CN114931598B - 一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法 - Google Patents

一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法，属于医药技术领域。将罗伊乳杆菌、布拉酵母菌、乳酸杆菌加入含有中药提取物、可溶性碳源、氨基酸的发酵培养基中发酵，制得发酵益生菌组合物，并与乳香胶、泽兰黄酮、抗氧化维生素、铋剂、益生元、短链脂肪酸混合均匀，压片，得到活性组合物片，包衣，制得预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。本发明通过各组分协同复配，起到很好的预防和减少幽门螺旋杆菌感染的效果，并制成胃溶缓释片，进入人体后，可以在胃酸特定环境下缓慢释放活性组合物，起到长效调节，延长反应效果的作用。

Description

一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobactorpylori，幽门螺杆菌)是革兰氏阴性螺旋形细菌，该菌专门定植于人类的胃上皮，是引起慢性胃炎、十二指肠炎和胃溃疡的主要病因，并且也是胃癌和胃淋巴瘤发生的一个主要危险因素。世界上有超过50％的人群感染幽门螺杆菌，但是只有约15％的人群会导致疾病的发生。造成这种结果的原因除了与宿主本身的遗传易感性、环境因素相关外还与所感染菌株的毒力相关。幽门螺杆菌具有5至6根类似动物尾巴的鞭毛作为运动器官，并且利用鞭毛直接穿过胃壁上的粘性黏液而附着在胃黏膜的表面上。尿素酶在个体之间在遗传上保存完好，这是在大多数幽门螺杆菌菌株中发现的共同特征。尿素酶将尿素水解为氨(NH3)和二氧化碳(CO2)，使得细菌在具有细菌无法存活的低pH的胃黏膜中存活，以提高周围的pH并且中和胃酸，从而细菌存活。由产生的氨的影响引起胃黏膜中的细胞损坏和突变，从而失去胃酸防御作用，并且产生胃酸攻击胃黏膜的恶性循环，引起胃组织病变和炎症反应。因此，由幽门螺杆菌分泌的各种细胞毒素因子引起的胃黏膜炎症诱导各种炎症细胞如淋巴细胞和巨噬细胞的活化。据报道，炎症细胞在体内具有诸如组织损伤、细胞毒性等的不利影响，并且诱导炎症性诱导介质以使炎症恶化。
随着现代生物分子技术的发展，人们已经发现具有不同毒力的幽门螺杆菌菌株，而传统的3联或4联疗法(PPI加2或3种抗生素)对不同毒力的幽门螺杆菌的菌株根除率不同，有10％-25％的患者可能第一次根除失败。根除失败不仅对患者的生活和心理产生极大的影响，而且极易产生耐药菌。目前广泛幽门螺杆菌根除治疗后幽门螺杆菌感染率较前有所下降，但反复大量抗菌药物的使用可引起敏感菌数量的减少、耐药菌的繁殖以及菌群数量和种类的失衡，质子泵抑制剂会引起胃内pH升高，从而进一步导致菌群失调。同时，对很多感染低毒力菌株的幽门螺杆菌阳性患者来说，由于症状轻微，采用抗生素治疗带来的副作用还有可能超越因感染低毒力幽门螺杆菌菌株所造成的影响。对感染幽门螺杆菌菌株的患者来说，最好能提供一种几乎没有副作用、又能长期控制或者根除幽门螺杆菌的新疗法具有很现实的意义。因此，“以菌治菌”的微生态疗法提供了新的思路。很多动物试验已经表明，幽门螺杆菌可以在无菌小鼠的胃内定植并引起胃粘膜炎症反应，而在喂养了益生菌的小鼠体内，幽门螺杆菌的定植受到了明显的抑制。在另一项动物试验中，应用益生菌的培养上清液，也取得了类似的效果。另外，在人体试验中发现，如果在体外被证明对幽门螺杆菌有抑制作用的乳酸菌培养上清液在体内也能部分长期抑制人类幽门螺杆菌感染。
发明内容
本发明的目的在于提出一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片及其制备方法，通过添加益生菌制剂通过竞争作用减少幽门螺杆菌定植，产生细菌素(如乙酸、丙酸、丁酸)具有直接抗菌作用；代谢产生大量有机酸(如乳酸)，破坏幽门螺杆菌周围碱性环境，不利于幽门螺杆菌生长繁殖，通过添加益生元，促进益生菌生长繁殖，并添加其他抗氧化物和抗幽门螺旋杆菌物，有效抑制幽门螺旋杆菌的繁殖，起到很好的预防和减少幽门螺旋杆菌感染的效果，经过快速膜乳化制备水包油乳液，进一步通过氯化钙和海藻酸钠反应形成壳层，从而制得胃溶缓释片，制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染微胶囊胃溶缓释片进入人体后，可以在胃酸特定环境下缓慢释放活性组合物，从而起到长效调节，延长反应效果的作用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备方法，将罗伊乳杆菌、布拉酵母菌、乳酸杆菌加入含有中药提取物、可溶性碳源、氨基酸的发酵培养基中发酵，制得发酵益生菌组合物，并与乳香胶、泽兰黄酮、抗氧化维生素、铋剂、益生元、短链脂肪酸混合均匀，得到活性组合物，用海藻酸钙包埋，制得预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将罗伊乳杆菌、布拉酵母菌、乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将头花蓼、甘草、黄连分别洗净，混合，粉碎，加入水中，加热至沸腾提取，过滤，重复1-2次，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将步骤S2中的中药提取物、可溶性碳源、氨基酸加入水中，混匀后调节pH值，灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将步骤S1制得的益生菌制剂加入步骤S3制得的发酵培养基中，发酵，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将维生素C、维生素E和维生素A混合均匀后粉碎，过筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将异麦芽低聚糖、木寡糖和果寡糖混合均匀后粉碎，过筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将α-硫辛酸、丁酸盐和异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将乳香胶、泽兰黄酮、步骤S4制得的发酵益生菌组合物、步骤S5制得的抗氧化维生素、步骤S6制得的铋剂、步骤S7制得的益生元、步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过筛，压片，得到活性组合物片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入乙醇溶液中浸泡溶解后，加入羧甲基纤维素、聚乙二醇-600、吐温-80和滑石粉，搅拌均匀，过筛，得到包衣液；将步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