CN115721731A - 一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体及其制备方法，是以对苯二胺和对甲苯磺酸为原料制备橙光CDs作为载体，连接以EDC/NHS活化的细胞核定位信号肽NLS获得靶向细胞核碳点CDs‑NLS，再以EDC/NHS活化的HBA进行改性后，负载药物阿霉素获得复合体CDs‑NLS‑DOX。本发明负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体具有较高的靶向肿瘤细胞核能力，并能响应肿瘤微酸环境有效释放阿霉素，对肿瘤细胞有显著的杀伤作用，同时对正常细胞损伤较小。

Description

一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米药物与生物医学技术领域，涉及一种负载肿瘤治疗药物的靶向药物载体，特别是涉及一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是全球主要的公共卫生问题，影响着数百万人的生命。恶性肿瘤具有发病隐匿性、较长潜伏期、早期无明显阳性症状等特点，导致一部分患者发现肿瘤时已经进展至中晚期，甚至发展成恶病质，不再适合手术切除治疗。

化疗是肿瘤治疗的一大主力军，但是化疗药物的非肿瘤区域无差别分布，导致其对正常细胞也有不同程度的损伤，轻者出现胃肠道毒性反应，严重者甚至骨髓抑制。另外，长时间应用化疗药物会激活肿瘤细胞膜表面药物外排蛋白（P-gp）的表达，将胞内的化疗药物逆向转运出肿瘤细胞，出现多药耐药。

因此，新型的肿瘤特异性治疗手段的研发就显得尤为重要，也是一直以来研究者不懈努力的目标。

近年来，靶向细胞器纳米药物复合体的出现，为肿瘤的增效减毒提供了转机。其可以定位于肿瘤特定细胞器并释放药物，有望提高药物的生物利用度，实现肿瘤的精准有效治疗。其中，靶向细胞核纳米药物复合体的研究是重中之重。其一，因为细胞核是细胞遗传物质储存的中心，也是蛋白质转录的场所，而且许多化疗药物如阿霉素、喜树碱、顺铂等的最终作用场所就是细胞核内DNA，通过干扰DNA的复制杀伤肿瘤细胞。其二，化疗药物被直接运载至细胞核内，躲避细胞膜上P-gp介导耐药的途径，有望减少药物的外排，提高胞内的化疗药物浓度。

碳点（Carbon dots，CDs）是碳纳米粒子中的一类零维球形碳纳米材料，优异的光学性能、良好的生物相容性及表面容易官能化的特点，使其在众多纳米材料中崭露头角。同时，CDs的尺寸小于10nm，也使其更容易被细胞所摄取，是生物成像探针和药物传递的潜在候选者。

目前CDs的靶向细胞核功能可以通过两种模式实现。其一是CDs本身为正电性，依据与核膜表面的正负静电吸引作用力靶向于细胞核（Carbon, 182: 155-166；Macromolecular Bioscience, 17(9): 1700086）。这种方式虽然具有简便易得的优势，但对于原料碳源有一定的要求，且进一步的研究发现，基于静电吸引的靶向策略可能会对同样具有负膜电位的其它亚细胞器产生靶向作用，从而限制了靶向细胞核碳点的开发。

另一种模式为基于配体-受体的主动靶向策略，因其靶向精准度高而被广泛使用。细胞核定位信号肽（Nuclear localization sequence，NLS）是经典的核定位分子之一，纳米载体与其结合后，NLS先后与核输入蛋白α/β结合形成二聚体通过核孔复合体，从而被靶向至细胞核。然而，目前基于NLS精确引导，且负载化疗药物应用于抗肿瘤治疗的靶向细胞核CDs均集中在短波长发射区域，针对长波长发射的抗肿瘤研究报道极少，仍然处于初级阶段，无法避免生物自体荧光干扰，不利于体外进行肿瘤治疗监测，且存在药物装载效率低下，影响整体治疗效果的不足，这就极大地限制了靶向细胞核碳点在细胞成像监测和药物递送领域的进一步研究。

因此，迫切需要合成一种具有长波长发射的高效负载化疗药物的靶向细胞核碳点复合体，对于癌症的治疗、监测追踪具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体，以及该复合体的制备方法，以提高肿瘤治疗药物的肿瘤细胞核靶向和高效杀伤作用。

