CN114032094A - 基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于环氧合酶‑2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,是以对苯二胺和苯磺酰胺溶于溶剂甲醇中密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末。本发明橙光碳点可通过表面磺酰胺基团与环氧合酶‑2结合,作为高尔基体靶向型荧光探针,应用于肿瘤细胞中环氧合酶‑2高度表达的高尔基体的靶向成像,不仅选择性高,还具有超快的成像速度。
Description
技术领域
本发明属于生物成像技术领域,涉及一种橙光碳点,特别是一种能够快速精准靶向富含环氧合酶-2的高尔基体的橙光碳点,以及该橙光碳点的制备和应用。
背景技术
高尔基体是细胞中运输和分泌蛋白质/酶的关键结构。作为细胞的重要组成部分,高尔基体细微的pH、电性或形态变化都会造成生物系统紊乱,导致器官损伤,如眼、肾和肝脏疾病等。此外,高尔基体在炎症细胞或组织中产生的蛋白质或酶水平比正常细胞或组织高。因此,高尔基体的靶向荧光成像,对于监测高尔基体的微观结构形态及癌症的成像治疗至关重要。
碳点(Carbon Dots)是一种优异的靶向荧光探针,其尺寸小于10nm,具有发光波长可调、大斯托克斯位移及光稳定性好等优异的光学性能。碳点表面具有氨基、羧基等丰富的官能团,使其易于修饰偶联,同时具有低的细胞毒性和良好的生物相容性,在高尔基体荧光成像领域受到越来越多的关注。
目前的高尔基体靶向碳点研究工作中,Li等(Chiral Nanoprobes for Targetingand Long-Term Imaging of the Golgi Apparatus[J]. Chemical Science, 2017, 8(10): 6829-6835.)和Yuan等(Optically Active Blue-Emitting Carbon Dots toSpecifically Target the Golgi Apparatus[J]. RSC Advances, 2017, 7(79): 49931-49936.)利用手性和巯基的特殊结构,分别以两步热解法合成了蓝光发射的高尔基体靶向型碳点,用于人表皮喉癌细胞HEp-2、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa、人非小细胞肺癌细胞A549、小鼠血管平滑肌细胞SMC及WT巨噬细胞等中的高尔基体成像。侯鹏等(记忆型碳点的制备及其在生物医药分析中的应用研究[D], 西南大学, 2018.)基于碱性配体在酸性细胞器滞留的策略,合成了黄光发射的高尔基体靶向型碳点,用于A549、HepG2、HeLa细胞、人脐静脉内皮细胞HUVEC,人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH等中的高尔基体成像。
上述高尔基体靶向型碳点多以两步热解法为主,进行官能团修饰,不仅合成方法比较复杂,且碳点的发射波长较短,位于300~550nm范围,易受到自体荧光的干扰,限制了高尔基体靶向型碳点在组织成像中的应用。
同时,上述手性、巯基和碱性配体的特殊结构未能深入探讨解释探针的靶向专有性。例如,手性配体和巯基结构在高尔基体中的具体作用位点仍有待进一步研究,基于碱性探针与酸性环境结合的靶向策略可能会对同样具有酸性环境的其它亚细胞器产生靶向作用,从而限制了高尔基体靶向型碳点的开发。
基于配体与蛋白受体靶点结合的主动靶向作用,是近来引起关注的一种高效的靶向成像手段。
环氧合酶-2属于一种同工的应激酶,是一种优良的可追踪生物标志物。环氧合酶-2一般情况下不表达,但在机体处于炎症及癌症时会在高尔基体中高度表达,如在炎症反应中参与调解水肿和疼痛生理过程等。磺酰胺基团可以与环氧合酶-2的活性位点选择性结合。因此,基于磺酰胺基团与环氧合酶-2的配体-蛋白受体结合的主动靶向作用,设计一种高尔基体靶向型碳点荧光探针,将具有很大的研究前景。
然而,在生物荧光成像操作中可以发现,现有碳点靶向探针的培育时间长达30min~4h,无法实现高尔基体的快速精准成像,限制了荧光成像效率。如Tong等(One-stepFabrication of Functional Carbon Dots with 90% Fluorescence Quantum Yield forLong-Term Lysosome Imaging[J]. Analytical Chemistry, 2020, 92(9): 6430-6436.)开发的P-R CDs溶酶体探针,需要10min才能进入细胞进行成像。而上述Li等合成的蓝光发射高尔基体靶向型碳点探针,为了达到更好的成像效果,孵育4h后才进行高尔基体成像。