热均匀，然后将所述包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述罗伊乳杆菌、布拉酵母菌、乳酸杆菌的质量比为(3-7)：(1-3)：(2-5)；步骤S2中所述头花蓼、甘草、黄连的质量比为(5-10)：(2-5)：(3-7)；所述沸腾提取时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述中药提取物、可溶性碳源、氨基酸、水的质量比为(7-12)：(5-10)：(2-4)：100；用PBS缓冲溶液调节pH值至6.7-7.0；所述可溶性碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、棉子糖和水溶性淀粉中的至少一种；所述氨基酸选自苯丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述益生菌制剂和所述发酵培养基的质量比为(4-7)：(20-30)；所述发酵条件为36-39℃，转速为300-500r/min，发酵48-72h。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述维生素C、维生素E和维生素A的质量比为(5-10)：(2-4)：(1-3)；步骤S6中所述胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾的质量比为(3-7)：(2-5)；步骤S7中所述异麦芽低聚糖、木寡糖和果寡糖的质量比为(3-5)：(2-4)：(5-7)；步骤S8中所述α-硫辛酸、丁酸盐和异丁酸乙酯的质量比为(1-3)：(5-7)：(3-5)；所述丁酸盐选自丁酸钠、丁酸钾、丁酸钙。
作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述乳香胶、泽兰黄酮、发酵益生菌组合物、抗氧化维生素、铋剂、益生元、短链脂肪酸的质量比为(0.3-0.6)：(0.2-0.5)：(10-15)：(3-5)：(2-5)：(5-7)：(1-3)。
作为本发明的进一步改进，步骤S10中所述乙醇溶液为95％乙醇，所述浸泡时间为20-30h；所述Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素、聚乙二醇-600、吐温-80和滑石粉的质量比为5：(5-7)：(0.5-1.5)：(0.01-0.1)：(0.1-0.2)；所述筛网目数为100-200目；所述活性组合物片和所述包衣液的质量比为1：(0.6-1.2)；所述预热温度为40-50℃，所述吹冷风时间为40-60min。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将3-7重量份罗伊乳杆菌、1-3重量份布拉酵母菌、2-5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将5-10重量份头花蓼、2-5重量份甘草、3-7重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入水中，加热至沸腾提取2-4h，过滤，重复1-2次，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将7-12重量份步骤S2中的中药提取物、5-10重量份可溶性碳源、2-4重量份氨基酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.7-7.0，灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将4-7重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入20-30重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在36-39℃温度下，转速为300-500r/min，发酵48-72h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将5-10重量份维生素C、2-4重量份维生素E和1-3重量份维生素A混合均匀后粉碎，过筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将3-7重量份胶体次枸橼酸铋和2-5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将3-5重量份异麦芽低聚糖、2-4重量份木寡糖和5-7重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将1-3重量份α-硫辛酸、5-7重量份丁酸盐和3-5重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将0.3-0.6重量份乳香胶、0.2-0.5重量份泽兰黄酮、10-15重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、3-5重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、2-5重量份步骤S6制得的铋剂、5-7重量份步骤S7制得的益生元、1-3重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过筛，压片，得到活性组合物片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡20-30h后，加入5-7重量份羧甲基纤维素、0.5-1.5重量份聚乙二醇-600、0.01-0.1重量份吐温-80和0.1-0.2重量份滑石粉，搅拌均匀，过100-200目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至40-50℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.5-1重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风40-60min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
