CN114946659A - 一种短柱铁线莲的离体快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短柱铁线莲的快速繁殖方法，包括以下步骤:S1供试材料选取；S2外植体消毒；S3腋芽增殖：增殖培养基为MS+1.0～1.5mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2；S4腋芽生根：生根培养基为DKW+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2。通过本发明的技术对短柱铁线莲进行培育，生根率高，根苗强壮，移栽后成活率高。
Description
技术领域
本发明涉及短柱铁线莲的离体快繁方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
短柱铁线莲(Clematis cadmia)为铁线莲属的多年生草本，全株被稀疏开展的柔毛，茎圆柱形，有六条明显的纵纹。二回三出复叶或羽状复叶，小叶片仅中脉上被疏柔毛，其余无毛；小叶柄不明显。单花腋生，花梗细瘦，中下部有一对叶状苞片；花小，淡紫色或淡白色，萼片5-6枚；瘦果扁平，倒卵形；花期4月至5月，果期6月至7月。在我国分布于江西北部，安徽南部，浙江北部及江苏南部。生于溪边，路边的草丛中，喜阴湿环境。越南、印度也有分布。该种根为药用：有祛瘀，利尿，解毒之功效。该种不仅有良好的药用价值，还有很高的观赏价值，园林中可用于垂直绿化。该种主要的繁殖方式为播种和扦插，繁殖周期长，且增殖率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种短柱铁线莲的快速繁殖方法，由本方法生产的短柱铁线莲，具有繁殖周期短、增殖率高、移栽成活率高等优点，可以进行工业化生产。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种短柱铁线莲的离体快繁方法，包括以下步骤：
S1供试材料选取：
剪取短柱铁线莲的新鲜枝条，剪去叶片，剪成2～3cm长的带芽茎段，经多菌灵和表面活性剂预处理；
S2外植体消毒：
将S1中预处理后的带芽茎段进行消毒处理；
S3腋芽增殖：
将S2消毒处理后的带芽茎段，平放接种于增殖培养基中，24±1℃温度下培养，获得分化的丛生芽；所述增殖培养基为MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2；
S4腋芽生根：
取S3分化出的丛生芽，剪成2～3cm高的小苗，竖直接入生根培养基中，24±1℃温度下培养，获得生根组培苗；所述生根培养基为DKW+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2。
优选地，本发明短柱铁线莲的离体快速繁殖方法的具体步骤如下：
S1供试材料：剪取短柱铁线莲的新鲜枝条，剪去叶片，将带芽茎段剪成2～3cm长，放入广口瓶，加入浓度为0.1g/ml多菌灵溶液，每100mL溶液加入2～3滴吐温80，混匀后置于150rpm的摇床上摇30min之后，将其置于流动的自来水下冲洗30min，转移到超净台的无菌瓶中；
S2外植体消毒：将S1中预处理的外植体用75％的酒精处理10min，再用无菌水清洗两遍，以5％的NaClO溶液处理10min。再次用无菌水清洗3遍，将清洗后的茎段用灭菌的滤纸吸干；
S3腋芽增殖：以MS为基础培养基，分别添加6-BA浓度1.0mg/mL、NAA浓度0.5mg/mL、蔗糖浓度为30g/L，将S2中消毒后的茎段剪掉两端0.5cm长度部分后，平躺接种于培养基上，培养30d；
S4腋芽生根：以DKW为基础培养基，添加生长素IBA浓度1.0mg/L、蔗糖浓度为30g/L，将S3经腋芽增殖后获得的丛生芽剪成2cm高的小苗，竖直接入培养基中，培养45～50d；
S3和S4的培养温度和光照条件：温度为24±1℃，光照为2000Lks，16h/d。
S5移栽炼苗：将S4已经生根的组培苗(45天左右，根系比较发达，大约长出3～4条主根，即可进行移栽)，移栽前需在培养室内半开盖子，培养2～3d，然后将盖子完全打开，培养2～3d。取出幼苗后将其根部的培养基清除干净，移栽入高温灭菌处理的蛭石(120℃，20min)当中；放在人工气候室培养，温度维持24±1℃，2天浇一次水，保持其湿度，培养20天后将苗移栽于蛭石：腐殖土(质量比)＝1:1的基质中，转置大棚培养，2～3d浇一次水。
