响应值均较低，无法有效提取出活性成分，不能准确鉴别筛选青钱柳叶中的抗氧化成分。通过优化提取条件，采用上述乙醇水溶液作为提取溶剂，能够有效提取出青钱柳叶中的活性成分，色谱峰信息丰富，且这些色谱峰的响应值(峰面积)也多高于其他几种不同水-醇比例的溶剂，峰型和分离度也较好，因此70％乙醇作为提取溶剂能更全面反映青钱柳叶化合物的整体成分，更能符合质量控制和筛选的要求。
在提取前，优选先对青钱柳叶进行脱脂脱色预处理，如采用石油醚作为溶剂在80±5℃的温度范围内，对青钱柳叶进行回流提取脱脂脱色。脱脂脱色晾干后，再进行超声辅助提取。通过脱脂脱色预处理，避免青钱柳叶中的其它成分的干扰，影响抗氧化成分的筛选准确度。
优选的，青钱柳叶提取物与DPPH比例为1L﹕(0.05-0.15)mol，优选为1L﹕(0.1-0.15)mol，更优选为1L﹕0.1mol。
优选的，DPPH配制成溶液与青钱柳叶提取物反应。更优选的，将DPPH配制成溶液的方法包括：将DPPH固体溶解于甲醇中，配制成0.05-0.15mmol/L的溶液，优选0.1mmol/L。在实际使用中，现用现配，4℃冰箱中避光保存。
DPPH的浓度影响对青钱柳叶中抗氧化成分的鉴别，如果浓度过低，DPPH仅与青钱柳叶粗提物中一种或少量的抗氧化成分作用，并且峰面积变化小，不能全面反映青钱柳叶粗提物的抗氧化成分，无法准确鉴别其抗氧化成分；如果浓度过高，残留于反应后的青钱柳叶提取物中的DPPH会影响色谱结果，影响分离度。
优选的，青钱柳叶中抗氧化成分包括槲皮素-3-O-葡糖糖醛酸苷、槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。
优选的，将抗氧化成分通过高效液相色谱-质谱联用鉴定结构。质谱条件包括：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；质量扫描范围：m/z 100-1200；碰撞气：氮气；干燥气流速：10.0L/min；干燥气温度：300℃；雾化气压力：30psi；毛细管电压：4.0kV；碰撞电压：60V；母离子的MS2碰撞能：50V。
本发明通过DPPH-HPLC检测抗氧化成分后，对抗氧化成分进行高效液相色谱-质谱联用鉴定结构，得出乙醇水溶液中抗氧化成分为上述几种抗氧化成分。
优选的，将抗氧化成分对应的标准品，配制系列浓度，在相同高效液相色谱检测条件下，分别测定不同浓度的标准品所对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。通过标准曲线对抗氧化成分进行定量，从而实现定量检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用DPPH自由基与青钱柳叶提取物反应，通过高效液相色谱测定反应前后的色谱图，对比反应前后色谱图中峰面积的变化，可以快速筛选出具有抗氧化活性的成分，为后续分离纯化起指导作用；
(2)本发明通过选用特定提取条件有助于提高青钱柳叶中活性成分的提取效率，同时通过优化色谱检测条件，改善检测峰型和分离度，使得检测结果更能全面准确反映青钱柳叶中抗氧化成分，符合质量控制和筛选要求；并且，青钱柳叶提取物中各成分之间干扰性小，测试结果准确；
(3)本发明对青钱柳叶中抗氧化成分进行鉴定和定量检测，在所测浓度范围内每种抗氧化物质均呈良好的线性关系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的高效液相色谱图；其中，图1(A)为实施例1中反应前的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；图1(B)为实施例1中反应后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；图1(C)为实施例4中反应后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；
图2为本发明各实施例中反应后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；其中，(A)为实施例5，(B)为实施例1，(C)为实施例6；
图3为本发明各实施例反应前的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；其中，(A)为实施例7、(B)为实施例8、(C)为实施例1；
图4为本发明实施例1、比较例1-4反应前的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图；其中，(A)为比较例1、(B)为比较例2、(C)为比较例3、(D)为比较例4。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：
(1)称取干燥的青钱柳叶粉末0.8g，用滤纸包好后置于索氏提取器中用石油醚在80℃水浴锅中回流提取脱脂脱色3h，取出滤纸包后将药渣常温晾干以体积分数为70％的乙醇水溶液为提取溶剂超声提取；挥干后的药渣按料液比1﹕25加入20mL体积分数为70％的乙醇水溶液，于温度为70℃、超声功率为500W的超声清洗机中，提取45min，待超声结束后取出样品冷却至室温补重至原重，滤液在10000rpm转速下离心10min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到青钱柳叶提取物；
(2)取适量DPPH固体溶解于甲醇中，配制成浓度为0.1mol/L的DPPH溶液，取步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和DPPH溶液按1﹕1体积比混合，在37℃条件下避光反应30min；
