CN114958363A - 靶向高尔基体的红光发射荧光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向高尔基体的红光发射荧光碳点,是以尼罗蓝和苯磺酰胺溶于乙醇和水的混合溶剂中密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末。本发明红光发射荧光碳点在水溶液状态下能够发射645nm的荧光,属于红光发射,以其作为荧光探针,应用于细胞中环氧合酶‑2高度表达的高尔基体的靶向成像,避免了生物体自体发射短波长荧光的干扰,选择性高,具有准确的高尔基体靶向定位效果,适用于组织和活体成像。

Description

靶向高尔基体的红光发射荧光碳点及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物成像技术领域,涉及一种红光碳点,特别是涉及一种能够精准靶向亚细胞器高尔基体的红光碳点,以及该红光碳点的制备方法和应用。
背景技术
高尔基体是合成蛋白质、脂质和碳水化合物等生物大分子,以用于胞外分泌或其他胞内细胞器再次加工的场所。细胞发生病变后过度分泌蛋白和蛋白酶,增加蛋白质分泌的需求,进而影响高尔基体的大小和容量,导致高尔基体肿大。因此,针对高尔基体进行靶向成像,监测其的形态变化,可以实现鉴定细胞是否发生病变的目的,并进而阐明其的生理和病理过程。
但是,大部分用于细胞成像的荧光探针通常都是均匀地分布在细胞内部,无法区分不同的细胞器。
目前常用荧光染料标记法对高尔基体进行靶向成像,如神经酰胺活细胞染料、染色偶联物和抗体等。然而,采用神经酰胺分子染色高尔基体后,需要尽快进行观察,否则其会到达细胞的其他部位;而染色偶联物易光漂白,难以对同一高尔基体进行长时间观察。
因此,亟需开发一种具有稳定荧光性能的高尔基体靶向荧光探针,以能够更有效地监测细胞的动态变化。
碳点因其发射波长可调,以及优越的荧光稳定性、低的细胞毒性和良好的生物相容性,在细胞成像方面有着广泛的应用,并在高尔基体荧光成像领域受到越来越多的关注。
然而,目前大多数的碳点探针由于缺乏靶向配体或被动的靶向性质,导致其在进入细胞后不具有高尔基体靶向性,阻碍了高尔基体的实时、精准观察。为了改善这一问题,CN 114032094A通过官能团继承策略,氮和硫杂原子掺杂策略以及配体-受体主动靶向作用策略,提出了一种新型的、以环氧合酶-2为靶点的高尔基体靶向型碳点探针制备方法,选择对苯二胺和苯磺酰胺为前驱体,通过一步溶剂热法制备得到具备高尔基体靶向能力的橙光发射碳点,其最佳激发波长563nm,最佳发射波长612nm,可以实现高尔基体200min的长时活细胞靶向成像。
尽管如此,由于橙光发射碳点在活体中成像时的发射波长较短,容易受到自体荧光的干扰。因此,探索开发靶向高尔基体型碳点,并促进其发射波长的红移,仍是目前研究人员正在关注的主要内容。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向高尔基体的红光发射荧光碳点,以及该荧光碳点的制备方法,以实现对高尔基体的精确定位。
为实现上述发明目的,本发明提供的靶向高尔基体的红光发射荧光碳点是以尼罗蓝和苯磺酰胺为原料,按照尼罗蓝与苯磺酰胺的摩尔比为1∶10~20溶于乙醇和水的混合溶剂中,密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末。
进一步地,本发明是在160~220℃下进行所述溶剂热反应,以制备得到所述红光发射荧光碳点的。
更具体地,所述溶剂热反应的时间优选为9~15h。
更进一步地,用于制备本发明所述红光发射荧光碳点的原料尼罗蓝与苯磺酰胺的摩尔比优选为1∶15。
本发明制备的红光发射荧光碳点外观为紫色固体粉末,粒径小于5nm,其在固态下无荧光,水溶液状态下能够发射645nm的荧光,具有激发独立特性,属于红光发射。
进而,本发明提供了所述靶向高尔基体的红光发射荧光碳点的一种制备方法,是将尼罗蓝和苯磺酰胺以摩尔比1~10∶20溶于乙醇和水的混合溶剂中得到反应溶液,超声分散均匀,于密闭反应釜中加热至160~220℃进行溶剂热反应9~15h,反应产物经提纯、干燥后得到紫色的碳点固体粉末。
其中,优选地,本发明所述反应溶液的浓度不大于20mg/mL。
更优选地,是将所述反应溶液以频率60kHz的超声波超声分散3~15min,以使原料充分混合均匀。
进一步地,本发明具体是将反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤,再以截留分子量500~1000Da的透析袋透析,以对反应产物进行提纯处理。