本发明具有如下有益效果：罗伊乳杆菌是通过与幽门螺杆菌竞争糖脂类受体，从而达到阻止幽门螺杆菌在胃黏膜上的定植，减少幽门螺杆菌对胃黏膜产生炎症反应而损伤胃黏膜；降低幽门螺杆菌毒力基因vacA和flaA的mRNA相对表达水平，从而实现其对幽门螺杆菌活性的抑制作用，还可以通过特异性的物理性聚合作用与幽门螺杆菌生成共聚物起到根除幽门螺杆菌的作用；乳酸杆菌对胃上皮细胞有高度亲和力，通过阻碍或抑制幽门螺杆菌对胃上皮细胞的黏附作用达到保护胃黏膜作用，分泌的大量乳酸可作为幽门螺杆菌的抑制剂，乳酸不仅可以通过降低幽门螺杆菌值发挥抗菌作用，还能够抑制病原体的脲酶活性实现抗菌作用，乳酸是通过抑制幽门螺杆菌分泌的脲酶的活力从而发挥抗菌作用，分的代谢产物有机酸还可通过三羧酸循环使幽门螺杆菌失去生长繁殖所必需的能量，从而抑制幽门螺杆菌的活性与增殖。益生菌制剂可以降低无症状幽门螺杆菌感染患者血清总抗氧化态，从而减轻幽门螺杆菌感染引起的机体的全身氧化应激反应；布拉酵母菌利用其唾液酸苷酶活性选择性的清除α(2-3)糖苷键连接的唾液酸结构，不利于幽门螺杆菌黏附在十二指肠黏膜上，减轻其对十二指肠黏膜的损伤。另外，益生菌也能够参与由巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞介导的复杂网络免疫反应中，以此实现抗幽门螺杆菌感染的作用。
幽门螺杆菌存在多种形态，包括球形幽门螺杆菌、螺旋形幽门螺杆菌，以上两种形态致病菌可相互转化，且对环境体现出不同的耐受力。抑酸剂、抗菌药物在幽门螺杆菌环境中均不利于生长，临床上常见的致病菌可转化成为球形致病菌，这种形态的致病菌可潜伏于胃中，本发明通过添加益生菌复合制剂可有效预防和抑制球形幽门螺杆菌在胃黏膜上的生长、定植，从而将幽门螺旋杆菌其彻底杀灭，以防止其复发。
由此可知，本发明添加的益生菌制剂能够直接黏附在胃上皮，产生黏膜，起到屏障作用，通过竞争作用减少幽门螺杆菌定植；与幽门螺杆菌竞争营养物质，不利于其生长繁殖；直接抑制幽门螺杆菌黏附胃上皮；直接抑制幽门螺杆菌产生的尿素酶活性；产生细菌素(如乙酸、丙酸、丁酸)具有直接抗菌作用；代谢产生大量有机酸(如乳酸)，破坏幽门螺杆菌周围碱性环境，不利于幽门螺杆菌生长繁殖；调节人体免疫功能，提高免疫球蛋白A的分泌、增强巨噬细胞吞噬活性；增强上皮细胞之间紧密连接，从而增强胃上皮的防御功能。
铋剂，包括胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾，两者复合协同处理降低了幽门螺杆菌的细菌-宿主细胞粘附，氧化应激防御能力和pH缓冲能力。铋剂的作用机制是在胃酸环境中较快地形成稳定的凝胶体覆盖在胃黏膜表面，将胃酸与胃蛋白酶隔离，从而使损伤的黏膜受到保护。
抗氧化维生素，包括维生素C、维生素E和维生素A，维生素A能够很好的清除自由基，有很好的抗氧化的作用，维生素C也具有很好的抗氧化、抗衰老的作用，维生素E也具有很好的清除自由基、抗氧化的作用，复合协同可以减少氧化反应，消除活性氧并减少胃液中的N-亚硝胺并发挥抗氧化作用，这可能是胃癌发生中的保护作用。
益生菌的代谢产物短链脂肪酸能够抑制因抗生素滥用所产生的超级细菌的生长繁殖。添加的短链脂肪酸α-硫辛酸提高抗氧化能力，促进细胞清除自由基，增加谷胱甘肽的合成，起到很好的抗氧化调节的效果。
本发明通过添加益生元，包括异麦芽低聚糖、木寡糖和果寡糖，能提高碳酸化合物含量，能选择性促进益生菌的增殖，抑制幽门螺旋杆菌的生长，还能提高短链脂肪酸、乳酸等的分泌，破坏幽门螺旋杆菌周围的中碱性环境，从而破坏幽门螺旋杆菌生长环境，具有协同增效的作用；
乳香胶提取物中包含多种单体成分，包括芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯等，具有很好的体内外抗幽门螺旋杆菌的活性，反式茴香烯可以使得幽门螺旋杆菌菌株细胞形态不规则，细胞肿胀坏死，细胞壁破损，胞膜破裂或缺失，胞质外溢，进而导致菌株死亡，其杀菌机理可能是通过改变幽门螺旋杆菌细胞膜通透性，破坏细胞结构发挥杀菌作用。泽兰黄酮对幽门螺旋杆菌敏感或耐药菌株均有很好的抑制效果。
头花蓼提取物能降低幽门螺旋杆菌对胃上皮细胞的黏附力发挥抗菌作用，其含有的槲皮素能通过降低p38MAPK和Bax的表达，升高Bcl-2的表达，减少胃上皮细胞凋亡，保护胃黏膜，从而降低由幽门螺旋杆菌感染引起的炎症和胃细胞损伤。甘草提取物可显著抑制幽门螺旋杆菌诱导的COX-2、VEGF及IL-8的表达，缓解胃黏膜炎症。黄连中富含的黄连素对耐药的幽门螺旋杆菌菌株的抑制效果更佳，可显著降低幽门螺旋杆菌诱导的胃黏膜中NOX2、NOX4、INOS、ERK1/2蛋白含量，增加SOD的活性，增强抗氧化效果。
本发明通过添加益生菌制剂通过竞争作用减少幽门螺杆菌定植，产生细菌素(如乙酸、丙酸、丁酸)具有直接抗菌作用；代谢产生大量有机酸(如乳酸)，破坏幽门螺杆菌周围碱性环境，不利于幽门螺杆菌生长繁殖，通过添加益生元，促进益生菌生长繁殖，并添加其他抗氧化物和抗幽门螺旋杆菌物，有效抑制幽门螺旋杆菌的繁殖，起到很好的预防和减少幽门螺旋杆菌感染的效果，经过羧甲基纤维素和胃溶聚丙烯酸树脂对活性组合物片进行包衣，从而制得胃溶缓释片，制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶片进入人体后，可以在胃酸特定环境下缓慢释放活性组合物，从而起到长效调节，延长反应效果的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例2中各组存活率对比图；
图2为本发明测试例2中各组累计释放率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂，纯度大于99％，购于武汉远成赛创科技有限公司。
罗伊乳杆菌，CICC6132＝NBRC15892＝ATCC23272＝CCUG33624＝CIP101887＝DSM20016＝IFO15892＝JCM 1112＝LMG9213＝LMG13557＝NRRL B-14171，购于上海继和生物科技有限公司，采用说明书方法恢复培养；布拉酵母菌，SHBCC D24699，CNCM I-745，购于上海瑞楚生物科技有限公司，采用说明书方法恢复培养；乳酸杆菌，2×1011cfu/g，购于微康益生菌(苏州)股份有限公司。
乳香胶，纯度>98％，购于上海士锋生物科技有限公司，泽兰黄酮，纯度HPLC≥98％，购于成都仪睿生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将3重量份罗伊乳杆菌、1重量份布拉酵母菌、2重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将5重量份头花蓼、2重量份甘草、3重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取2h，过滤，重复1次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将7重量份步骤S2中的中药提取物、3重量份海藻糖、2重量份棉子糖、1重量份亮氨酸、1重量份丙氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将4重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