(3)分别将步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和步骤(2)中反应后的青钱柳叶提取物注入高效液相色谱仪中进行检测，分别得到反应前后的青钱柳叶提取物的色谱图；
检测条件为：色谱柱为Waters X-bridge ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm；流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为360nm，柱温为45℃；进样量：10μL；
梯度洗脱程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A；
(4)对比反应前后高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分；测试结果如图1(A)和图1(B)，从图中可知，F1、F2、F3和F6的峰面积减少，F4、F5和F7的峰面积不变，对应的F1、F2、F3和F6为抗氧化成分。
分别对各峰对应的成分进行高效液相色谱-质谱联用结构鉴定，得到F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7分别为槲皮素-3-O-葡糖糖醛酸苷、槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡糖糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷；说明了四种槲皮素苷类与DPPH发生了反应，对DPPH自由基有较强的清除作用，而三种山奈酚苷类的黄酮物质没有清除DPPH自由基的能力。其中，质谱条件包括：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；质量扫描范围：m/z 100-1200；碰撞气：氮气；干燥气流速：10.0L/min；干燥气温度：300℃；雾化气压力：30psi；毛细管电压：4.0kV；碰撞电压：60V；母离子的MS2碰撞能：50V。
为了进一步对青钱柳叶中抗氧化成分进行定量，将抗氧化成分对应的标准品，配制系列浓度，在相同高效液相色谱检测条件下，分别测定不同浓度标准品所对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。通过峰面积变化确定抗氧化成分后，通过标准曲线对抗氧化成分进行定量。
上述四种抗氧化成分的标准曲线分别为：
槲皮素-3-O-葡糖糖醛酸苷Y＝23,136X-119,324(2.5-600μg/mL，R2＝0.9997，LOD＝40.28ng/mL，LOQ＝128.74ng/mL)；
槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷Y＝20,402X-28,339(2-480μg/mL，R2＝0.9994，LOD＝52.94ng/mL，LOQ＝174.17ng/mL)；
槲皮素-3-O-葡糖糖苷Y＝21,231X+2,369.2(2-180μg/mL，R2＝0.9997，LOD＝58.42ng/mL，LOQ＝192.52ng/mL)；
槲皮素-3-O-鼠李糖苷Y＝15,638X-21,262(2-240μg/mL，R2＝0.9993，LOD＝62.48ng/mL，LOQ＝199.32ng/mL)。
实施例2
本实施例的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：
(1)称取干燥的青钱柳叶粉末0.8g，用滤纸包好后置于索氏提取器中用石油醚在80℃水浴锅中回流提取脱脂脱色3h，取出滤纸包后将药渣常温晾干以体积分数为70％的乙醇水溶液为提取溶剂超声提取；挥干后的药渣按料液比1﹕25加入20mL体积分数为70％的乙醇水溶液，于温度为70℃、超声功率为500W的超声清洗机中，提取45min，待超声结束后取出样品冷却至室温补重至原重，滤液在10000rpm转速下离心10min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到青钱柳叶提取物；
(2)取适量DPPH固体溶解于甲醇中，配制成浓度为0.15mol/L的DPPH溶液，取步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和DPPH溶液按体积比为1﹕1混合，在37℃条件下避光反应30min；
(3)分别将步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和步骤(2)中反应后的青钱柳叶提取物注入高效液相色谱仪中进行检测，分别得到反应前后的青钱柳叶提取物的色谱图；
检测条件为：色谱柱为Waters X-bridge ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm；流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为360nm，柱温为45℃；进样量：10μL；
梯度洗脱程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A；
(4)对比反应前后高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分。测试结果与实施例1中类似，F1、F2、F3和F6的峰面积减少，F4、F5和F7的峰面积不变，对应的F1、F2、F3和F6为抗氧化成分。
实施例3
本实施例的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：
