CN114994231B - 一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，包括以下步骤：取利福平或利福喷丁原料药，经甲醇和去离子水组成的稀释液溶解后，采用RP固相萃取柱去除杂质，收集第6mL续滤液作为供试品溶液，备用；取空白样品稀释液，然后加入亚硝酸根标准溶液，配制成不同浓度的对照品溶液，备用；将所述供试品溶液和所述不同浓度的对照品溶液在预设的离子色谱条件下分别进行，根据不同浓度的对照品溶液的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和供试品溶液的检测结果计算供试品溶液中亚硝酸根的含量。利用本发明提供的方法测定利福平或利福喷丁中的亚硝酸根，具有良好的线性、准确度、定量限和检测限。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法。
背景技术
遗传毒性杂质(GenotoxicImpurities，GTI)，是指能够直接或间接损伤细胞DNA，造成DNA突变并伴有致癌性危害人类健康的物质。
近年来，药物中发现亚硝胺类遗传毒性杂质事件层出不穷。例如2018年，华海药业在缬沙坦原料药中检测出微量的遗传毒性杂质N-亚硝基二甲胺(NDMA)后。亚硝胺类杂质事件引起了业内的广泛关注。2019年3月，氯沙坦钾中NMBA超出控制限度。同年9月，FDA发布安全警告称，在雷尼替丁中检出遗传毒性杂质NDMA。紧接着FDA又在降糖药二甲双胍中检出微量NDMA。2020年7月，WHO公布赛诺菲公司的利福喷丁中发现的亚硝胺杂质。
遗传毒性杂质会对患者产生极大危害，极微量水平即可诱发DNA突变。因此对遗传毒性杂质的评价和限度控制分析至关重要。从杂质来源看，将杂质完全清除是不可实现的，也没有必要。只有通过合适的分析方法，并掌握杂质的成因才能对杂质的产生进行有效的控制，从而降低患者服用药物时对身体造成的危害，并为企业生产工艺的提升提供改进策略。
亚硝胺类化合物的产生的原因多样，包括药物合成中发生副反应，生成具有遗传毒性的N-亚硝胺类杂质，如仲胺类化合物与亚硝酸等亚硝化试剂相互作用；药物储存过程中发生氧化还原反应，如雷尼替丁中的结构中一个不稳定的二甲氨基，降解产生NDMA等。
根据利福平、利福喷丁与其遗传毒性杂质1-甲基-4亚硝基哌嗪(MNP)、1-环戊基-4-亚硝基哌嗪(CPNP)结构可知，利福平或利福喷丁中亚硝基中N原子有可能来源于活性成分或辅料总残留的亚硝化试剂亚硝酸根离子。因此很有必要对利福平或利福喷丁原料及制剂中的亚硝酸根离子含量进行检测，以确定亚硝胺杂质中N原子的来源，从而可以进行更好的质控。
目前，对于亚硝酸盐的测定通常采取离子色谱法、滴定法、比色法、紫外-可见分光光度法等。其中，离子色谱法具有简便、快速、灵敏、选择性高的特点，因此在药物和食品中亚硝酸检测中使用的较多。而采用传统的离子色谱法对利福喷丁及利福平中亚硝酸盐进行检测，由于利福喷丁和利福平极性较低，在离子色谱的淋洗液洗脱时容易析出并且较难从离子交换柱洗脱下来，从而缩短色谱柱使用寿命，降低灵敏度。而且，亚硝酸根在酸性条件下不稳定，因此也不能采用消解的方法去除基质的干扰。
发明内容
本发明提供了一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法。采用了柱切换基质消除法，建立了离子色谱测定利福平和利福喷丁中亚硝酸根离子的方法。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，包括以下步骤：
(1)样品的提取及净化：取利福平或利福喷丁胶囊内容物，经甲醇和去离子水组成的稀释液溶解后，采用RP固相萃取柱去除基质，收集第6mL续滤液作为供试品溶液，备用；
(2)配制对照品溶液：取空白样品稀释液，然后加入亚硝酸根标准溶液，配制成不同浓度的对照品溶液，备用；
(3)样品分析：将所述供试品溶液和所述不同浓度的对照品溶液在预设的离子色谱条件下分别进行，根据不同浓度的对照品溶液的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和供试品溶液的检测结果计算供试品溶液中亚硝酸根的含量。