因此,需要对可以实现高尔基体快速精准成像的探针进行开发,以实现高尔基体的实时成像,大幅提高定位成像效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,以及该橙光碳点的制备和应用,以实现对环氧合酶-2高度表达高尔基体的快速、准确定位。
为实现上述发明目的,本发明提供的橙光碳点是以对苯二胺和苯磺酰胺为原料,按照对苯二胺与苯磺酰胺的摩尔比为1~3∶1溶于溶剂甲醇中,密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末。
进一步地,所述对苯二胺与苯磺酰胺的摩尔比优选为3∶1。
更进一步地,本发明是在160~200℃下进行溶剂热反应以得到橙光碳点的。
更具体地,所述溶剂热反应时间优选为6~10h。
本发明制备的橙光碳点为酒红色固体粉末,粒径小于5nm,其在固态下无荧光,溶液状态下能够发射612nm的荧光,不具有激发依赖性,属于橙光发射。
进而,本发明提供了所述快速定位高尔基体的橙光碳点的一种制备方法,是将对苯二胺与苯磺酰胺以摩尔比1~3∶1溶于溶剂甲醇中得到反应溶液,超声分散均匀,于密闭反应釜中加热至160~200℃下进行溶剂热反应6~10h,反应产物经提纯、干燥后得到深酒红色的碳点固体粉末。
其中,优选地,本发明所述反应溶液的浓度不大于30mg/mL。
更优选地,是将所述反应溶液以频率60KHz的超声波超声分散3~10min,以使原料充分混合均匀。
进一步地,本发明是将反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤,再以截留分子量500~1000Da的透析袋透析,以将反应产物进行提纯处理。
提纯后的反应产物浓缩后,经真空冷冻干燥,即可制备得到本发明橙光碳点固体粉末。
具体地,所述真空冷冻干燥是在真空度2Pa、冷冻温度-80℃下冷冻干燥12~24h。
本发明制备的橙光碳点可以作为荧光探针,应用于细胞的医学成像中。
进一步的,本发明制备的橙光碳点可以作为荧光探针,应用于肿瘤细胞中环氧合酶-2高度表达的高尔基体的靶向成像中。
本发明利用苯磺酰胺对高尔基体上环氧合酶-2的主动靶向作用,使制备的橙光碳点通过表面的磺酰胺基团与环氧合酶-2结合,作为一种高尔基体靶向型碳点荧光探针,选择性高,具有准确的高尔基体靶向定位效果, Pearson系数达到0.97。
本发明制备碳点荧光探针发射波长612nm,发射光位于橙光区,优于目前高尔基体靶向型碳点的发射波长,避免了在波长短的地方加入时的自体荧光干扰,适用于组织和活体成像。
由于本发明制备碳点荧光探针的粒径小于10nm,尺寸小,带正电,利于快速进入细胞膜,因此具有超快的成像速度,8s即可对HeLa活细胞进行染色和成像,是一种能够快速成像高尔基体的碳点荧光探针。
本发明制备碳点荧光探针的生物相容性好,200μg/mL浓度下的细胞存活率仍然可大于80%。
根据表1中本发明碳点荧光探针与其它细胞器靶向型碳点探针的比较,本发明碳点荧光探针不仅较现有细胞器靶向型碳点探针在发射波长上有了很大的提高,而且细胞进入速度也较其它类型的细胞器靶向型碳点探针有了进一步的提高。
上表中的各探针及其性能分别来源于下述文献报道。
phenyl-CDs:Sun YQ, Qin HY, Geng X, et al. Rational Design of Far-Redto Near-Infrared Emitting Carbon Dots for Ultrafast Lysosomal PolarityImaging[J]. ACS Applied Materials and Interfaces, 2020, 12(28): 31738-31744.。
CDs:Hua XW, Bao YW, Wu FG. Fluorescent Carbon Quantum Dots withIntrinsic Nucleolus-Targeting Capability for Nucleolus Imaging and EnhancedCytosolic and Nuclear Drug Delivery[J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2018, 10: 16924-16924.。
CDs-PpIX:Qin HY, Sun YQ, Geng X, et al. A wash-free lysosometargeting carbon dots for ultrafast imaging and monitoring cell apoptosisstatus-ScienceDirect[J]. Analytica Chimica Acta, 2020, 1106: 207-215.。
P-R CDs:Tong L, Wang X, Chen Z, et al. One-step Fabrication ofFunctional Carbon Dots with 90% Fluorescence Quantum Yield for Long-TermLysosome Imaging[J]. Analytical Chemistry, 2020, 92(9): 6430-6436.。