(1)称取干燥的青钱柳叶粉末0.8g，用滤纸包好后置于索氏提取器中用石油醚在80℃水浴锅中回流提取脱脂脱色3h，取出滤纸包后将药渣常温晾干以体积分数为70％的乙醇水溶液为提取溶剂超声提取；挥干后的药渣按料液比1﹕25加入20mL体积分数为70％的乙醇水溶液，于温度为70℃、超声功率为500W的超声清洗机中，提取45min，待超声结束后取出样品冷却至室温补重至原重，滤液在10000rpm转速下离心10min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到青钱柳叶提取物；
(2)取适量DPPH固体溶解于甲醇中，配制成浓度为0.1mol/L的DPPH溶液，取步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和DPPH溶液按体积比为1﹕2混合，在37℃条件下避光反应30min；
(3)分别将步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和步骤(2)中反应后的青钱柳叶提取物注入高效液相色谱仪中进行检测，分别得到反应前后的青钱柳叶提取物的色谱图；
检测条件为：色谱柱为Waters X-bridge ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm；流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为360nm，柱温为45℃；进样量：10μL；
梯度洗脱程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A；
(4)对比反应前后高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分。测试结果与实施例1中类似，F1、F2、F3和F6的峰面积减少，F4、F5和F7的峰面积不变，对应的F1、F2、F3和F6为抗氧化成分。
实施例4
本实施例的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，包括如下步骤：
(1)称取干燥的青钱柳叶粉末0.8g，用滤纸包好后置于索氏提取器中用石油醚在80℃水浴锅中回流提取脱脂脱色3h，取出滤纸包后将药渣常温晾干以体积分数为70％的乙醇水溶液为提取溶剂超声提取；挥干后的药渣按料液比1﹕25加入20mL体积分数为70％的乙醇水溶液，于温度为70℃、超声功率为500W的超声清洗机中，提取45min，待超声结束后取出样品冷却至室温补重至原重，滤液在10000rpm转速下离心10min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到青钱柳叶提取物；
(2)取适量DPPH固体溶解于甲醇中，配制成浓度为0.05mol/L的DPPH溶液，取步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和DPPH溶液按体积比为1﹕1混合，在37℃条件下避光反应30min；
(3)分别将步骤(1)中得到的青钱柳叶提取物和步骤(2)中反应后的青钱柳叶提取物注入高效液相色谱仪中进行检测，分别得到反应前后的青钱柳叶提取物的色谱图；
检测条件为：色谱柱为Waters X-bridge ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm；流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为1mL/min，检测波长为360nm，柱温为45℃；进样量：10μL；
梯度洗脱程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A；
(4)对比反应前后高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分；反应后高效液相色谱图如图1(C)所示，从图中可知，仅F1的峰面积减少，其它几个峰面积值与反应前测定值相比变化较小。
实施例5
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：超声提取时间为30min，其反应前的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图2(A)所示。
实施例6
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：超声提取时间为60min，其反应前的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图2(C)所示。
从图2中可知，超声时间的长短也会影响到指纹色谱图中色谱峰的响应值(峰面积)，时间少于45min时，色谱峰的峰面积随超声提取时间的延长而增加，然而45min之后，色谱峰峰面积基本不再增加。
实施例7
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：色谱柱为Phenomenex ODS C18，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图3(A)所示。
实施例8
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：色谱柱为Sunfire ODS C18，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图3(B)所示。
从图3中可知，Sunfire ODS C18柱的吸附力较弱，达不到完全分离要求；而Phenomenex ODS C18柱的吸附力过强，虽满足了完全分离要求，分离时间较长；而Waters公司的X-bridge ODS C18柱不仅能够完全分离，而且峰形尖锐且基线更为平稳、出峰时间更早。
比较例1