本发明所述的负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体是以橙光碳点（CDs）作为载体，连接细胞核定位信号肽（NLS）获得靶向细胞核碳点CDs-NLS，再以对羧基苯肼（HBA）进行改性构建改性的靶向细胞核碳点CDs-NLS-HBA，负载上药物阿霉素（DOX）后获得的复合体CDs-NLS-DOX。

其中，所述的橙光碳点是以对苯二胺和对甲苯磺酸为原料，于无水甲醇中溶剂热反应得到的具有橙光发射的CDs固体粉末，其在激发光照射下的发射波长位于620nm。

本发明上述复合体CDs-NLS-DOX中，所述的NLS是经碳化二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化其的羧基端后，通过酰胺反应与所述CDs共价连接的。

进一步地，所述的HBA同样是利用EDC/NHS活化其的羧基端后，与靶向细胞核碳点CDs-NLS表面的剩余氨基共价相连，以引入肼基基团对其进行改性。

更具体地，本发明还提供了一种所述负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体的制备方法。

1）、以对苯二胺和对甲苯磺酸为原料，于无水甲醇中超声分散均匀，高温密闭条件下进行溶剂热反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到紫黑色的橙光碳点（CDs）固体粉末。

其中，优选地，所述对苯二胺与对甲苯磺酸的用量摩尔比为0.5-3:1。

其中，优选地，所述溶剂热反应温度为150-180℃。

更优选地，所述溶剂热反应时间为6-10h。

2）、以EDC/NHS常温下活化NLS，加入步骤1）制备的CDs进行酰胺反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到靶向细胞核橙光碳点CDs-NLS。

其中，优选地，所述CDs与NLS的质量比为0.8-2:1。

其中，优选地，所述酰胺反应时间为24-72h。

3）、以EDC/NHS常温下活化HBA，加入步骤2）制备的CDs-NLS进行改性反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到HBA改性靶向细胞核橙光碳点CDs-NLS-HBA。

其中，优选地，所述改性反应时间为24-60h。

4）、在加有冰醋酸的二甲基亚砜溶剂体系中加入CDs-NLS-HBA和DOX，避光下进行载药反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体CDs-NLS-DOX。

其中，优选地，所述CDs-NLS-HBA与DOX的质量比为0.25-4:1。

其中，优选地，所述载药反应是在摇床上进行的，反应时间为48-96h。

更进一步地，本发明上述制备方法中，具体是以截留分子量1000Da的透析袋在去离子水中对各步骤中的反应物进行透析提纯处理的。

更进一步地，本发明上述制备方法中，具体是将透析提纯处理的反应物于−80℃冷冻后，再于真空度2Pa、温度−80℃下冷冻干燥至少24h。

更进一步地，本发明上述制备方法中，所述活化羧基使用的EDC/NHS的用量摩尔比优选为0.8-1.5:1。

利用本发明上述制备方法，可以制备得到一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体，该复合体利用酸敏感的酰腙键将改性靶向细胞核橙光碳点CDs-NLS-HBA与阿霉素进行连接，首先使得复合体具备了较高的靶向肿瘤细胞核的能力，其次能够响应肿瘤微酸环境有效释放阿霉素，对肿瘤细胞有显著的杀伤作用，同时对正常细胞损伤较小。

基于上述机制，本发明制备的负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体可以作为一种靶向肿瘤细胞核、高效杀伤肿瘤细胞并保护正常细胞的肿瘤治疗靶向药物得到应用。

本发明所述负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体的制备方法工艺简单、绿色无污染、成本低廉，其作为载体的碳点发射波长620nm，位于橙光区域，避免了短波长区域的自体荧光干扰，便于针对肿瘤组织进行体外成像监测。

本发明采用的橙光碳点粒径小于10nm，可通过纳米EPR效应聚集于肿瘤组织中，且尺寸小、带正电的优势也使其利于快速穿过细胞膜；其还具有良好的生物相容性，在200µg/mL浓度下的细胞存活率大于80%，在修饰NLS后更是展现出高效特异的细胞核靶向能力；以其负载抗肿瘤药物阿霉素，药物装载效率高，并能通过肿瘤微酸环境有效释放药物，对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，保护了正常细胞免受损伤。

