CN114948818A

CN114948818A - 一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法

Info

Publication number: CN114948818A
Application number: CN202210715113.4A
Authority: CN
Inventors: 王坚; 汤国霞; 陈增妙
Original assignee: Hangzhou Shuibazha Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Shuibazha Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN114948818B

Abstract

本发明公开了一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法，属于化妆品制备技术领域。该冻干精华液由冻干粉和溶媒液组成，在使用的过程中使用溶媒液快速的将冻干粉溶解，配置成精华液。所述冻干粉包括甘露糖醇、海藻糖、寡肽‑3、寡肽‑5、神经酰胺、精氨酸和抗菌肽融合蛋白Cb‑SOD‑Cb，溶媒液包括甘油、丙二醇、北美金缕梅提取物、甘草酸二钾、六肽‑9、丁二醇、棕榈酰四肽‑7、尿囊素、水解胶原、烟酰胺等，通过真空冷冻干燥的方法，制备成冻干粉的形式进行保存，解决了化妆品添加活性成分无法长期保存的难题，使制备的冻干精华液具有较好的祛痘修护功效。

Description

一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法，属于化妆品制备技术领域。

背景技术

随着物质生活水平不断提高，人们对美的追求越来越高，对皮肤健康也越来越重视。尤其是对裸露在外的皮肤的保护，如脸部、颈部以及四肢等等。而紫外线、环境变化等及其容易造成皮肤伤害，甚至导致粉刺、痤疮等皮肤问题。

目前市面上具有修护皮肤功效的化妆品主要集中在精华水、乳霜和面膜等类别的产品中，这类产品配方成分往往比较复杂，虽然大多产品中均含有具有祛痘修复等功效的活性成分，但是这些活性物溶解后往往稳定性较差，并且多种多肽、植物提取物等功效成分在常温液态下稳定性也较差，大大降低了这些成分的生物活性，此外，这类产品中往往添加了防腐剂，增加刺激源的同时也容易影响最终产品的效果。因此，提出一种新型的具有修护功效的化妆品尤为重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法，通过真空冷冻干燥的方法，制备成冻干粉的形式进行保存，解决了化妆品添加活性成分无法长期保存的难题，使制备的冻干精华液具有较好的祛痘修护功效。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提出了一种具有修护功效的冻干精华液，由料液比为70mg：3mL的冻干粉和溶媒液组成；所述冻干粉冻干前按质量百分比计，包括以下组分：

甘露糖醇1％～8％、海藻糖0.05％～2％、、寡肽-3 0.000001％～0.001％、寡肽-50.000001％～0.001％、神经酰胺0.01％～2％、精氨酸0.01％～1％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.001-0.05％，余量为去离子水；

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

甘油2％～10％、丙二醇2％～8％、北美金缕梅提取物1％～5％、甘草酸二钾0.5％～3％、六肽-9 0.1％～2％、丁二醇0.1％～2％、棕榈酰四肽-7 0.1％～1％、尿囊素0.05％～1％、水解胶原0.01％～1％、烟酰胺0.05％～0.5％、透明质酸钠0.01％～0.5％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.001％～0.1％，余量为去离子水。

进一步地，由料液比为70mg：3mL的冻干粉和溶媒液组成；所述冻干粉冻干前按质量百分比计，包括以下组分：

甘露糖醇6％、海藻糖1.2％、、寡肽-3 0.0.00085％、寡肽-5 0.00043％、神经酰胺0.08％、精氨酸0.6％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.025％，余量为去离子水；

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

甘油6％、丙二醇5％、北美金缕梅提取物3％、甘草酸二钾2.2％、六肽-9 1％、丁二醇1.3％、、棕榈酰四肽-7 0.7％、尿囊素0.8％、水解胶原0.55％、烟酰胺0.25％、透明质酸钠0.3％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.05％，余量为去离子水。