入20重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在36℃温度下，转速为300r/min，发酵48h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将5重量份维生素C、2重量份维生素E和1重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将3重量份胶体次枸橼酸铋和2重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将3重量份异麦芽低聚糖、2重量份木寡糖和5重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将1重量份α-硫辛酸、5重量份丁酸钾和3重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将0.3重量份乳香胶、0.2重量份泽兰黄酮、10重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、3重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、2重量份步骤S6制得的铋剂、5重量份步骤S7制得的益生元、1重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡20h后，加入5重量份羧甲基纤维素、0.5重量份聚乙二醇-600、0.01重量份吐温-80和0.1重量份滑石粉，300r/min搅拌10min，过100目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至40℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.5重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风40min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
实施例2
本实施例提供一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将7重量份罗伊乳杆菌、3重量份布拉酵母菌、5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将10重量份头花蓼、5重量份甘草、7重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取4h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将12重量份步骤S2中的中药提取物、2重量份乳糖、2重量份果糖、2重量份海藻糖、2重量份棉子糖、2重量份蔗糖、1重量份甘氨酸、1重量份缬氨酸、1重量份色氨酸、1重量份甲硫氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至7.0，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将7重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入30重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在39℃温度下，转速为500r/min，发酵72h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将10重量份维生素C、4重量份维生素E和3重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将7重量份胶体次枸橼酸铋和5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将5重量份异麦芽低聚糖、4重量份木寡糖和7重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将3重量份α-硫辛酸、7重量份丁酸钙和5重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将0.6重量份乳香胶、0.5重量份泽兰黄酮、15重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、5重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、5重量份步骤S6制得的铋剂、7重量份步骤S7制得的益生元、3重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡30h后，加入7重量份羧甲基纤维素、1.5重量份聚乙二醇-600、0.1重量份吐温-80和0.2重量份滑石粉，500r/min搅拌15min，过200目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至50℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将1重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风60min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
实施例3
本实施例提供一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌、3.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将7重量份头花蓼、3.5重量份甘草、5重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将10重量份步骤S2中的中药提取物、3重量份葡萄糖、4重量份蔗糖、1重量份苯丙氨酸、1重量份甲硫氨酸、1重量份丝氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入25重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在37℃温度下，转速为400r/min，发酵56h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将7重量份维生素C、3重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将5重量份胶体次枸橼酸铋和3.5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将2重量份α-硫辛酸、6重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S6制得的铋剂、6重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