采用RP固相萃取柱虽然可以用于去除利福平或利福喷丁胶囊内容物中的基质，但所得续滤液中亚硝根的峰面积普遍低于标准溶液峰面积，且基线不平，从而造成亚硝酸根的含量检测结果不准。本发明的发明人意外发现，当选取第6ml续滤液作为供试品溶液，其中亚硝根的峰面积和标准溶液直接进样的中亚硝酸根离子的峰面积基本一直，且基线平稳。
优选地，上述的测定方法中，步骤(1)中，所述稀释液中，甲醇的体积百分含量为50～54％，最优选为52％。本发明发现，采用上述配比的甲醇和和去离子水组成的稀释液，其极性大小适宜，可以更好地配合RP固相萃取柱去除利福平或利福喷丁胶囊内容物中的基质。
优选地，上述的测定方法中，步骤(1)中，所述利福平或利福喷丁胶囊内容物与稀释液的质量体积比为2～4mg/mL，最优选为3mg/mL。浓度大小直接关系到本发明所得供试品溶液的检测准确度，本发明发现，在上述浓度下，配合本发明收集第6mL续滤液作为供试品溶液的技术方案，可保证检测结果的准确度高。
优选地，上述的测定方法中，步骤(1)中，采用RP固相萃取柱去除基质具体包括：取RP固相萃取柱，依次用甲醇和去离子水活化，用注射器吸取待净化样品溶液并置于RP固相萃取柱上，推动注射器的柱塞杆，收集续滤液。
进一步优选地，用注射器吸取8mL待净化样品溶液，收集第6mL续滤液作为供试品溶液。
优选地，上述的测定方法中，所述预设的离子色谱条件中，色谱柱为AS11-HC阴离子交换色谱柱，柱温为30～40℃，最优选为35℃。
优选地，上述的测定方法中，所述预设的离子色谱条件中，以氢氧化钾溶液作为淋洗液进行梯度淋洗；
所述梯度淋洗的步骤包括：所述供试品溶液注入色谱柱后的0～5min内，以5mmol/L的氢氧化钾溶液淋洗；在5min～18min内，淋洗的氢氧化钾溶液浓度由5mmol/L逐渐增加到25mmol/L；在18min～18.1min内，淋洗的氢氧化钾溶液浓度由25mmol/L减少到5mmol/L；在18.1min～21min内，以5mmol/L的氢氧化钾溶液淋洗。选择上述梯度淋洗程序，可有效分离亚硝酸根与其他杂质峰，提高检测结果的准确度。进一步优选地，所述淋洗液的流速为0.6～1.0mL/min，最优选为0.8mL/min。
本发明所取得的有益效果：
利用本发明的测定方法，可实现快速定量测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的含量，且操作简单。对本发明方法进行考察，经研究，该含量测定方法具有良好的线性、准确度、定量限和检测限。
附图说明
图1为实施例1所提供的空白溶剂色谱图。
图2为实施例1所提供的利福平胶囊供试品溶液色谱图。
图3为实施例1所提供的利福喷丁胶囊供试品溶液色谱图。
图4为试验例2所提供的定量限溶液色谱图。
图5为试验例2所提供的检测限溶液色谱图。
图6为试验例5所提供的线性关系图。
图7为对比例1所提供的利福喷丁胶囊供试品溶液色谱图。
图8为固相萃取柱过滤第6ml续滤液的色谱图。
图9为固相萃取柱过滤第5ml续滤液的色谱图。
图10为固相萃取柱过滤第7ml续滤液的色谱图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1试剂和材料
1.1试剂
亚硝酸根标准溶液：来源于GBTC，批号21D1433；
甲醇：来源于Fisher。
1.2材料
ionex ICS-5000+离子色谱仪(包括EG淋洗液在线发生器、电导检测器、ASRS 300抑制器、AS自动进样器及Chromelon软件)：厂家Thermo，编号AAI758；
Dionex IonPacTM AS11-HC阴离子交换色谱柱：厂家Thermo，编号01903019；
Dionex OnGuardTMⅡRP固相萃取柱：厂家Thermo，编号210522-1-RP。
2溶液配置
利福平胶囊供试品溶液：取本品内容物适量，相当于利福平150mg，置于50ml离心管中，精密加入甲醇26ml，振摇，再精密加入去离子水24ml，振摇10分钟。用10ml注射器吸取利福平溶液8ml，置于活化处理后的固相萃取柱上(依次用甲醇5ml与水10ml冲洗活化)，推动注射器过滤，待续滤液流出，收集第6ml续滤液，作为供试品溶液。
利福喷丁胶囊供试品溶液：取本品内容物适量，相当于利福喷丁150mg，置于50ml离心管中，精密加入甲醇26ml，振摇，再精密加入去离子水24ml，振摇10分钟。用10ml注射器吸取利福喷丁溶液8ml，置于活化处理后的固相萃取柱上(依次用甲醇5ml与水10ml冲洗活化)，推动注射器过滤，待续滤液流出，收集第6ml续滤液，作为供试品溶液。