进一步地，所述冻干粉中各组分的质量百分比为未冻干前的质量百分比。

本发明还提供了一种上述的具有修护功效的冻干精华液的制备方法，将冻干粉和溶媒液按照料液比70mg：3mL进行混合即可得到所述冻干精华液；

所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：

按质量百分比称取所述组分，将各组分混合均匀后先预冷，并预抽真空，之后阶段升温冻干即可得到所述冻干粉；

所述溶媒液的制备方法包括以下步骤：

按质量百分比称取所述组分，将甘油、丙二醇、丁二醇与透明质酸钠、烟酰胺、尿囊素和PEG/PPG-25/30共聚物混合搅拌均匀后，加入水继续搅拌，搅拌结束后升温并降温，之后加入北美金缕梅提取物、、甘草酸二钾、六肽-9、棕榈酰四肽-7和水解胶原继续搅拌均匀后，即可得到所述溶媒液。

进一步地，冻干粉的制备方法中，所述预冷的温度为-40℃，预抽真空的时间为2～3h。

进一步地，冻干粉的制备方法中，所述阶段升温具体为：首先升温到-20℃保温3h，升温到-15℃保温2h，升温到-5℃保温2h，升温到5℃保温3h，升温到15℃保温2h，最后升温到28℃保温5h。

进一步地，溶媒液的制备方法中，所述升温至温度为80℃，保温时间为30min。

进一步地，溶媒液的制备方法中，所述降温至温度为40℃。

本发明所用组分中，甘露糖醇是六碳糖醇，可由果糖经催化氢化制得，吸湿性低，在化妆品中常被用作保湿剂，在冻干粉中主要起到骨架作用。

海藻糖，是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，海藻糖在化妆品上的应用是基于其具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性，是新一代的超级保湿因子。皮肤细胞，尤其是表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分发生角质化，甚至死亡脱落使皮肤受损。海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，从膜上析出的粘液不仅滋润着皮肤细胞，还具有将外来的热量辐射出去的功能，从而保护皮肤不致受损。

寡肽-3(Oligopeptide-3)为丙氨酸与亮氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸组成的十三肽。寡肽-5(Oligopeptide-5)为一种合成的七十三肽。寡肽对于细胞有着多方面地正向作用，它能有效地抑制细胞变性，增强免疫功能，减少胶原蛋白地流失，从而改善松弛，还能激活细胞活性，帮助清除对人体有害的自由基，减少色素沉积等问题；能够帮助受损细胞修复，提升细胞新陈代谢，减少肌肤地氧化，淡化皮肤皱纹；对于生成弹力蛋白、胶原蛋白有促进作用，同时能快速提高动静脉的氨基酸差值，从而加速整体蛋白的合成。基于寡肽易吸收的特点，它又可以进入血液循环，参与肽链的延长，提高蛋白质的合成。而寡肽本身也对氨基酸及其残基的吸收有促进作用，被吸收进入循环系统的寡肽可被水解为游离氨基酸，作为合成组织蛋白的氮源。

神经酰胺是一种由神经鞘氨醇长链碱基与脂肪酸组成的神经鞘氨脂质。主要有神经酰胺磷酸胆碱和神经酰胺磷酸乙醇胺，磷脂是细胞膜的主要成分，角质层中40％～50％的皮脂由神经酰胺构成，神经酰胺是细胞间基质的主要部分，在保持角质层水分的平衡中起着重要作用。神经酰胺，能加强皮肤抗衰老功能，令肌肤保持弹性，光滑细致，减少面部皱纹形成。

北美金缕梅提取物主要成分有单宁酸、儿茶素、原花青素等，可以调节皮脂分泌、具有保湿及嫩白作用，促进淋巴血液循环，能缓和受刺激及过敏性等肌肤，充分收敛粗毛孔，防止黑头和粉刺产生，另外具有深层清洁的功效，可以迅速渗入肌肤，由内而外全面调节和清洁肌肤，使皮肤快速呈现细腻、光滑、紧致状态，能有效帮助夜间肌肤的再生能力。

抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb是一种多功能性多肽，其既具有抗菌性，又具有超氧化物歧化酶的去除自由基的活力，可有效去除自由基对皮肤带来的伤害，同时抑制痤疮部位细菌。