提纯后的反应产物浓缩后,经真空冷冻干燥,即可制备得到本发明红光发射荧光碳点固体粉末。
具体地,所述真空冷冻干燥是在真空度2Pa、冷冻温度-80℃下冷冻干燥12~24h。
本发明制备的红光发射荧光碳点可以作为荧光探针,应用于细胞的医学成像中。
进一步地,本发明制备的红光发射荧光碳点可以作为荧光探针,应用于细胞中环氧合酶-2高度表达的高尔基体的靶向成像中。
本发明利用了尼罗蓝自身具有强的共轭和吩噁嗪结构,作为染料具有红光发射和大的吸收系数等特点,以其为原料制备靶向高尔基体的碳点荧光探针,从而促进了碳点的发射波长红移,所制备碳点荧光探针的发射波长645nm,发射光位于红光区,优于目前高尔基体靶向型碳点的发射波长,避免了生物体自体发射短波长荧光的干扰,同时还增加了探针的组织穿透深度,减少了对生物组织的光损伤,适用于组织和活体成像。
本发明利用苯磺酰胺对高尔基体上环氧合酶-2的主动靶向作用,使制备的红光发射荧光碳点通过其表面的磺酰胺基团与环氧合酶-2结合,作为一种高尔基体靶向型碳点荧光探针,选择性高,具有准确的高尔基体靶向定位效果,皮尔森相关系数达到0.87。
本发明制备的碳点荧光探针生物相容性好,200μg/mL浓度下的细胞存活率仍可大于80%。
附图说明
图1是本发明制备红光发射荧光碳点的高分辨透射电子显微镜图像和粒度分布图。
图2是碳点的拉曼光谱图和X射线衍射图谱。
图3是碳点的X射线光电子能谱图。
图4是碳点的紫外吸收光谱、激发光谱和最佳发射光谱图。
图5是碳点的细胞毒性测试结果。
图6是碳点荧光探针的高尔基体靶向标记能力测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明,而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例和应用例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备,其名称和简称均属于本领域内常规的名称,在相关用途领域内均非常清楚明确,本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备,按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例和应用例中使用的各种原料或试剂,并没有来源上的特殊限制,均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
实施例1。
称取尼罗蓝0.1465g,苯磺酰胺0.4715g,加入到20mL乙醇和20mL去离子水的混合溶剂中,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60kHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至190℃反应12h,获得紫红色的溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对溶液产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至60℃旋蒸除去乙醇,浓缩至15mL,停止旋蒸,冷却至室温后,于-80℃冰箱中冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥24h,制备得到紫色的碳点固体粉末,简称为RGCDs。
将少许制备好的碳点固体粉末溶于去离子水中,滴于透射电镜专用铜网上,干燥后以高分辨透射电子显微镜观察其形貌,结果如图1(a)所示。碳点呈球形分散,无团聚现象发生,尺寸均匀,统计其粒径范围为1.0~4.0nm,平均粒径2.34±0.02nm(图1(b))。
图2给出了碳点的拉曼光谱和X射线衍射图谱。拉曼光谱中ID/IG为0.37,进一步表明了碳点具有更高的石墨化程度。同时,X射线衍射图谱表明碳点保留了大部分苯磺酰胺原料的结构以及少部分尼罗蓝的结构。
图3提供了碳点的X射线光电子能谱图。其中,a)为碳点总体的X射线光电子能谱,b)为C ls的X射线光电子能谱,c)为N 1s的X射线光电子能谱,d)为O ls的X射线光电子能谱,e)为S 2p的X射线光电子能谱。根据测试结果,计算出C、N、O和S的相对原子比分别为70.20%、5.57%、19.10%和5.14%。
