CN114939133A

CN114939133A - 绞股蓝提取物和雪松醇组合物及在防脱育发领域的应用

Info

Publication number: CN114939133A
Application number: CN202210123647.8A
Authority: CN
Inventors: 王本阳; 刘小锦
Original assignee: Shanghai Hillway Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Tianwangyeng Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2022-08-26

Abstract

本发明涉及A61K，更具体地，本发明涉及绞股蓝提取物和雪松醇组合物及在防脱育发领域的应用，包括绞股蓝组分和雪松醇。本发明提供一种组合物，通过细胞和分子水平研究发现通过调控绞股蓝和雪松醇的用量，可促进VEGF的表达，抑制TGF‑β因子的表达，且促进Wnt/β‑catenin通路对毛囊的刺激，从而促进毛乳头细胞的增殖和分化，提高早期生长期的诱导效果，进而促进对毛囊的生长的作用，且通过绞股蓝和雪松醇的协同增效，可显著提高对毛乳头细胞增殖的效果，从而当将绞股蓝和雪松醇用量放大到生物水平观察毛发和毛囊生长情况时，可在低的浓度下达到和现有药物米诺地尔类似甚至更好的效果，可有效减少绞股蓝用量。

Description

绞股蓝提取物和雪松醇组合物及在防脱育发领域的应用

技术领域

本发明涉及A61K，更具体地，本发明涉及绞股蓝提取物和雪松醇组合物及在防脱育发领域的应用。

背景技术

脱发常用药物如口服非那雄胺和局部用米诺地尔存在明显副作用，需要提供更安全且效果更好的产品，且随着生物领域的逐渐发展，在细胞水平对防脱育发的研究逐渐增加。

CN111437299A提供绞股蓝植物提取物溶液及其在制备促进毛发生长药物中的应用。可促进人真皮乳头细胞的增殖，增加毛囊细胞个数，增大毛囊生长长度，增加毛发生长长度。

但是单纯的绞股蓝植物提取物溶液使用时，需要较高的浓度，影响了绞股蓝的应用，故需提供一种产品，可在更低浓度下达到更好的防脱育发效果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种绞股蓝提取物和雪松醇组合物，包括绞股蓝组分和雪松醇。

作为本发明一种优选的技术方案，所述绞股蓝组分和雪松醇的重量比为0.005-3.8475：0.01-0.5，可列举的有，0.005：0.05、0.01：0.05、0.05：0.05、0.1：0.05、0.2：0.05、0.5：0.05、1：0.05、1.5：0.05、2：0.05、2.5：0.05、3：0.05。

发明人研究发现，当单独使用绞股蓝提取物作为防脱育发组分时，需要在200mg/mL的浓度下才能和2％米诺地尔起到相似的人真皮乳头细胞增殖效果，但是当采用绞股蓝组分和雪松醇作用时，可在更低浓度下促进人真皮乳头细胞的增殖，从而促进毛囊的生长和毛基质细胞分化，促进毛囊粗大，减少闭合性毛囊，实现和米诺地尔相似甚至更高的促进效果。

作为本发明一种优选的技术方案，所述绞股蓝组分包括绞股蓝提取物，GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM EXTRACT是从绞股蓝GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM中分离得到，包括50余种绞股蓝皂甙，属于四环三萜类玛皂甙，具有消炎解毒等功效。

作为本发明一种优选的技术方案，所述绞股蓝组分还包括载体，所述载体选自水、醇、糖类载体中的至少一种，优选为水或糖类载体。

作为醇的实例，可列举的有，乙醇、甲醇、丙醇。作为糖类载体的实例，可列举的有，木糖醇、环糊精、糊精、赤藓糖醇等。

作为本发明一种优选的技术方案，所述载体占绞股蓝提取物的重量百分数小于50wt％，如40～50wt％(不包括50wt％)。

本发明第二个方面提供了一种防脱育发制剂，包括如上所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，所述绞股蓝组分占制剂的重量百分数为0.005-3.8475wt％，如0.005wt％、0.01wt％、0.02wt％、0.04wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2wt％、2.1wt％、2.5wt％、2.8wt％、3wt％、3.5wt％、3.8475wt％；所述雪松醇占制剂的重量百分数为0.01-0.5wt％，如0.01wt％、0.02wt％、0.03wt％、0.04wt％、0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述制剂为粉剂、片剂、颗粒剂、液体制剂、胶囊中的至少一种，不做具体限定。当为粉剂、片剂、胶囊、颗粒剂等固体制剂时，其填料可为糖类等有机物或滑石等无机物，当为液体制剂时，其填料可为水、醇等，不做具体限定，只需药用可接受或者可用于外涂等。