本发明相比现有技术具有以下优点：
不同铁线莲品种再生体系的建立过程中存在着差别，本研究以野生型的短柱铁线莲为实验材料，剪取带芽茎段作为外植体，结合不同类别的基础培养基，植物生长调节剂和浓度配比，通过探索外植体消毒、腋芽增殖、腋芽生根、移栽炼苗等过程的探索，建立短柱铁线莲稳定的组培快繁体系，从而为大批量生产提供优质种苗提供技术支撑；
通过本发明的技术对短柱铁线莲进行培育，生根率高，根苗强壮，移栽后成活率高。
附图说明
图1为实施例1中带芽茎段剪取示意图；
图2为实施例1中腋芽增殖培养效果示意图；
图3为实施例1中腋芽生根培养效果示意图；
图4为实施例1中再生苗移栽效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本发明短柱铁线莲的离体快速繁殖方法具体步骤：
1、取材：以短柱铁线莲当年生的幼嫩枝条作为外植体，枝条生长健壮，叶片与母本的性状相吻合，且有饱满而未发芽的腋芽；取材当日的天气最好是晴天无雨时。
2、外植体消毒：剪去多余的叶片，叶柄剪干净，保留2～3cm长的带芽茎段(如图1所示)，于广口瓶中，加入处理液，加入量为浸没所有的带芽茎段为宜，处理液采用浓度为0.1g/ml多菌灵溶液，每100mL多菌灵溶液中加入2～3滴吐温80，混匀后置于150rpm的摇床上摇30min，之后在流动的自来水下冲洗30min，转移到无菌的超净台中，75％的酒精处理10min，再用无菌水清洗两遍，以5％的NaClO溶液处理10min。无菌水冲洗3遍。
3、接种：超净工作台内，将消毒后的带芽茎段先用无菌滤纸吸掉多余的水份后，剪掉两端0.5cm部分，接入腋芽增殖的培养基中，腋芽增殖的培养基配方为：MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖，pH6.0～6.2，24±1℃下，光照为2000Lks，16h/d，培养30d，获得丛生芽，增殖率为5.4，苗高7cm,如图2所示。
4、生根：将分化出的丛生芽剪成2cm高的小苗，接入生根培养基中，生根培养基的配方为：DKW+1.0mg/LIBA+30g/L蔗糖PH 6.0～6.2。培养温度和光照条件：温度为24±1℃，光照为2000Lks，16h/d。生根率为53.3％，根长4.8cm，如图3所示。
5、移栽与炼苗:步骤4中小苗生根培养45d左右，根系比较发达，大约长出3～4条主根(如图3所示)，即可进行移栽，移栽前需在培养室内半开盖子，培养2～3d，然后将盖子完全打开，培养2～3d。取出幼苗后将其根部的培养基清除干净，移栽入高温灭菌处理的蛭石(120℃，20min)中(如图4所示)，放在人工气候室培养，温度维持25℃，2天浇一次水，保持其湿度，培养20天后，将苗移栽于蛭石：腐殖土(质量比)＝1:1的基质中，转置大棚培养。成活率为90.5％±1.3％。
实施例2
腋芽增殖培养基的筛选实施例
1.试验：将消毒后的茎段接种到增殖培养基中进行培养，添加不同浓度的激素比，诱导丛生芽，选择增殖系数最高的培养基进行后续的增殖培养，每种处接种10个芽，4次重复，30d后统计发芽率、增殖系数及生长状况。
2.结论：如表1所示，当6-BA的浓度小于1.0mg/L时，JMY9、JMY10的发芽率较低，且再生苗矮小，易枯萎。其它培养基的发芽率都很高；JMY8与JMY3相比多加了zt(玉米素),可以促进茎段的发芽及腋芽增殖；当NAA的浓度为0.05mg/L时，增殖系数较高，如JMY11、JMY12，两者相比较，可见JM12的发芽率和增殖系数都很高，且没有显著差异(P≤0.05)，故最佳增殖培养基为MS+1.0～1.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖，pH6.0～6.2,发芽率为93.9％，增殖系数为5.4。
表1不同激素比对短柱铁线莲增殖的影响
注：(P≤0.05)，表中数值是平均值±标准误。同列不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)
实施例3
生根培养基的筛选实施例
1.试验：将生长健康带有2～3片子叶，1～2个芽点的组培苗接入生根培养基中，以DKW为基本培养基，分别添加不同的生长素，每种接入外植体10个，4次重复；50d后统计生根率和生根数，筛选出最佳生根的基础培养基。