XPS全谱图展现出四个典型的峰:C 1s(284.60eV)、N 1s(398.60eV)、O 1s(531.60eV)和S 2p(167.60eV)。在高分辨图谱中,如C 1s分为四个峰,证明有C=N(284.70eV)、C=C/C−C sp2(284.47eV)、C−OH/C−O−C(285.05eV)和C−O/C−N(285.99eV)存在;N 1s分为三个峰,证明其有吡啶氮(398.12eV)、氨基氮(398.76eV)和吡咯氮(399.76eV)存在;O 1s分为五个峰,主要证明有C=O(532.21eV)和C−O(532.99eV)的存在;S 2p主要分为三个峰,证明有S=O/N−S(168.47eV)、R−SO2−R(169.56eV)和−S−S−H二硫化物(170.12eV)的存在。
上述结果表明,碳点表面同样具有氨基、砜基、磺酸和磺酰胺等官能团;其中磺酰胺中S6+最高含量为1.41%,而且主要体现在磺酸和磺酸胺基团上。考虑到碳点的靶向高尔基体性能正是借助于这些基团与高尔基体表面过表达的环氧合酶-2之间的氢键结合作用,因此,X射线光电子能谱图的测试结果表明碳点具有靶向高尔基体的能力。
图4是碳点的紫外吸收光谱、激发光谱和最佳发射光谱图。紫外-可见吸收光谱具有三个明显的吸收峰,包括230和264nm两个紫外区域的吸收峰及位于580nm处的可见光区域吸收峰;其中230及264nm处的吸收峰分别归因于C=C和C=N的π-π*跃迁,580nm处吸收峰归因于芳香结构和C=S共轭键结构,因此碳点结构中具有较大的共轭结构。进一步测试碳点的荧光光谱可以看出,在激发波长为565nm时达到最大值,最佳激发波长为645nm。
图5给出了以所制备碳点处理兔肝癌细胞VX2 24h后的细胞存活率。结果表明,当碳点浓度到达400μg/mL时,虽然VX2细胞的存活率出现了大幅降低,但其细胞存活率仍大于80%,证明碳点具有较低的毒性,满足一般的生物应用需求。
实施例2。
称取尼罗蓝0.1465g,苯磺酰胺0.3143g,加入到20mL乙醇和20mL去离子水的混合溶剂中,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60kHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至190℃反应12h,获得紫红色的溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对溶液产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至60℃旋蒸除去乙醇,浓缩至15mL,停止旋蒸,冷却至室温后,于-80℃冰箱中冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥12h,制备得到紫色的碳点固体粉末。
实施例3。
称取尼罗蓝0.1465g,苯磺酰胺0.6287g,加入到20mL乙醇和20mL去离子水的混合溶剂中,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60kHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至190℃反应12h,获得紫红色的溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对溶液产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至60℃旋蒸除去乙醇,浓缩至15mL,停止旋蒸,冷却至室温后,于-80℃冰箱中冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥12h,制备得到紫色的碳点固体粉末。
实施例4。
称取尼罗蓝0.1465g,苯磺酰胺0.4715g,加入到20mL乙醇和20mL去离子水的混合溶剂中,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60kHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至160℃反应15h,获得紫红色的溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对溶液产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至60℃旋蒸除去乙醇,浓缩至15mL,停止旋蒸,冷却至室温后,于-80℃冰箱中冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥12h,制备得到紫色的碳点固体粉末。
实施例5。