N-CDs-F:Jiang L, Ding H, Xu M, et al. Carbon Dots: UV-Vis-NIR Full-Range Responsive Carbon Dots with Large Multiphoton Absorption Cross Sectionsand Deep-Red Fluorescence at Nucleoli and In Vivo[J]. Small, 2020, 16(19):2070107.。
LC-CQDs:Li, R.S.; Gao, P.F.; Zhang, H.Z.; Zheng, L.L.; Li, C.M.;Wang, J.; Li, Y.F.; Liu, F.; Li, N.; Huang, C.Z. Chiral Nanoprobes forTargeting and Long-Term Imaging of the Golgi Apparatus. Chemical Science.2017, 8, 6829-6835.。
L-Pen-CDs:Yuan, M.K.; Guo, Y.J.; Wei J.J.; Li, J.Z.; Long, T.F.; Liu,Z.D. Optically Active Blue-Emitting Carbon Dots to Specifically Target theGolgi Apparatus. RSC Advances. 2017, 7, 49931-49936.。
附图说明
图1是本发明制备橙光碳点的透射电子显微镜图像,其中插图分别为碳点粒径分布图、放大倍数下碳点晶格图、自然光下的碳点溶液颜色及其在紫外光下的发光状态。
图2是碳点的傅里叶红外吸收光谱图。
图3是碳点的X射线光电子能谱图。
图4是碳点的荧光光谱图与紫外吸收光谱图。
图5是本发明碳点荧光探针的高尔基体靶向标记能力测试结果。
图6是碳点荧光探针与HeLa细胞共孵育0~14s内的激光共聚焦成像图。
图7是连续激光激发下细胞中碳点荧光探针的光稳定性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明,而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例和对比例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备,其名称和简称均属于本领域内常规的名称,在相关用途领域内均非常清楚明确,本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备,按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例和对比例中使用的各种原料或试剂,并没有来源上的特殊限制,均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
实施例1。
称取对苯二胺0.0324g,苯磺酰胺0.0157g,加入40mL甲醇,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60KHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至180℃反应8h,获得酒红色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔过滤膜对产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至55℃旋蒸除去甲醇,浓缩至15mL左右停止旋蒸,冷却至室温后置于-80℃冰箱冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥24h,得到酒红色的碳点固体粉末0.032g,收率62%。
取少许制备好的碳点固体粉末溶于去离子水中,滴于透射电镜专用铜网上,干燥后以高分辨透射电子显微镜观察其形貌,结果如图1所示。通过高分辨透射电镜可以看出本发明制备的碳点分散均匀,尺寸均一,平均粒径约为3.36nm,有明显的0.21nm晶格条纹,呈一定的石墨化结构。
取少量碳点水溶液,以数码相机分别测定其在自然光与365nm紫外光下的溶液状态,结果见图1中右下角插图,在自然光下为淡粉色的透明溶液,紫外光激发下呈现出橙红色荧光。
图2是所制备碳点的傅里叶红外吸收光谱图,其中3022~3689cm-1处的吸收峰对应O−H和N−H伸缩振动;2926cm-1处的吸收峰对应C−H伸缩振动;1514和1315cm-1处的吸收峰分别对应C=C和N−H的反对称伸缩振动;1047和829cm-1处的吸收峰分别对应碳点中C=N和O=S=O反对称伸缩振动以及C−OH和S−O伸缩振动。
其中,在波数为1047cm-1处的红外吸收峰说明原料苯磺酰胺的特征基团C=N和O=S=O保留在了碳点表面。