本发明公开了以下技术效果：

本发明具有修护功效的冻干精华液是由冻干粉和溶媒液构成，将、寡肽-3、寡肽-5，以及抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb等具有生物活性成分通过真空冷冻干燥的方法，制备成冻干粉的形式进行保存，解决了化妆品添加活性成分无法长期保存的难题，同时配备溶媒液，在使用的过程中进行调配，能够快速的将冻干粉溶解，配制成精华液。

本发明制备的冻干精华液蕴含肌肤多种修复多肽，能够激活基底细胞，紧致肌肤，淡化细纹；含有的水解胶原、六肽-9、北美金缕梅提取物等成分，可以收缩毛孔、淡化色斑、改善肌肤干燥粗糙，使肌肤柔嫩平滑、丰盈润透、细嫩肌肤；含有的透明质酸、神经酰胺、烟酰胺协同多种植物提取精华，深入肌肤补充水分，持久滋养肌肤、提亮肤色，由内而外改善肌肤状态。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Cb-SOD-Cb融合蛋白结构示意图；

图2为Cb-SOD-Cb融合蛋白结构预测图；其中绿色：SOD，蓝色：linker，红色：CecropinB；

图3为重组载体pET26-Cb-SOD-Cb的示意图；

图4为Cb-SOD-Cb蛋白及重组菌破碎沉淀SDS-PAGE图；其中M：标准分子量marker，1：复性后的重组Cb-SOD-Cb蛋白(0.5mg/mL)，2：复性后的重组Cb-SOD-Cb蛋白(0.5mg/mL)，3：重组菌破碎后离心获得的沉淀物(含Cb-SOD-Cb包涵体)；

图5为本发明实施例1制备得到的冻干精华液对细胞增殖的影响结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所用各组分均可通过市售购买得到，在本发明实施例中，所用甘露糖醇、海藻糖、神经酰胺、北美金缕梅提取物、精氨酸、甘草酸二钾购自沫尔生物科技(上海)有限公司；寡肽-3、寡肽-5、水解胶原、六肽-9、棕榈酰四肽-7购自杭州华玮生物科技有限公司；烟酰胺、透明质酸钠购自山东天晟生物科技有限公司；丙二醇、甘油、购自陶氏化学(上海)有限公司；尿囊素购自宁波翔神生化有限公司；PEG/PPG-25/30共聚物购自广州市汇品源生物科技有限公司。

甘露糖醇1％～8％、海藻糖0.05％～2％、寡肽-3 0.000001％～0.001％、寡肽-50.000001％～0.001％、神经酰胺0.01％～2％、精氨酸0.01％～1％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.001-0.05％，余量为去离子水；

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

甘油2％～10％、丙二醇2％～8％、北美金缕梅提取物1％～5％、甘草酸二钾0.5％～3％、六肽-9 0.1％～2％、丁二醇0.1％～2％、、棕榈酰四肽-7 0.1％～1％、尿囊素0.05％～1％、水解胶原0.01％～1％、烟酰胺0.05％-0.5％、透明质酸钠0.01％～0.5％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.001％～0.1％，余量为去离子水。

甘露糖醇6％、海藻糖1.2％、寡肽-3 0.0.00085％、寡肽-5 0.00043％、神经酰胺0.08％、精氨酸0.6％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.025％，余量为去离子水；

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

本发明还提供了一种上述的具有修护功效的冻干精华液的制备方法，将冻干粉和溶媒液按照料液比为70mg：3mL进行混合即可得到所述冻干精华液；

所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：

所述溶媒液的制备方法包括以下步骤：

进一步地，本发明实施例的冻干粉的制备在东富龙LYO1型号真空冷冻干燥机中进行，将各组分罐装于西林瓶中，置于冻干仓隔板，进入前箱预冷阶段，按设定选择开启循环泵；然后开启第一压缩机及对应的板冷阀，当制品温度达到设定温度时，对后箱进行制冷。后箱预冷时，关闭所有板冷阀，再开启各自冷凝器阀，当后箱盘管温度达到设定值时，开始运行预抽真空，开始运行升华控制，开启电加热，再关闭掺冷阀，冻干结束，先关闭小蝶阀，然后依次关闭真空泵、压缩机、冷凝器阀和循环泵，完成真空冷冻干燥。