附图说明

图1是CDs的透射电子显微镜图像(a)和粒径分布直方图(b)，其中插图为放大倍数下的CDs晶格图。

图2是CDs的X射线光电子能谱图。

图3是CDs-NLS的靶向细胞核能力测试结果。

图4是CDs、CDs-NLS和CDs-NLS-DOX的傅里叶红外吸收光谱图。

图5是CDs、CDs-NLS和CDs-NLS-DOX的紫外-可见光吸收光谱图。

图6是CDs与CDs-NLS-DOX的激发与发射光谱图，其中插图分别为自然光与365nm紫外光下的溶液状态。

图7是CDs-NLS-DOX的体外抗肿瘤效果评价结果。

图8是CDs-NLS-DOX的体内抗肿瘤效果评价结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内亦均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。

本发明以下实施例中出现的英文缩写中，CDs表示橙光碳点，NLS表示细胞核定位信号肽，CDs-NLS表示与NLS共价连接的橙光碳点，CDs-NLS-HBA表示HBA改性的靶向细胞核橙光碳点，CDs-NLS-DOX表示负载DOX的靶向细胞核橙光碳点复合体，EDC/NHS表示碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。

其中，NLS的多肽序列为PKKKRKVG。

实施例1。

称取64.90mg（0.6mmol）对苯二胺和103.30mg（0.6mmol）对甲苯磺酸，溶于40mL无水甲醇中，封口膜密封，于超声波分散仪上超声助溶分散3min，得到混合溶液。

将混合溶液转移至80mL带聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，密封下升温至160℃反应6h，得到紫黑色溶液产物。

冷却至室温后，将紫黑色溶液通过0.22µm亲水性微孔滤膜，过滤除掉大颗粒，所得滤液旋蒸去除多余的甲醇，以截留分子量1000Da的透析袋在去离子水中透析24h。透析结束后，透析袋内溶液于−80℃冰箱冷冻后，于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度−80℃冷冻干燥24h，制备得到紫黑色的CDs固体粉末。

取少许制备好的CDs固体粉末溶于去离子水中，滴于透射电镜专用铜网上，干燥后以高分辨透射电子显微镜观察其形貌，结果如图1所示。

通过高分辨透射电镜可以看出，所制备的CDs呈类球形，分散均匀，尺寸均一，平均粒径约为2.36±0.49nm，有明显的晶格条纹，呈一定的石墨化结构。

利用图2的X射线光电子能谱图来确定CDs中所含元素及其相应价态。图中a）为CDs的XPS全能谱图，b）为C ls的XPS能谱图，c）为N 1s的XPS能谱图，d）为O ls的XPS能谱图，e）为S 2p的XPS能谱图。

各图谱中，a）中C、N、O和S元素的原子百分比分别为51.83%、8.79%、26.14%和7.51%；C是碳点最主要的构成元素之一，其次分别为O、N、S和H；b）中在284.12和284.80eV处显示两个峰，分别与C−C/C=C、C−N/C−S键相关；c）中在398.71、400.86eV处显示两个峰，分别归属于C−N−C和N−H键；d）中530.77、532.34eV处的两个峰分别对应于C−O、S−O键；e）在167.35、168.56eV处显示两个峰，分别对应于C−SO₂和C−SO₃键。

实施例2。

称取200.00mg NLS粉末，均匀溶解于30mL的PBS（pH=7.4）缓冲溶液中，分别加入191.70mg（1mmol）EDC和115.09mg（1mmol）NHS，于25℃恒温水浴锅中磁力搅拌下反应2h，对NLS的羧基进行活化，得到混合溶液。

在活化的混合溶液中加入200.00mg CDs粉末，继续在25℃恒温水浴锅中磁力搅拌下反应48h。

将反应得到的混合液以截留分子量1000Da的透析袋在去离子水中持续透析24h，透析结束后，透析袋内溶液于−80℃冰箱冷冻后，真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度−80℃冷冻干燥24h，得到CDs-NLS固体粉末。

应用例1：NLS功能化橙光CDs的靶向细胞核能力测试。

选取兔肿瘤细胞VX2和人正常肝细胞HL-7702进行实验测试。

以基础培养基:血清:青链霉素双抗=90:10:1配制完全培养基，将VX2细胞和HL-7702细胞消化并分散于完全培养基中，调整细胞密度为1×10⁴/mL，加入到专用的成像培养皿（1mL/well）中，于培养箱中37℃、5% CO₂下孵育24h。