使用Thermo Fisher ESCALAB 250Xi型X射线电子能谱仪测定得到了图3所示的所制备碳点的XPS图谱,以此来确定碳点中所含元素及其相应价态。其中,a)为碳点总体的X射线光电子能谱,b)为C ls的X射线光电子能谱,c)为N 1s的X射线光电子能谱,d)为O ls的X射线光电子能谱,e)为S 2p的X射线光电子能谱。
各图谱中,a)中C、N、O和S元素的原子百分比分别为46.64%、27.17%、23.76%和2.42%;C是碳点最主要的构成元素之一,其次分别为N、O、S和H。b)中在284.41、285.11和286.07eV显示三个峰,键能284.41eV的峰归属于C−C/C=C,285.11eV的峰归属于C−S/C−N,286.07eV的峰归属于C−O/C=N;且主要以C−S/C−N键的形式存在。在c)的N 1s能谱图中,位于398.53、399.24、400.43和400.73eV的峰分别归因于吡啶N、C13H9NH2/SO2(C6N4NH2)2、吡咯N和C−NH2,表明在碳点表面具有磺酰胺基团。d)的O ls能谱图中,530.53、531.28、532.08、532.88和533.68eV的特征峰分别归因于−C−OH、C=O、C−O−C、O−H和O=C−O,主要以C−O−C键存在。e)的S 2p能谱图中确认了可分别得到C−S与C−SOx(X=2、3和4)的电子结合能含硫基团的存在,分别位于168.46和169.74eV。
利用紫外可见分光光度计测得碳点的吸收光谱如图4所示,可知碳点在245和275nm处显示出两个吸收峰,表明分别存在C=O的n-π*跃迁和C=N的n-π*跃迁。在509nm处有一个较弱的吸收峰,对应碳点表面C−N−C和C=O的n−π*跃迁。
图4中还提供了利用荧光光谱仪测得的碳点激发与发射光谱图,可以看出,碳点的激发发射光谱有两个激发峰,分别位于366nm和462nm波长处,其中366nm激发波长下的荧光强度最大,而最大发射峰位于612nm处。
实施例2。
称取对苯二胺0.1081g,苯磺酰胺0.1572g,加入40mL甲醇,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60KHz超声分散5min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至170℃反应8.5h,获得酒红色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔过滤膜对产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至55℃旋蒸除去甲醇,浓缩至15mL左右停止旋蒸,冷却至室温后置于-80℃冰箱冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥20h,得到酒红色的碳点固体粉末。
实施例3。
称取对苯二胺0.0960g,苯磺酰胺0.1410g,加入35mL甲醇,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60KHz超声分散3min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至180℃反应7h,获得酒红色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔过滤膜对产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至55℃旋蒸除去甲醇,浓缩至15mL左右停止旋蒸,冷却至室温后置于-80℃冰箱冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥12h,得到酒红色的碳点固体粉末。
实施例4。
称取对苯二胺0.3241g,苯磺酰胺0.4718g,加入42mL甲醇,以封口膜密封,置于超声波分散仪上,以频率60KHz超声分散8min,得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,密封下升温至170℃反应8h,获得酒红色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔过滤膜对产物进行过滤,再将滤液装入截留分子量500~1000Da的透析袋中,于去离子水中透析12h后,将透析液加入旋蒸瓶内,再加入20mL去离子水,加热至55℃旋蒸除去甲醇,浓缩至15mL左右停止旋蒸,冷却至室温后置于-80℃冰箱冷冻,然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥20h,得到酒红色的碳点固体粉末。
应用例1:碳点荧光探针的高尔基体靶向成像能力测试。
选取宫颈癌HeLa细胞进行实验,细胞培养基为以基础培养基∶血清∶青链霉素双抗=90∶10∶1配制的完全培养基,细胞培养条件为5% CO2培养箱中37℃培养。