进一步地，溶媒液的制备方法中，所述降温至温度为40℃。

进一步地，所述搅拌的转速均为100r/min。

抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb的制备方法为：

(1)重组Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白表达载体构建：天蚕素CecropinB的核苷酸序列3’端连入DQYTD柔性肽段核苷酸序列，再连入编码人锌铜超氧化物歧化酶SOD蛋白的核苷酸序列，再连入DQYTD柔性肽段核苷酸序列，再连入天蚕素CecropinB的核苷酸序列，构成CecropinB-DQYTD-SOD-DQYD-CecropinB串连结构，简称为Cb-SOD-Cb，重组基因结构见图1。

重组蛋白进行3D结构模拟(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)所得空间结构(图2)显示，超氧化物歧化酶SOD与两端天蚕素cecropinB在柔性肽连接下，形成自由开放状态，不会对各自功能区造成影响，该重组蛋白既不破坏SOD的空间结构，又可以对细菌外膜进行攻击，达到抗菌目的。

Cb-SOD-Cb基因序列，通过NdeⅠ和XhoI连接于大肠杆菌表达载体pET26b(+)上，得到重组载体pET26-Cb-SOD-Cb，载体结构见图3。合成基因由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

天蚕素CecropinB的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

AAGTGGAAAGTATTTAAAAAGATAGAAAAAATGGGTCGTAACATTCGTAACGGCATTGTAAAGGCGGGTCCGGCGATCGCCGTTCTGGGCGAAGCTAAAGCTCTG。

编码人锌铜超氧化物歧化酶SOD蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：

GCAACCAAGGCGGTGTGCGTCTTGAAGGGTGACGGTCCGGTGCAGGGTATTATCAACTTCGAGCAGAAAGAGAGCAATGGCCCGGTGAAAGTTTGGGGTTCTATCAAAGGCTTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCACGTGCACGAGTTCGGCGACAATACCGCGGGCTGCACCAGCGCAGGTCCGCATTTTAACCCGCTTTCGCGCAAACACGGCGGCCCAAAAGATGAGGAGCGCCACGTTGGTGACCTCGGCAACGTGACTGCGGATAAGGACGGCGTTGCCGACGTGTCCATTGAAGATAGCGTTATCAGCCTGTCCGGTGATCATTGCATCATTGGCCGTACGCTGGTTGTCCACGAGAAGGCGGACGATCTGGGAAAGGGCGGTAATGAAGAAAGCACCAAGACGGGTAACGCGGGTTCTCGTCTGGCTTGTGGTGTTATCGGCATCGCACAA。

DQYTD柔性肽段核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：GATCAATATACTGAC。

Cb-SOD-Cb基因序列(SEQ ID NO.4)：

ATGAAGTGGAAAGTATTTAAAAAGATAGAAAAAATGGGTCGTAACATTCGTAACGGCATTGTAAAGGCGGGTCCGGCGATCGCCGTTCTGGGCGAAGCTAAAGCTCTGGACCAATACACCGATGCAACCAAGGCGGTGTGCGTCTTGAAGGGTGACGGTCCGGTGCAGGGTATTATCAACTTCGAGCAGAAAGAGAGCAATGGCCCGGTGAAAGTTTGGGGTTCTATCAAAGGCTTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCACGTGCACGAGTTCGGCGACAATACCGCGGGCTGCACCAGCGCAGGTCCGCATTTTAACCCGCTTTCGCGCAAACACGGCGGCCCAAAAGATGAGGAGCGCCACGTTGGTGACCTCGGCAACGTGACTGCGGATAAGGACGGCGTTGCCGACGTGTCCATTGAAGATAGCGTTATCAGCCTGTCCGGTGATCATTGCATCATTGGCCGTACGCTGGTTGTCCACGAGAAGGCGGACGATCTGGGAAAGGGCGGTAATGAAGAAAGCACCAAGACGGGTAACGCGGGTTCTCGTCTGGCTTGTGGTGTTATCGGCATCGCACAAGATCAATATACTGACAAGTGGAAAGTCTTTAAAAAAATCGAGAAAATGGGTCGCAACATCCGTAATGGTATTGTTAAGGCGGGCCCAGCGATCGCGGTGCTCGGCGAGGCGAAGGCGCTGTAA。