此外，除组合物和填料外，制剂中还可包括药用可接受的其他助剂，如维生素、粘合剂、抗氧剂等，不做具体限定。

本发明第三个方面提供了一种绞股蓝提取物和雪松醇组合物在防脱育发领域的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明提供一种组合物，通过细胞和分子水平研究发现通过调控绞股蓝和雪松醇的用量，可促进VEGF的表达，抑制TGF-β因子的表达，且促进Wnt/β-catenin通路对毛囊的刺激，从而促进毛乳头细胞(DPCs)的增殖和分化，提高早期生长期的诱导效果，进而促进对毛囊的生长的作用，且通过绞股蓝和雪松醇的协同增效，可显著提高对毛乳头细胞增殖的效果，从而当将绞股蓝和雪松醇用量放大到生物水平观察毛发和毛囊生长情况时，可在低的浓度下达到和现有药物米诺地尔类似甚至更好的效果，可有效减少绞股蓝用量，此外，本发明提供的组合物和制剂具有高的安全性，几乎无刺激，具有广泛适用性。

附图说明

图1为不同浓度的绞股蓝提取物和雪松醇组合物对DPCs增殖的影响。

图2为不同浓度的绞股蓝提取物和雪松醇组合物对VEGF的影响。

图3为不同浓度的绞股蓝提取物和雪松醇组合物对TGF-β的影响。

图4为不同浓度的绞股蓝提取物和雪松醇组合物对Wnt/β-catenin的影响。

图5为小鼠实验照片。

图6为HE染色法测定小鼠毛囊组织的变化图。

具体实施方式

实施例

实施例中绞股蓝组分为市售产品，购自道斯夫生物(包括绞股蓝提取物50.3wt％，糊精49.7wt％)。

实施例1-4提供一种绞股蓝提取物和雪松醇组合物及制剂，测定人毛乳头细胞增殖率，和人毛乳头细胞中VEGF、TGF-β、Wnt/β-catenin因子的mRNA

实施例1-4提供一种组合物，包括绞股蓝组分和雪松醇，重量比见表1所示。

表1

实施例	绞股蓝组分和雪松醇重量比
		1	0.005：0.05
2	0.01：0.05
		3	0.02：0.05
4	0.04：0.05

实施例1-4还提供包括组合物的制剂，所述制剂的制备原料按重量百分数计，如表2所示。

表2

1、CCK-8法测定人毛乳头细胞增殖率

根据CN111437299A进行测试，采用比色法检测细胞的生长。细胞增殖通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)(Sigma,St.Louis,MO,USA)测定。具体为：在96孔微孔板里，每个孔接种10⁴个人真皮乳头细胞(购自美国CellApplications)孵育24h，将细胞与100μL无血清Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma)一起培养24h；然后分别加入实施例1～4的制剂，无血清DMEM培养基和聚乙二醇辛基苯基醚(Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)培养基分别用作阴性(NC)和空白对照，将10μM米诺地尔用作体外阳性对照(PC)；处理24h后，向每个孔中加入10μLCCK-8溶液，然后将细胞在37℃下孵育3h。用微孔板分光光度计(EpochMulti-VolumeVolumeSpectrophotometerSystem,Epoch,VT,USA)在450nm(测试波长)和650nm(参考波长)处测量吸光度，测得的吸光度用于通过以下方程式确定细胞增殖：

Cellproliferation(％)＝

[(ABSsample-ABSblank)450nm-(ABSsample-ABSblank)650nm]/

[(ABScontrol-ABSblank)450nm-(ABScontrol-ABSblank)650nm]，如图1所示。发现随着绞股蓝组分用量增加，增殖率相对空白对照组均明显提高，且使用更低浓度的绞股蓝组分和雪松醇制剂时，和阳性对照组的增殖率127.3％相比也明显提高，可知通过绞股蓝组分和雪松醇时，可充分协同增效，促进毛发生长。且分别计算每个实施例5次重复的方差，发现实施例均方差相比于平均值的比值小于5％。

2、RT-PCR定量检测人毛乳头细胞中VEGF、TGF-β、Wnt/β-catenin因子的mRNA

将人毛乳头细胞以10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔组织培养板中培养过夜。用不同实施例提供的制剂和米诺地尔溶液处理细胞，设置空白对照。用PCR仪用两步RT-PCR试剂盒从40纳克总RNA合成cDNA，通过凝胶记录和系统分析机器测量RT-PCR反应产物密度，得到VEGF、TGF-β、Wnt/β-catenin因子的mRNA的数据，结果分别见图2、3、4，可发现随着绞股蓝和雪松醇，整体上明显有利于VEGF、Wnt/β-catenin的表达，且可对TGF-β起到抑制作用，从而促进对毛乳头细胞的初期诱导，促进毛发生长。