空白溶液：取溶剂甲醇与去离子水混合配成52％(体积比)的甲醇溶液，作为空白溶液。
对照品溶液：精密称取亚硝酸根标准溶液适量，用空白溶液定量稀释制成1ml中约5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng亚硝酸根的对照品溶液。
3离子色谱条件
采用Dionex IonPacTM AS11-HC阴离子交换色谱柱；
检测器为电导检测器；
检测方式为抑制电导检测；
淋洗液由氢氧化钾淋洗液在线发生器生成，按下表1进行梯度洗脱；柱温为35℃，进样体积为80μl。抑制器采用外接水模式(3mL/min去离子水)。
表1
注：亚硝酸根(NO2-)的保留时间约为13.9分钟。
4样品测定
采用步骤4检测条件测定步骤2配制的不同浓度的对照品溶液，制作标准曲线，再根据标准曲线和供试品溶液的检测结果计算供试品溶液中亚硝酸根的浓度。
试验例1专属性研究
量取空白溶液、利福平胶囊供试品溶液和利福喷丁胶囊供试品溶液各80μL，分别注入离子色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图，图1为空白溶剂的色谱图；图2为利福平胶囊供试品溶液的色谱图；图3为利福喷丁胶囊供试品溶液的色谱图。由结果可知：(1)空白溶剂在亚硝酸根离子的出峰处无干扰；(2)主成分利福平或利福喷丁不干扰杂质测定。
试验例2检测限和定量限研究
灵敏度溶液(检测限溶液)：精密量取亚硝酸根标准溶液适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含5ng亚硝酸根离子的溶液，即得。
定量限溶液：精密量取亚硝酸根标准溶液适量，用甲醇定量稀释制成每1ml中约含10ng亚硝酸根离子的溶液，即得。
精密量取定量限溶液与检测限溶液各80μl注入离子色谱仪，记录色谱图，图4为定量限溶液色谱图；图5为检测限溶液色谱图。结果：(1)定量限溶液中亚硝酸根离子峰的信噪比S/N＝15；(2)检测限溶液亚硝酸根离子峰的信噪比S/N＝5，满足检测灵敏度要求。
表2定量限和检测限结果
试验例3过滤体积的确定
用注射器吸取亚硝酸根标准溶液置处理后的固相萃取柱上，推动注射器过滤，分别取第3ml、4ml、5ml、6ml、7ml续滤液和未过滤的亚硝酸根溶液注入离子色谱仪检测，结果发现仅第6ml收集的续滤液与未过滤的亚硝酸根离子检测结果一致。
试验例4重复性研究
精密量取亚硝酸根浓度100ng/ml的对照品溶液80μl注入离子色谱仪，记录色谱图，重复进样5次，所得峰面积计算相对标准偏差，结果为0.80％，重复性良好。
试验例5线性研究
精密量取亚硝酸根离子溶液浓度范围为5～200ng/ml的对照品溶液各80μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，由溶液浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归。以浓度对峰面积绘制标准曲线，结果如图6所示。结果表明亚硝酸根离子在10～200ng/ml浓度范围内线性关系良好。
试验例6准确度研究
利福平胶囊回收率溶液：精密量取亚硝酸根标准溶液适量，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含1000ng的溶液。
在利福平胶囊中，精密加入回收率溶液，在3mg/ml的利福平溶液中分别加入1μg/ml亚硝酸根标准溶液2.5ml、5ml、7.5ml，使加标终浓度为低(50ng/ml)、中(100ng/ml)、高(150ng/ml)三个浓度。每个浓度平行配制3份，按实施例1的实验条件检测，结果见表3。
表3利福平胶囊前加标回收率汇总(n＝9)
利福喷丁胶囊回收率溶液：精密量取亚硝酸根标准溶液适量，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含1000ng的溶液。
在利福喷丁胶囊中，精密加入回收率溶液，在3mg/ml的利福喷丁溶液中分别加入1μg/ml亚硝酸根标准溶液2.5ml、5ml、7.5ml，使加标终浓度为低(50ng/ml)、中(100ng/ml)、高(150ng/ml)三个浓度。每个浓度平行配制3份，按实施例1的实验条件检测，结果见表4。