取出专用成像培养皿，弃上清液，以PBS缓冲溶液清洗细胞3次。在清洗后的细胞中加入适宜浓度的CDs和CDs-NLS完全培养基溶液，培养箱中37℃、5% CO₂孵育4h，以PBS缓冲溶液清洗细胞3次。

清洗完毕后用4%多聚甲醛溶液固定细胞10-20min，弃去固定液，PBS洗涤3次，加入1.5mL细胞核染料DAPI，室温下静置5min，在荧光显微镜下拍摄细胞的荧光共定位图像。

荧光成像照片中，CDs和CDs-NLS的激发波长分别为364nm和565nm，发射波长分别为620nm和615nm。

图3中的a）和b）分别为共聚焦荧光显微镜下与CDs-NLS、CDs共孵育的VX2细胞和HL-7702细胞的明场图、CDs-NLS或CDs荧光图、DAPI荧光图、各通道图片的重叠图以及荧光强度曲线。

如图3 a）所示，CDs-NLS培养的VX2和HL-7702细胞的红色荧光与细胞核的蓝色荧光完全重叠，同时荧光强度曲线也验证了这一结果。而图3 b）中未修饰NLS的CDs的红色荧光大部分位于细胞质，证明了本发明修饰NLS后的橙光CDs具有较高的细胞核靶向能力。

实施例3。

称取152.15mg（1mmol）HBA，溶于100mL的PBS（pH=7.4）缓冲溶液中，分别加入383.40mg（2mmol）EDC和230.18mg（2mmol）NHS，超声助溶使其分散均匀，于25℃恒温水浴锅中磁力搅拌下反应4h，对羧基进行活化得到混合溶液。

向混合溶液中加入400.00mg CDs-NLS粉末，25℃水浴搅拌下继续反应48h，于去离子水中使用截留分子量1000Da的透析袋透析24h。透析结束后，透析袋内溶液于−80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度−80℃冷冻干燥24h，得到CDs-NLS-HBA固体粉末。

称取180.00mg CDs-NLS-HBA，45.00mg DOX，溶解于50mL DMSO中，加入50µL冰醋酸得到混合溶液，于25℃恒温摇床上130r/min避光进行载药反应72h。

反应液使用截留分子量1000Da的透析袋于200mL去离子水中透析后，于−80℃冰箱冷冻，真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度−80℃冷冻干燥24h，得到CDs-NLS-DOX固体粉末。

图4分别给出了CDs、CDs-NLS和CDs-NLS-DOX的傅里叶红外吸收光谱图，并与NLS和DOX的红外谱图进行比较。

从图4 a）中可以看出，3196-3527cm^-1区域内的宽振动带归因于−OH/NH振动，2991、1394cm^-1为−CH₂振动；CDs和CDs-NLS中1460cm^-1吸收峰的出现归因于C−N振动，567、680cm^-1处的吸收峰为C−S振动所致。其中，CDs-NLS中1649cm^-1处出现的新吸收峰为NLS中C=N键的特征吸收带，从而证明了CDs表面已修饰了NLS，也即CDs-NLS得到了成功合成。

图4 b）中2935、1546cm^-1处的新峰分别对应于DOX吡喃环中−CH基团的拉伸振动和腙键中C=N的伸缩振动，表明CDs-NLS-DOX复合体的成功制备。

图5进而给出了CDs、CDs-NLS和CDs-NLS-DOX的紫外-可见光吸收光谱图。

从图5 a）中可见CDs在203、220和584nm处有明显的吸收峰，其中紫外区域中203和220nm处的吸收带归因于芳香族C=C的π-π*跃迁，可见光区584nm附近的吸收峰是芳香结构典型的吸收带，表明CDs结构中具有较大的共轭结构。另外，CDs-NLS溶液在223nm处的吸收峰对应于NLS在此处的吸收峰，再次表明了NLS修饰在CDs表面。

图5 b）中的CDs-NLS-DOX在481nm处出现了DOX的特征吸收峰，表明了CDs-NLS与DOX的结合。

采用荧光光谱仪测定CDs和CDs-NLS-DOX复合体的激发与发射光谱，结果如图6所示。图6中的插图分别给出了以数码相机测定的二者在自然光和365nm紫外光下的溶液状态。