天蚕素CecropinB的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：

KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL。

人锌铜超氧化物歧化酶SOD蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：

ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

Cb-SOD-Cb氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

MKWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALDQYTDATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQDQYTDKWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL。

(2)重组蛋白Cb-SOD-Cb表达菌株BL21(DE3)的筛选及表达：

步骤(1)中获得的重组载体pET26-Cb-SOD-Cb，用热激方法转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板筛选出的阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，进行IPTG诱导表达，诱导表达3-6小时后，收集菌体，SDS-PAGE检测蛋白质表达量情况。

具体操作为：从步骤(1)中筛选出的诱导型阳性转化子即pET26-Cb-SOD-Cb/BL21(DE3)菌株，在LB平板上划线培养1天，取单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的1ml LB培养基的5ml离心管中，37℃200rpm过夜培养。第二天，按1％的接种量，接种到新的含有50μg/mL卡那霉素的500mL的LB培养基中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀＝0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1毫摩尔，37℃200rpm进行重组蛋白的诱导表达，诱导5小时后，经4000rpm离心10min，收集菌体。其中，LB培养基是由酵母粉5g、10g蛋白胨和5g氯化钠，加水至1000mL，调节pH值至7.2-7.4，制成。

(3)重组Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白制备

将步骤(2)中筛选出的高表达Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白的大肠杆菌菌株，进行诱导表达后，6000rpm/min，离心10min，收集菌体，置于-20℃条件下，反复冻融三次，加溶菌酶使溶菌酶终浓度为100μg/mL，37℃，孵育20min，超声破碎，超声破碎条件：300w，4s，间6s，20min。破菌缓冲液：20nM PBS(含150nM NaCl)，pH＝7.4。破碎结束后，20000rpm，4℃离心20min，留取沉淀物(大部分为包涵体蛋白)。

包涵体洗杂：用洗涤液I(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，5wt％甘油，1wt％Triton X-100，100mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)，洗涤液II(洗涤液I+0.3M尿素)，洗涤液III(洗涤液I+0.6M尿素)依次洗涤包涵体沉淀。

包涵体溶解(变性)：溶解包涵体沉淀按质量比2：1加入纯水并用小型均质机混合均一，按质量1：25加入8M尿素溶液，并置于磁力搅拌器上搅拌4h得到较为澄清的溶液，20000rpm，4℃离心20min，取澄清的上清液即为Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白的变性液。

包涵体复性：将Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白的变性液和缓冲液(50mM Tirs-HCl，150mM氯化钠，1M尿素，pH＝8.4)按照1：9的体积比进行混合，搅拌均匀，置于4℃冰箱冷藏过夜，离心去除少量沉淀后，采用10kDa的超滤膜包脱盐及浓缩后，即获得重组Cb-SOD-Cb抗氧化抗菌蛋白。

用SDS-PAGE检测重组蛋白，结果见图4，重组菌经过破碎后将沉经电泳后在25kDa大小处有明显条带(泳道3)，判断目的蛋白成功以包涵体表达。将该沉淀物进行洗涤以及包涵体变复性后，按不同浓度进行电泳检测，在25kDa大小处呈现明显条带(泳道1，2)，即为重组(Cb-SOD-Cb)。

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

(1)冻干粉的制备

按质量百分比称取以下组分：甘露糖醇6％、海藻糖1.2％、、寡肽-3 0.0.00085％、寡肽-5 0.00043％、神经酰胺0.08％、精氨酸0.6％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.025％，余量为去离子水。

将各组分混匀后罐装于西林瓶中，置于冻干仓隔板，进入前箱预冷阶段，按设定选择开启循环泵；然后开启第一压缩机及对应的板冷阀，当制品温度达到-40℃时，对后箱进行制冷。后箱预冷时，关闭所有板冷阀，再开启各自冷凝器阀，当后箱盘管温度达到-40℃时，开始预抽真空2.5h，开始运行升华控制，开启电加热，再关闭掺冷阀，首先升温到-20℃保温3h，升温到-15℃保温2h，升温到-5℃保温2h，升温到5℃保温3h，升温到15℃保温2h，最后升温到28℃保温5h，冻干结束，即可得到冻干粉。