比较例1参考实施例1的检测方法，区别在于：提取溶剂为水，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图4(A)所示。
比较例2
比较例2参考实施例1的检测方法，区别在于：提取溶剂为35％的乙醇水溶液，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图4(B)所示。
比较例3
比较例3参考实施例1的检测方法，区别在于：提取溶剂为甲醇，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图4(C)所示。
比较例4
比较例4参考实施例1的检测方法，区别在于：提取溶剂为乙酸乙酯，其反应前青钱柳叶提取物的高效液相色谱图如图4(D)所示。
从图4中可知，以水、35％乙醇作为提取溶剂时，色谱图部分色谱峰峰高相对较低，并且水提液中的成分多糖含量高，多糖等大分子成分会干扰本发明中对抗氧化成分的检测；以甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂时，各峰在色谱图上的响应值均较低，实施例1中70％乙醇水溶液作为提取溶剂时，色谱峰信息丰富，且这些色谱峰的响应值(峰面积)也多高于其他几种不同水-醇比例的溶剂，峰型和分离度也较好，能更全面反映青钱柳叶化合物的整体成分，更能符合质量控制和筛选的要求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (13)

1.一种检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
乙醇水溶液作为提取溶剂提取青钱柳叶得到青钱柳叶提取物，所述青钱柳叶提取物与DPPH自由基进行避光反应，分别测定反应前后的青钱柳叶提取物的高效液相色谱图，对比反应前后的所述高效液相色谱图中峰面积的变化，峰面积减少的峰对应的成分即为抗氧化成分；
所述乙醇水溶液作为提取溶剂，对所述青钱柳叶进行超声辅助提取；
所述超声辅助提取的条件包括：超声功率为400-600W，提取温度为60-80℃，提取时间为30-60min；
所述高效液相色谱的检测条件包括：流动相A为0.01％甲酸-乙腈，流动相B为0.01％甲酸-水，梯度洗脱；流速为0.8-1.2mL/min，检测波长为360nm，柱温为40-45℃；
所述梯度洗脱的程序为0-13min，8-19Vol％A；13-28min，19-21Vol％A；28-40min，21-100Vol％A；
所述高效液相色谱的色谱柱为ODS C18，柱长250mm，直径4.6mm，填料粒径5μm。
2.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters X-bridge ODS C18。
3.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述避光反应的条件包括：温度为37±2℃，反应时间为30±5min。
4.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80％。
5.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述提取的料液比为1﹕(20-30)。
6.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述提取的料液比为1﹕25。
7.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，对所述青钱柳叶进行脱脂脱色预处理。
8.根据权利要求7所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述脱脂脱色预处理的方法包括：石油醚作为溶剂，在80±5℃的条件下，对所述青钱柳叶进行索氏回流提取。
9.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述青钱柳叶提取物与所述DPPH的比例为1L﹕(0.05-0.15)mol。
10.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述青钱柳叶提取物与所述DPPH的比例为1L﹕(0.1-0.15)mol。
11.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述青钱柳叶提取物与所述DPPH的比例为1L﹕0.1mol。
12.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，所述青钱柳叶中的抗氧化成分包括槲皮素-3-O-葡糖糖醛酸苷、槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。
13.根据权利要求1所述的检测青钱柳叶中抗氧化成分的方法，其特征在于，将所述抗氧化成分对应的标准品，配制成系列浓度的溶液，在相同高效液相色谱检测条件下，分别测定不同浓度的标准品所对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线；通过标准曲线，计算所述青钱柳叶中抗氧化成分的含量。
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Denomination of invention: A Method for Detecting Antioxidant Components in Cyclocarya paliurus Leaves

Granted publication date: 20220426

License type: Common License

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