2.结论：如表2所示，不加生长素的培养基GD0也可以诱导生根，且生根数、根长、苗高、枯萎率与最佳的GD1培养基相比，无显著差异(P≤0.05)；只添加一种生长素的培养基比添加两种生长素的培养基生根率要高，且添加两种生长素的GD3的苗生根数少，枯萎率高；只添加NAA的GD2生根率最低，苗不高，易枯萎；故最佳生根培养基为DKW+1.0mg/LIBA+30g/L蔗糖，pH6.0～6.2,生根率为52.3％，生根数为2，根长4.8cm，枯萎率为5.6％。
表2不同生长素对短柱铁线莲生根的影响
注：(P≤0.05)，表中数值是平均值±标准误。同列不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)。
Claims (9)
1.一种短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述短柱铁线莲的离体快繁方法包括以下步骤：
S1供试材料选取
剪取短柱铁线莲的新鲜枝条，剪去叶片，剪成2～3cm长的带芽茎段，经多菌灵和表面活性剂预处理；
S2外植体消毒
将S1中预处理后的带芽茎段进行消毒处理；
S3腋芽增殖
将S2消毒处理后的带芽茎段，平放接种于增殖培养基中，24±1℃温度下培养，获得分化的丛生芽；所述增殖培养基为MS+1.0～1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2；
S4腋芽生根
取S3分化出的丛生芽，剪成2～3cm高的小苗，竖直接入生根培养基中，24±1℃温度下培养，获得生根组培苗；所述生根培养基为DKW+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖，pH值为6.0～6.2。
2.根据权利要求1所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述增殖培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖。
3.根据权利要求1所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，S1中预处理采用浓度为0.1g/ml多菌灵溶液，每100mL多菌灵溶液中加入表面活性剂为2～3滴吐温80，混匀后放入带芽茎段，置于150rpm的摇床上摇30min。
4.根据权利要求2所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，S2中茎段灭菌后剪掉两头0.5cm，增殖培养时间为30天。
5.根据权利要求3所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述S2、S3中培养光照条件为：光照为2000Lks，16h/d，生根培养时间为45～50天。
6.根据权利要求4所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述短柱铁线莲的离体快繁方法还包括如下步骤：
S5移栽练苗
将S4中获得的生根组培苗，在培养室内半开盖子，培养2～3天，然后将盖子完全打开，培养2～3天；取出幼苗后将其根部的培养基清除干净，移栽入高温灭菌处理的蛭石中，放在人工气候室培养，温度维持25℃，2天浇一次水，保持其湿度，培养20天后移栽至栽培基质中，转置大棚培养。
7.根据权利要求5所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述S5中栽培基质采用蛭石与腐殖土质量比1:1的混合基质。
8.根据权利要求6所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述S1中带芽茎段经多菌灵和表面活性剂预处理的具体过程为：将带芽茎段放入广口瓶中，加浓度为0.1g/ml多菌灵溶液，每100mL多菌灵溶液中加入2～3滴吐温80，混匀后置于150rpm的摇床上摇30min，之后在流动的自来水下冲洗30min；所述S2中外植体消毒处理的具体过程为：将S1中预处理的茎段转移到无菌的超净台中，75％的酒精处理10min，再用无菌水清洗两遍，以5％的NaClO溶液处理10min，无菌水冲洗3遍。
9.根据权利要求7所述的短柱铁线莲的离体快繁方法，其特征在于，所述S3腋芽增殖培养前，将S2消毒处理后的茎段用灭菌的滤纸吸干后，剪掉茎段两端0.5cm长度部分后，再接入增殖培养基中。
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