(2)溶媒液的制备

按质量百分比称取以下组分：甘油6％、丙二醇5％、北美金缕梅提取物3％、甘草酸二钾2.2％、六肽-9 1％、丁二醇1.3％、、棕榈酰四肽-7 0.7％、尿囊素0.8％、水解胶原0.55％、烟酰胺0.25％、透明质酸钠0.3％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.05％，余量为去离子水。

将甘油、丙二醇、丁二醇与透明质酸钠、烟酰胺、尿囊素和PEG/PPG-25/30共聚物混合在100r/min下室温加入水搅拌30min，搅拌结束后升温至80℃保温30min，之后降温至40℃，加入北美金缕梅提取物、甘草酸二钾、六肽-9、、棕榈酰四肽-7和水解胶原继续搅拌30min后，即可得到溶媒液。

(3)将制备得到的冻干粉与溶媒液按照料液比70mg：3mL进行混合，即可得到具有修护功效的冻干精华液。

实施例2

同实施例1，区别仅在于，冻干粉的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘露糖醇1％、海藻糖2％、、寡肽-3 0.001％、寡肽-5 0.000001％、神经酰胺2％、精氨酸0.01％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.001％，余量为去离子水；溶媒液的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘油10％、丙二醇2％、北美金缕梅提取物5％、甘草酸二钾0.5％、六肽-90.1％、丁二醇2％、、棕榈酰四肽-7 0.1％、尿囊素0.05％、水解胶原0.01％、烟酰胺0.5％、透明质酸钠0.5％、PEG/PPG-25/30共聚物0.1％，余量为去离子水。

实施例3

同实施例1，区别仅在于，冻干粉的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘露糖醇5％、海藻糖0.05％、、寡肽-3 0.000001％、寡肽-5 0.001％、神经酰胺0.01％、精氨酸1％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 1％，余量为去离子水；溶媒液的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘油2％％、丙二醇8％、北美金缕梅提取物1％％、甘草酸二钾3％、六肽-92％、丁二醇2％、、棕榈酰四肽-7 1％、尿囊素1％、水解胶原1％、烟酰胺0.35％、透明质酸钠0.01％％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.001％，余量为去离子水。

实施例4

同实施例1，区别仅在于，冻干粉的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘露糖醇8％、海藻糖0.05％、、寡肽-3 0.000001％、寡肽-5 0.001％、神经酰胺0.01％、精氨酸1％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 1％，余量为去离子水；溶媒液的制备过程中按质量百分比称取以下组分：甘油6％、丙二醇6％、北美金缕梅提取物4％、甘草酸二钾2.5％、六肽-91.5％、丁二醇0.8％、、棕榈酰四肽-7 0.8％、尿囊素0.35％、水解胶原1％、烟酰胺0.45％、透明质酸钠0.01％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.1％，余量为去离子水。

对比例1

同实施例1，区别仅在于，不添加抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb组分。

对比例2

同实施例1，区别在于，不添加寡肽-3、寡肽-5物组分。

对比例3

同实施例1，区别在于，不添加神经酰胺组分。

对比例4

同实施例1，区别在于，不添加北美金缕梅提取物组分。

性能测试

一、冻干粉促细胞增殖实验

(1)将生长状态良好的BALB/3T3 CloneA31细胞消化和收集细胞，计数，调整细胞浓度，1×10 ⁴cells/ml，2000cells/孔接种于96孔板中，100微升/孔，培养基10％FBSDMEM，37℃，5％CO₂条件下培养；

(2)24h后进行细胞饥饿培养，即将培养基换成0.4％FBS DMEM维持培养液，100微升/孔，培37℃，5％CO₂条件下继续培养24h；

(3)取1mL PBS溶解样品，再进行逐级4倍稀释，共6个浓度梯度。将实施例1制备得到的冻干粉与溶媒液按照料液比70mg：3mL混合复溶，并逐级稀释若干倍数加至96孔板中，10微升/孔，培养48-72h。