实施例4
与实施例3相比，S2中药提取物的制备中未添加头花蓼，其他条件均不改变。
S2.中药提取物的制备：将3.5重量份甘草、12重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物。
实施例5
与实施例3相比，S2中药提取物的制备中未添加黄连，其他条件均不改变。
S2.中药提取物的制备：将12重量份头花蓼、3.5重量份甘草分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物。
实施例6
与实施例3相比，S5抗氧化维生素的制备中未添加维生素C，其他条件均不改变。
S5.抗氧化维生素的制备：将10重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素。
实施例7
与实施例3相比，S5抗氧化维生素的制备中未添加维生素E，其他条件均不改变。
S5.抗氧化维生素的制备：将10重量份维生素C和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素。
实施例8
与实施例3相比，S6铋剂的制备中未添加胶体次枸橼酸铋，其他条件均不改变。
S6.铋剂的制备：将碱式果胶酸铋钾粉碎，过100目筛，制得铋剂。
实施例9
与实施例3相比，S6铋剂的制备中未添加碱式果胶酸铋钾，其他条件均不改变。
S6.铋剂的制备：将胶体次枸橼酸铋粉碎，过100目筛，制得铋剂。
实施例10
与实施例3相比，S8短链脂肪酸的制备中未添加α-硫辛酸，其他条件均不改变。
S8.短链脂肪酸的制备：将8重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸。
实施例11
与实施例3相比，S8短链脂肪酸的制备中未添加丁酸盐，其他条件均不改变。
S8.短链脂肪酸的制备：将8重量份α-硫辛酸和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸。
对比例1
与实施例3相比，S1益生菌制剂的制备中未添加罗伊乳杆菌，其他条件均不改变。
S1.益生菌制剂的制备：将2重量份布拉酵母菌、8.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂。
对比例2
与实施例3相比，S1益生菌制剂的制备中未添加乳酸杆菌，其他条件均不改变。
S1.益生菌制剂的制备：将8.5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌混合均匀，制得益生菌制剂。
对比例3
与实施例3相比，S3发酵培养基的制备中未添加中药提取物，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌、3.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.发酵培养基的制备：将13重量份葡萄糖、4重量份蔗糖、1重量份苯丙氨酸、1重量份甲硫氨酸、1重量份丝氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S3.发酵益生菌组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入25重量份步骤S2制得的发酵培养基中，在37℃温度下，转速为400r/min，发酵56h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S4.抗氧化维生素的制备：将7重量份维生素C、3重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S5.铋剂的制备：将5重量份胶体次枸橼酸铋和3.5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S6.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S7.短链脂肪酸的制备：将2重量份α-硫辛酸、6重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S8.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S3制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S4制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S5制得的铋剂、6重量份步骤S6制得的益生元、2重量份步骤S7制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S9.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S8制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
对比例4
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加发酵益生菌组合物，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.抗氧化维生素的制备：将7重量份维生素C、3重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S2.铋剂的制备：将5重量份胶体次枸橼酸铋和3.5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S3.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S4.短链脂肪酸的制备：将2重量份α-硫辛酸、6重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S5.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、4重量份步骤S1制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S2制得的铋剂、6重量份步骤S3制得的益生元、2重量份步骤S4制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S6.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S5制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