称取尼罗蓝0.1465g,苯磺酰胺0.4715g,加入到20mL乙醇和20mL去离子水的混合溶剂中,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60kHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至220℃反应9h,获得紫红色的溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对溶液产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至60℃旋蒸除去乙醇,浓缩至15mL,停止旋蒸,冷却至室温后,于-80℃冰箱中冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥12h,制备得到紫色的碳点固体粉末。
应用例:碳点荧光探针的高尔基体靶向成像能力测试。
选取兔肝癌细胞VX2进行实验,细胞培养基为以基础培养基∶血清∶青链霉素双抗=90∶10∶1配制的完全培养基,细胞培养条件为5% CO2培养箱中37℃培养。
将VX2细胞消化并分散于完全培养基中,加到成像培养皿(1mL/well)中,于培养箱中37℃、5% CO2孵育24h。
取出成像培养皿,弃上清液,再用PBS缓冲溶液润洗细胞3次。
在清洗后的VX2细胞中加入100μL碳点终浓度为0.2mg/mL的完全培养基,培养箱中37℃、5% CO2孵育4h后,用PBS缓冲溶液清洗细胞3次,去除多余的碳点。
同时,在清洗后的VX2细胞中加入高尔基体特异性荧光染料NBD C6-ceramide复合物,4℃下孵育30min,用PBS缓冲溶液清洗细胞3次,去除多余的NBD染料。
以激光共聚焦显微镜分别拍摄碳点和NBD染料的荧光成像照片,对碳点荧光探针的高尔基体靶向性能进行评估。
荧光成像照片拍摄过程碳点样品的激发波长是553nm,发射波长611~663nm;NBDC6-ceramide复合物样品的激发波长是488nm,发射波长520~560nm。
图6给出了共聚焦显微镜下NBD C6-ceramide复合物与碳点荧光探针共孵育VX2细胞的荧光成像图:a)NBD C6-ceramide复合物的共聚焦显微镜图像,b)碳点荧光探针的共聚焦显微镜图像,c)合并图像,d)合并图像的放大图像,e)为强度散点图。
对激光共聚焦图像进行分析,碳点荧光探针的荧光图像与NBD C6-ceramide荧光染料的共定位皮尔森相关系数达0.87,证实本发明碳点荧光探针具有较好的高尔基体靶向性。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下,针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向高尔基体的红光发射荧光碳点,是以尼罗蓝和苯磺酰胺为原料,按照尼罗蓝与苯磺酰胺的摩尔比为1∶10~20溶于乙醇和水的混合溶剂中,密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末,固态下无荧光,水溶液状态下发射645nm的荧光,具有激发独立特性。
2.根据权利要求1所述的红光发射荧光碳点,其特征是所述溶剂热反应温度为160~220℃。
3.根据权利要求1所述的红光发射荧光碳点,其特征是所述溶剂热反应时间9~15h。
4.根据权利要求1所述的红光发射荧光碳点,其特征是尼罗蓝与苯磺酰胺的摩尔比为1∶15。
5.权利要求1所述靶向高尔基体的红光发射荧光碳点的制备方法,是将尼罗蓝和苯磺酰胺以摩尔比1~10∶20溶于乙醇和水的混合溶剂中得到反应溶液,超声分散均匀,于密闭反应釜中加热至160~220℃进行溶剂热反应9~15h,反应产物经提纯、干燥后得到紫色的碳点固体粉末。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是所述反应溶液浓度不大于20mg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是将反应溶液以频率60kHz的超声波超声分散3~15min。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是将反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤,再以截留分子量500~1000Da的透析袋透析进行提纯处理。
9.权利要求1所述靶向高尔基体的红光发射荧光碳点在制备细胞医学成像用荧光探针的应用。
10.权利要求1所述靶向高尔基体的红光发射荧光碳点在制备细胞中环氧合酶-2高度表达的高尔基体的靶向成像荧光探针的应用。
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