(4)培养72h后采用MTT检测试剂盒/CCK8试剂盒检测细胞增殖情况，实验结果见图5，由图5可以看出冻干粉浓度0.1mg/mL时即可对细胞有明显促增殖活性。

二、产品功效测试

采用民意调查评分法，选取200名30-60岁年龄段的人作为试用对象，共分5组，每组40人，组1每人每周用本发明实施例1制备的具有修护功效的冻干精华液搽脸14次(即每天2次)，组2每人每周用本发明对比例1制备的具有修护功效的冻干精华液搽脸14次(即每天2次)，组3每人每周用本发明对比例2制备的具有修护功效的冻干精华液搽脸14次(即每天2次)，组4每人每周用本发明对比例3制备的具有修护功效的冻干精华液搽脸14次(即每天2次)使用时间为两个月，组5每人每周用本发明对比例4制备的具有修护功效的冻干精华液搽脸14次(即每天2次)使用时间为两个月。各项使用效果总分为5分：5分为最高分，表示较好，非常满意；4分为很好；3分为可以接受；3分以下为不好，不能接受。使用实施例1的各项平均得分，结果见表1，冻干粉具有较好的美白、祛痘、滋养及保湿效果，具有一定的修护作用。

表1综合效果考察

使用效果	平均得分
		美白	4.9
祛痘	4.8
		滋养	4.9
保湿	4.7

对比例1制备得到的产品使用方法同实施例1，结果如表2，结果显示由于缺少了抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb组分，降低了抗氧化及抗菌能力，该对比例制备的冻干粉精华液的美白祛痘效果有所降低。

表2综合效果考察

使用效果	平均得分
		美白	3.9
祛痘	4.3
		滋养	4.8
保湿	4.7

对比例2制备得到的产品使用方法同实施例1，结果如表3，结果显示由于促细胞增殖功效的降低，该对比例制备的冻干粉精华液的痘肌修复及滋养效果有所减弱。

表3综合效果考察

使用效果	平均得分
		美白	4.9
祛痘	4.2
		滋养	3.9
保湿	4.8

对比例3制备得到的产品使用方法同实施例1，结果如表4，结果显示由于缺少神经酰胺，该对比例制备的冻干粉精华液的保湿性有所下降。

表4综合效果考察

对比例4制备得到的产品使用方法同实施例1，结果如表5，结果显示由于缺少防敏的植物提取物，该对比例制备的冻干粉精华液的祛痘效果略有下降。

表5综合效果考察

使用效果	平均得分
		美白	4.8
祛痘	4.3
		滋养	4.9
保湿	4.7

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 杭州水芭莎生物医药科技有限公司

<120> 一种具有修护功效的冻干精华液及其制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagtggaaag tatttaaaaa gatagaaaaa atgggtcgta acattcgtaa cggcattgta 60

aaggcgggtc cggcgatcgc cgttctgggc gaagctaaag ctctg 105

<210> 2

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaaccaagg cggtgtgcgt cttgaagggt gacggtccgg tgcagggtat tatcaacttc 60

gagcagaaag agagcaatgg cccggtgaaa gtttggggtt ctatcaaagg cttgaccgaa 120

ggtctgcatg gttttcacgt gcacgagttc ggcgacaata ccgcgggctg caccagcgca 180

ggtccgcatt ttaacccgct ttcgcgcaaa cacggcggcc caaaagatga ggagcgccac 240

gttggtgacc tcggcaacgt gactgcggat aaggacggcg ttgccgacgt gtccattgaa 300

gatagcgtta tcagcctgtc cggtgatcat tgcatcattg gccgtacgct ggttgtccac 360

gagaaggcgg acgatctggg aaagggcggt aatgaagaaa gcaccaagac gggtaacgcg 420

ggttctcgtc tggcttgtgg tgttatcggc atcgcacaa 459

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcaatata ctgac 15

<210> 4

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaagtgga aagtatttaa aaagatagaa aaaatgggtc gtaacattcg taacggcatt 60