图6 a）中CDs的最佳激发波长和发射波长分别为565和620nm，激发独立，为橙光发射；根据测试结果还可以计算出其的绝对荧光量子产率为17.3%，表现出较为出色的光学性能。

而图6 b）中可见分别位于567和597nm的两个发射峰，证明负载DOX后的复合体中DOX和CDs的发射峰均发生了蓝移。复合体发射波长蓝移的现象，表明了两种物质已不再是最初的单独存在体系，而是已经复合的标志。

应用例2：负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点的体外抗肿瘤效果评价。

使用CCK-8法检测CDs-NLS-DOX应用于抑制人正常肝细胞HL-7702、人肝癌细胞HepG2的生长，从而评价其的体外抗肿瘤效果。

将HL-7702、HepG2细胞按照5.0×10⁴/孔的密度以100µL/孔接种于96孔板中，放置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h。

弃去旧培养液，使用PBS（pH=7.4）溶液反复清洗3遍，然后以基础培养基配制不同浓度的CDs-NLS-DOX溶液（DOX药物浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125µg/mL）孵育24h，每组设置6个平行副孔。

最后吸除每孔的旧培养基和悬浮细胞，PBS（pH=7.4）再次清洗3遍，每孔加入100µL基础培养基:CCK-8溶液=9:1的混合液，将96孔板置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养1.5h。

用酶标仪在450nm处测定各孔OD值，计算细胞存活率。

以不同浓度的游离DOX、CDs-DOX（未修饰NLS）（DOX药物浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125µg/mL）溶液作为对照，其余条件与上述相同。

图7为游离DOX、CDs-DOX和CDs-NLS-DOX分别对HepG2（a）和HL-7702（b）细胞的增殖抑制结果。

可以明显观察到，随着DOX药物浓度增加，三组针对HepG2细胞的细胞毒性均逐渐增强，呈现出剂量依赖性死亡，总体细胞毒性大小表现为CD-NLS-DOX＞CDs-DOX＞游离DOX。在0.3125、2.5、10和20µg/mL DOX剂量下，与游离DOX相比，CDs-NLS-DOX组的细胞毒性相对较高，具有明显差异，且差异具有统计学意义（p＜0.05），尤其是当DOX药物浓度增加至20µg/mL时，CDs-NLS-DOX处理的细胞存活率仅为18.0%，发挥了更强的肿瘤杀伤作用，而此时游离DOX组的存活率为42.5%。

进而，还可以观察到虽然各个浓度下CDs-DOX的HepG2增殖抑制率同样较游离DOX组高，但明显低于同等DOX浓度下的CDs-NLS-DOX组，这一结果说明与游离DOX组相比，CDs-DOX组虽然在一定程度上增加了更多的DOX入胞，但是缺乏CDs-NLS-DOX组中NLS介导的细胞核靶向递药，DOX多定位于细胞质，未能充分增加其与细胞核内DNA的接触几率。因此，与其他两组相比，CDs-NLS-DOX发挥了增强的肿瘤杀伤作用。

然而，在正常肝细胞(HL-7702细胞)中，经游离DOX、CDs-DOX和CDs-NLS-DOX处理的细胞毒性结果却与HepG2细胞形成了明显对比。

同等浓度下，CDs-NLS-DOX组的细胞毒性均明显小于游离DOX和CDs-DOX组，几乎没有细胞毒性，体现出了对正常细胞的保护性，即使在高达20µg/mL的DOX药物浓度下，HL-7702细胞的存活率仍接近80%，而此浓度下游离DOX、CDs-DOX组的细胞存活率分别为72%和68%，且游离的DOX仅需要2.5µg/ml的DOX浓度，即可杀灭20%的HL-7702细胞，对HL-7702细胞的损伤更大。

以上体外毒性研究结果表明，与游离DOX和CDs-DOX组相比，CDs-NLS-DOX对肝癌细胞具有更强的杀伤作用，但一定程度上对正常细胞具有保护作用，可以保护正常细胞免受化疗药物无差别分布所带来的副损伤。

应用例3：负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点的体内抗肿瘤效果评价。

选用6-8周龄的SPF级雌性BALB/c裸鼠进行CDs-NLS-DOX抑制体内肿瘤增殖的能力验证试验。

以基础培养基重悬处于对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为1×10⁷/mL，抽取200µL细胞悬液注射到小鼠右前腋皮下，一周重复注射2次，观察皮下成瘤情况，待肿瘤体积生长至100mm³，构建获得小鼠HepG2肝癌皮下肿瘤模型。