对比例5
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加抗氧化维生素，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌、3.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将7重量份头花蓼、3.5重量份甘草、5重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将10重量份步骤S2中的中药提取物、3重量份葡萄糖、4重量份蔗糖、1重量份苯丙氨酸、1重量份甲硫氨酸、1重量份丝氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入25重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在37℃温度下，转速为400r/min，发酵56h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.铋剂的制备：将5重量份胶体次枸橼酸铋和3.5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S6.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S7.短链脂肪酸的制备：将2重量份α-硫辛酸、6重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S8.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、3.5重量份步骤S6制得的铋剂、6重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S9.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S8制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
对比例6
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加铋剂，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌、3.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将7重量份头花蓼、3.5重量份甘草、5重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将10重量份步骤S2中的中药提取物、3重量份葡萄糖、4重量份蔗糖、1重量份苯丙氨酸、1重量份甲硫氨酸、1重量份丝氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入25重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在37℃温度下，转速为400r/min，发酵56h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将7重量份维生素C、3重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S6.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S7.短链脂肪酸的制备：将2重量份α-硫辛酸、6重量份丁酸钠和4重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过100目筛，制得短链脂肪酸；
S8.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、6重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S9.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S8制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
对比例7
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加短链脂肪酸，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌、3.5重量份乳酸杆菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将7重量份头花蓼、3.5重量份甘草、5重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入100重量份水中，加热至沸腾提取3h，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩，75℃干燥2h，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将10重量份步骤S2中的中药提取物、3重量份葡萄糖、4重量份蔗糖、1重量份苯丙氨酸、1重量份甲硫氨酸、1重量份丝氨酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入25重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在37℃温度下，转速为400r/min，发酵56h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将7重量份维生素C、3重量份维生素E和2重量份维生素A混合均匀后粉碎，过100目筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将5重量份胶体次枸橼酸铋和3.5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过100目筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将4重量份异麦芽低聚糖、3重量份木寡糖和6重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过100目筛，制得益生元；