gtaaaggcgg gtccggcgat cgccgttctg ggcgaagcta aagctctgga ccaatacacc 120

gatgcaacca aggcggtgtg cgtcttgaag ggtgacggtc cggtgcaggg tattatcaac 180

ttcgagcaga aagagagcaa tggcccggtg aaagtttggg gttctatcaa aggcttgacc 240

gaaggtctgc atggttttca cgtgcacgag ttcggcgaca ataccgcggg ctgcaccagc 300

gcaggtccgc attttaaccc gctttcgcgc aaacacggcg gcccaaaaga tgaggagcgc 360

cacgttggtg acctcggcaa cgtgactgcg gataaggacg gcgttgccga cgtgtccatt 420

gaagatagcg ttatcagcct gtccggtgat cattgcatca ttggccgtac gctggttgtc 480

cacgagaagg cggacgatct gggaaagggc ggtaatgaag aaagcaccaa gacgggtaac 540

gcgggttctc gtctggcttg tggtgttatc ggcatcgcac aagatcaata tactgacaag 600

tggaaagtct ttaaaaaaat cgagaaaatg ggtcgcaaca tccgtaatgg tattgttaag 660

gcgggcccag cgatcgcggt gctcggcgag gcgaaggcgc tgtaa 705

<210> 5

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala

20 25 30

Lys Ala Leu

35

<210> 6

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly

1 5 10 15

Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp

20 25 30

Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His

35 40 45

Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe

50 55 60

Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His

65 70 75 80

Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp

85 90 95

Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile

100 105 110

Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys

115 120 125

Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu

130 135 140

Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145 150

<210> 7

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile

1 5 10 15

Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu

20 25 30

Ala Lys Ala Leu Asp Gln Tyr Thr Asp Ala Thr Lys Ala Val Cys Val

35 40 45

Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys

50 55 60

Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr

65 70 75 80

Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala

85 90 95

Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His

100 105 110

Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val

115 120 125

Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val

130 135 140

Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val

145 150 155 160

His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr

165 170 175

Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile

180 185 190

Ala Gln Asp Gln Tyr Thr Asp Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu

195 200 205

Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala

210 215 220

Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu

225 230

Claims

1.一种具有修护功效的冻干精华液，其特征在于，由料液比为70mg：3mL的冻干粉和溶媒液组成；所述冻干粉冻干前按质量百分比计，包括以下组分：

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

甘油2％～10％、丙二醇2％～8％、北美金缕梅提取物1％～5％、甘草酸二钾0.5％～3％、六肽-9 0.1％～2％、丁二醇0.1％～2％、、棕榈酰四肽-7 0.1％～1％、尿囊素0.05％～1％、水解胶原0.01％～1％、烟酰胺0.05-0.5％、透明质酸钠0.01％～0.5％、、PEG/PPG-25/30共聚物0.001％～0.1％，余量为去离子水。

2.根据权利要求1所述的具有修护功效的冻干精华液，其特征在于，由料液比为70mg：3mL的冻干粉和溶媒液组成；所述冻干粉冻干前按质量百分比计，包括以下组分：

甘露糖醇6％、海藻糖1.2％、、寡肽-3 0.0.00085％、寡肽-5 0.00043％、神经酰胺0.08％、精氨酸0.6％、抗菌肽融合蛋白Cb-SOD-Cb 0.025％；

所述溶媒液按质量百分比计，包括以下组分：

3.一种权利要求1～2任一项所述的具有修护功效的冻干精华液的制备方法，其特征在于，将冻干粉和溶媒液按照料液比为70mg：3mL进行混合即可得到所述冻干精华液；

所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：

所述溶媒液的制备方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，冻干粉的制备方法中，所述预冷的温度为-40℃，预抽真空的时间为2～3h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，冻干粉的制备方法中，所述阶段升温具体为：首先升温到-20℃保温3h，升温到-15℃保温2h，升温到-5℃保温2h，升温到5℃保温3h，升温到15℃保温2h，最后升温到28℃保温5h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，溶媒液的制备方法中，所述升温至温度为80℃，保温时间为30min。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，溶媒液的制备方法中，所述降温至温度为40℃。