表4利福喷丁胶囊前加标回收率汇总(n＝9)
上述试验结果表明，本方法具有良好的线性、准确度、定量限和检测限，本方法能够有效地检测利福平胶囊中的亚硝酸根离子。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：利福喷丁胶囊供试品溶液配制中未经净化，即：取利福喷丁胶囊内容物适量，相当于利福喷丁150mg，置于50ml离心管中，精密加入甲醇26ml，振摇，再精密加入去离子水24ml，振摇10分钟，作为供试品溶液。
图7为对比例1所提供的利福喷丁胶囊供试品溶液色谱图，如图7所示，利福喷丁的本底过高，覆盖了亚硝酸根离子的出峰位置。由结果可知，对于利福霉素类样品无法直接进样，本发明通过RP固相萃取柱对样品进行净化并收集第6mL续滤液作为供试品溶液，可有效去除利福平或利福喷丁基质，同时不影响亚硝酸根离子的检测准确度。
对比例2
分别将试验例6中加标终浓度为50ng/ml的溶液经过固相萃取柱的第2、3、4、5、6ml及第7ml续滤液按照上述方法进样至离子色谱，结果仅第6ml续滤液中亚硝根的峰面积和标准溶液直接进样的中亚硝酸根离子的峰面积基本一致，且基线平稳(参见图8)，而第2-5及7ml续滤液中亚硝根的峰面积低于标准溶液峰面积，且基线不平(参见图9和10)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品的提取及净化：取利福平或利福喷丁胶囊内容物，经甲醇和去离子水组成的稀释液溶解后，采用RP固相萃取柱去除基质，收集第6mL续滤液作为供试品溶液，备用；
(2)配制对照品溶液：取空白样品稀释液，然后加入亚硝酸根标准溶液，配制成不同浓度的对照品溶液，备用；
(3)样品分析：将所述供试品溶液和所述不同浓度的对照品溶液在预设的离子色谱条件下分别进行，根据不同浓度的对照品溶液的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和供试品溶液的检测结果计算供试品溶液中亚硝酸根的含量。
2.根据权利要求1所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀释液中，甲醇的体积百分含量为50～54％。
3.根据权利要求1或2所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述利福平或利福喷丁胶囊内容物与稀释液的质量体积比为2～4mg/mL。
4.根据权利要求1所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用RP固相萃取柱去除基质具体包括：取RP固相萃取柱，依次用甲醇和去离子水活化，用注射器吸取待净化样品溶液并置于RP固相萃取柱上，推动注射器的柱塞杆，收集续滤液。
5.根据权利要求4所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，用注射器吸取8mL待净化样品溶液，收集第6mL续滤液作为供试品溶液。
6.根据权利要求1所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述预设的离子色谱条件中，色谱柱为AS11-HC阴离子交换色谱柱，柱温为30～40℃。
7.根据权利要求1所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述预设的离子色谱条件中，以氢氧化钾溶液作为淋洗液进行梯度淋洗；
所述梯度淋洗的步骤包括：所述供试品溶液注入色谱柱后的0～5min内，以5mmol/L的氢氧化钾溶液淋洗；在5min～18min内，淋洗的氢氧化钾溶液浓度由5mmol/L逐渐增加到25mmol/L；在18min～18.1min内，淋洗的氢氧化钾溶液浓度由25mmol/L减少到5mmol/L；在18.1min～21min内，以5mmol/L的氢氧化钾溶液淋洗。
8.根据权利要求7所述的离子色谱法测定利福平或利福喷丁中亚硝酸根的方法，其特征在于，所述淋洗液的流速为0.6～1.0mL/min。
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