实施例5提供一种绞股蓝提取物和雪松醇及制剂，通过小鼠实验测定小鼠毛囊组织的变化

因为药物相对细胞水平，对生物水平的作用会下降，故对本发明实施例1-4提供的组合物和制剂进行放大，提供实施例5考察作用于生物时对毛囊的作用，故实施例5提供一种更高用量的组合物以及制剂，其中组合物包括绞股蓝组分和雪松醇，重量比为0.2：0.05，制剂按重量百分数计，包括绞股蓝提取物0.2％、雪松醇0.05％、和余量的水。

如图5所示，将实施例5提供的制剂(图5右)、2.0％的米诺地尔水溶液(图5中)、85％的酒精(图5左)分别作为实验组、阳性对照组和阴性对照组，分别喷施在小鼠给药部位，每天喷施200微升，喷施35天后，用HE染色法测定小鼠毛囊组织的变化与比较：

(1)取材：剪下小鼠给药部位背皮，在PBS中冲洗多次，修整形状为矩形，迅速将其置于4％多聚甲醛中固定，18h；

(2)梯度脱水：50％的乙醇2h→75％的乙醇2h→85％的乙醇2h→95％的乙醇2h→100％乙醇1h→100％的乙醇1h→二甲苯作用15min→二甲苯15min；

(3)包埋：将组织置于石蜡中浸蜡过夜，次日进行包埋。

(4)切片：5μm切片，60℃烤片3.5h；

(5)梯度脱水：先是二甲苯作用15min→更换二甲苯作用15min→100％的乙醇作用3min→95％的乙醇作用5min→85％的乙醇继续作用3min→75％乙醇持续作用5min→50％的乙醇脱水4min→然后ddH2O清洗3min；

(6)染色：使用苏木素染色1～2min，之后用水冲洗，水流要细小不能过大，直至切片发蓝后，再冲洗另一面；

(7)分色：用盐酸乙醇溶液3～5s来分色(多次提插)，直至切片变成红色，并且红色比较浅，这一步目的是褪去细胞质的着色，而加深细胞核的着色；

(8)返蓝：水浸泡15min；

(9)复染：甩干多余水分，伊红液2min；

(10)脱水：分别用不同纯度乙醇脱水，步骤为50％的乙醇3min，75％的乙醇3min，85％的乙醇作用4min，95％的乙醇作用3min，100％的乙醇持续作用5min，100％的乙醇作用5min，用滤纸吸取多余的乙醇，再用二甲苯脱水4min，重复一次；

(11)封片：直接从二甲苯中取出载玻片，擦干净组织四周的二甲苯，于组织上快速地滴加一滴中性树胶，清洗盖玻片，酒精上烘3～5s，将另一面轻轻覆盖在树胶上，要保证此过程中无气泡。

(12)显微镜下观察切片并拍照记录，如图6所示，其中可发现空白对照组(图6左)毛囊细小，而本发明提供的组合物(图6右)和阳性对照组(图6中)毛囊粗壮，且相对于阳性对照组减少了闭合毛囊的数目。

Claims

1.一种绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，包括绞股蓝组分和雪松醇，所述绞股蓝组分包括绞股蓝提取物。

2.根据权利要求1所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，所述绞股蓝组分和雪松醇的重量比为0.005-3.8475：0.01-0.5。

3.根据权利要求2所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，所述绞股蓝组分和雪松醇的重量比为0.005-2：0.01-0.1。

4.根据权利要求3所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，所述绞股蓝组分和雪松醇的重量比为0.02-1：0.01-0.1。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，所述绞股蓝组分还包括载体，所述载体选自水、醇、糖类载体中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物，其特征在于，所述载体占绞股蓝提取物的重量百分数小于50wt％。

7.一种防脱育发制剂，其特征在于，包括权利要求1～6任意一项绞股蓝提取物和雪松醇组合物，所述绞股蓝组分占制剂的重量百分数为0.005-3.8475wt％，所述雪松醇占制剂的重量百分数为0.01-0.5wt％。

8.根据权利要求7所述的防脱育发制剂，其特征在于，所述绞股蓝组分占制剂的重量百分数为0.005-2wt％，优选为0.02-1wt％，所述雪松醇占制剂的重量百分数为0.01-0.1wt％。

9.根据权利要求7所述的防脱育发制剂，其特征在于，所述制剂为粉剂、片剂、颗粒剂、液体制剂、胶囊中的至少一种。

10.一种根据权利要求1～6任意一项所述的绞股蓝提取物和雪松醇组合物在防脱育发领域的应用。