将12只荷瘤小鼠分为生理盐水组、游离DOX组、CDs-DOX组和CDs-NLS-DOX组共4组，每组3只。

游离DOX组、CDs-DOX组和CDs-NLS-DOX组分别注射100µL DOX药物浓度为5mg/kg的DOX、CDs-DOX和CDs-NLS-DOX溶液，生理盐水组注射100µL生理盐水，均通过尾静脉注射，共注射4次。

肿瘤体积的变化通过游标卡尺测量肿瘤的长径和短径计算。治疗后每隔3天测量一次肿瘤体积，15天治疗结束后从小鼠身上收集每组的整个肿瘤组织拍照并称重记录。

从图8中15天治疗结束后各组的代表性在体肿瘤照片（a）、离体肿瘤照片（b）以及治疗期间各组肿瘤体积变化（c）和治疗结束后肿瘤重量（d）可以看出，随着治疗时间的延长，与生理盐水组相比较，CDs-NLS-DOX组和CDs-DOX、游离DOX组一样，均可以抑制肿瘤的生长，但CDs-NLS-DOX组肿瘤明显减小，甚至接近完全消失，离体肿瘤重量也较其他两组差异显著，显然展现出了较其他组更强的抑瘤效果。

这些结果表明，CDs-NLS-DOX的肿瘤靶向能力明显高于游离DOX和CDs-DOX，较其他组展现出更强的抑瘤效果。增强的抗肿瘤效果可能一方面由于EPR效应使得更多的药物沉积于肿瘤部位，另一方面源于高效的细胞核靶向递药作用以及酸环境响应的药物释放。

上述体内抗肿瘤作用试验结果表明本发明构建的CDs-NLS-DOX复合体具有靶向细胞核，有效释放DOX抑制肿瘤生长的潜力，从而达到肿瘤治疗的目的。

本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体，是以橙光碳点作为载体，连接细胞核定位信号肽NLS获得靶向细胞核碳点CDs-NLS，再以HBA进行改性构建改性的靶向细胞核碳点CDs-NLS-HBA，负载上药物阿霉素后获得的复合体CDs-NLS-DOX，其中的橙光碳点是以对苯二胺和对甲苯磺酸为原料，于无水甲醇中溶剂热反应得到的具有橙光发射的CDs固体粉末。

2.根据权利要求1所述的负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体，其特征是所述细胞核定位信号肽是经EDC/NHS活化后，通过酰胺反应与所述橙光碳点共价连接。

3.根据权利要求1所述的负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体，其特征是所述HBA是经EDC/NHS活化后，与CDs-NLS共价连接。

4.权利要求1所述负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体的制备方法，包括：

1）、以对苯二胺和对甲苯磺酸为原料，于无水甲醇中超声分散均匀，高温密闭条件下进行溶剂热反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到紫黑色的CDs固体粉末；

2）、以EDC/NHS常温下活化NLS，加入步骤1）的CDs进行酰胺反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到靶向细胞核橙光碳点CDs-NLS；

3）、以EDC/NHS常温下活化HBA，加入步骤2）制备的CDs-NLS进行改性反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到HBA改性靶向细胞核橙光碳点CDs-NLS-HBA；

4）、在加有冰醋酸的二甲基亚砜溶剂体系中加入CDs-NLS-HBA和DOX，避光下进行载药反应，反应物经透析提纯、冷冻干燥制备得到负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体CDs-NLS-DOX。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述步骤1）中以对苯二胺和对甲苯磺酸按照0.5-3:1的用量摩尔比，在150-180℃下进行溶剂热反应6-10h。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述步骤2）中CDs与NLS以质量比为0.8-2:1进行酰胺反应24-72h。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述步骤3）中改性反应时间24-60h。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述步骤4）中将CDs-NLS-HBA与DOX以质量比0.25-4:1在摇床上进行载药反应48-96h。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述EDC/NHS的摩尔比为0.8-1.5:1。

10.权利要求1所述负载阿霉素的靶向细胞核橙光碳点复合体在制备靶向肿瘤细胞核的靶向药物中的应用。

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