将HeLa细胞消化并分散于完全培养基中,加到成像培养皿(1mL/well)中,于培养箱中37℃、5% CO2孵育24h。
取出成像培养皿,弃上清液,再用PBS缓冲溶液润洗细胞3次。
在清洗后的HeLa细胞中加入100μL碳点终浓度为0.2mg/mL的完全培养基,培养箱中37℃、5% CO2孵育4h后,用PBS缓冲溶液清洗细胞3次,去除多余的碳点。
同时,在清洗后的HeLa细胞中加入高尔基体特异性荧光染料NBD C6-ceramide复合物,4℃下孵育30min,用PBS缓冲溶液清洗细胞3次,去除多余的NBD染料。
以激光共聚焦显微镜分别拍摄碳点和NBD染料的荧光成像照片,对碳点荧光探针的高尔基体靶向性能进行评估。荧光成像照片的激发波长458nm,发射波长580~700nm。
图5中,a)为共聚焦显微镜下与碳点荧光探针共孵育的HeLa细胞的明场图,b)为共聚焦荧光显微镜下NBD C6-ceramide复合物的荧光图,c)为共聚焦荧光显微镜下碳点荧光探针的荧光图(红色),d)为明场与荧光通道下图片的重合图。
对激光共聚焦图像进行分析,碳点荧光探针的荧光图像与NBD荧光染料的共定位系数达0.97,证实本发明碳点荧光探针具有较好的高尔基体靶向性。
应用例2:碳点荧光探针的高尔基体靶向成像效率测试。
为进一步测试碳点荧光探针的成像效率,使用配备有台上孵化室的尼康旋转圆盘共聚焦显微镜,通过活细胞工作站对碳点荧光探针进入高尔基体的时间进行分析。
将HeLa细胞消化并分散于完全培养基中,加入到成像培养皿(1mL/well)中,于培养箱中37℃、5% CO2孵育24h。待细胞贴壁生长后,取出成像培养皿,弃上清液,再用PBS缓冲溶液润洗细胞3次。
将成像培养皿置于活细胞工作站中,调节焦距,然后在镜下加入100μL碳点浓度为0.1mg/mL的完全培养基,用配备prime 95B照相机(远差测光)的倒置显微镜(尼康Ti2-E)观察细胞14s。荧光成像照片激发波长458nm,发射波长580~640nm,以2s为时间间隔,用40倍或100倍物镜获取拍照记录。
从图6的碳点与HeLa细胞共孵育0~14s内的活细胞成像激光共聚焦成像图可以看出,碳点荧光探针可以在8s内快速进入到细胞中。
应用例3:碳点荧光探针的高尔基体靶向成像稳定性测试。
在应用例2的基础上,以5min为时间间隔,继续观察细胞200min,评估碳点的成像稳定性。
图7给出了在连续激光激发下,碳点与HeLa细胞共孵育0、70、140和200min的荧光图像,证明本发明的碳点荧光探针具有200min稳定成像的能力,且表现出抗光漂白性能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,是以对苯二胺和苯磺酰胺为原料,按照对苯二胺与苯磺酰胺的摩尔比为1~3∶1溶于溶剂甲醇中,密闭下进行溶剂热反应,反应产物提纯后得到的碳点固体粉末。
2.根据权利要求1所述的基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,其特征是对苯二胺与苯磺酰胺的摩尔比为3∶1。
3.根据权利要求1所述的基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,其特征是在160~200℃下进行溶剂热反应。
4.根据权利要求1所述的基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点,其特征是溶剂热反应时间6~10h。
5.权利要求1所述橙光碳点的制备方法,是将对苯二胺与苯磺酰胺以摩尔比1~3∶1溶于溶剂甲醇中得到反应溶液,超声分散均匀,于密闭反应釜中加热至160~200℃下进行溶剂热反应6~10h,反应产物经提纯、干燥后得到深酒红色的碳点固体粉末。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是反应溶液的浓度不大于30mg/mL。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是将反应溶液以频率60KHz的超声波超声分散3~10min。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征是将反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤,再以截留分子量500~1000Da的透析袋透析进行提纯处理。
9.权利要求1所述基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点作为细胞医学成像中荧光探针的应用。
10.权利要求1所述基于环氧合酶-2靶点快速定位高尔基体的橙光碳点作为肿瘤细胞中环氧合酶-2高度表达的高尔基体靶向成像荧光探针的应用。
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