S8.活性组合物的制备：将0.45重量份乳香胶、0.35重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S6制得的铋剂、6重量份步骤S7制得的益生元混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片，0.3g/片；
S9.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡25h后，加入6重量份羧甲基纤维素、1重量份聚乙二醇-600、0.05重量份吐温-80和0.15重量份滑石粉，400r/min搅拌12min，过150目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S8制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至45℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.7重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风50min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
对比例8
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加乳香胶，其他条件均不改变。
S9.活性组合物的制备：将0.8重量份泽兰黄酮、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S6制得的铋剂、6重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片。
对比例9
与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加泽兰黄酮，其他条件均不改变。
S9.活性组合物的制备：将0.8重量份乳香胶、12重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、4重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、3.5重量份步骤S6制得的铋剂、6重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过200目筛，压片，得到活性组合物片。
对比例10
与实施例3相比，未进行步骤S10，其他条件均不改变。
测试例1抑制尿素酶的活性研究
1、幽门螺旋杆菌尿素酶的制备：将含菌量约2×108cfu/mL的20mL幽门螺旋杆菌菌液于5000r/min，4℃离心20min，收集幽门螺旋杆菌，用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤3次，于-80℃冷冻保存24h后，取出，恢复至室温，加入3mL去离子水和蛋白酶抑制剂，1000W超声1min，12000r/min，4℃离心15min，取上层清液，经过Sephadex G-25层析柱除盐，加入等体积丙三醇，4℃保存备用。
2、抑制尿素酶活性的研究：将实施例1-11和对比例1-10制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片溶于DMSO-PBS缓冲液中(DMSO：PBS缓冲液＝1:5，PBS缓冲液的pH＝2.5)得到受试溶液(浓度根据实验设定)；在96孔板中加入25μL尿素酶溶液(10U/mL)，25μL测试溶液，在37℃下培养30min，加入50μL含尿素25mmol的PBS缓冲溶液(pH＝2.5)，在37℃下培养10min，然后加入50μL甲试剂(含有127mmol/L苯酚和0.168mmol/L硝普钠)和50μL乙试剂(125mmol/LNaOH和11.3mmol/LNaOCl)，在37℃下培养20min，测定620nm吸光度，并根据以下公式计算抑制率：
抑制率(％)＝[1-(OD测试-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100
根据抑制率计算尿素酶的IC50。
空白组中，25μL受试溶液替换为25μL DMSO-PBS缓冲液(DMSO：PBS缓冲液＝1:5，PBS缓冲液的pH＝2.5)，50μL含尿素25mmol的PBS缓冲溶液(pH＝2.5)替换为50μLPBS缓冲溶液(pH＝2.5)，其他条件与测试组相同。
对照组中，25μL受试溶液替换为25μL DMSO-PBS缓冲液(DMSO：PBS缓冲液＝1:5，PBS缓冲液的pH＝2.5)，其他条件与测试组相同。
具体各组的试剂添加情况如下表1。
表1
结果见表2。
表2
组别 IC50(μg/mL)
实施例1 1.57
实施例2 1.50
实施例3 1.45
实施例4 35.34
实施例5 36.24
实施例6 10.42
实施例7 9.88
实施例8 2.12
实施例9 2.43
实施例10 18.45
实施例11 19.27
对比例1 47.84
对比例2 48.22
对比例3 52.52
对比例4 85.35
对比例5 24.56
对比例6 4.24
对比例7 35.35
对比例8 57.82
对比例9 46.19
对比例10 2.02
由上表可知，本发明实施例1-3制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片具有良好的抑制尿素酶的活性。
测试例2缓释效果测试
将实施例1-9和对比例1-10制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片在人工模拟胃液(pH＝2.4)中的存活和释放试验。将10片产品均匀分散于20mL在37℃下预热的人工模拟胃液，温育7h，于每隔1小时取样，进行益生菌群细胞计数和称重。
计算存活率：存活率(％)＝Nt/N0×100％
式中，Nt为在体外人工模拟胃液中孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N0为人工模拟胃液中添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。
计算释放率：累计释放率(％)＝(Wt-W0)/W0×100％
式中，Wt为起始重量；W0为在体外模拟人工模拟胃液中孵育一定时间后重量。
结果见图1和图2。由图可知，本发明制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片在人工模拟胃液中菌群具有较高的存活率，且缓释效果佳，稳定性好。
测试例3对幽门螺旋杆菌阳性萎缩性胃炎模型大鼠的保护作用
1、模型建立：随机取SD大鼠220只，用2wt％头孢克肟+2wt％阿莫西林混合清除胃内杂菌，5mL/kg，每日1次，除菌3天，第4天灌胃2wt％吲哚美辛水溶液，破坏胃黏膜屏障，3mL/kg，每日1次，共2天，第6天灌胃2mL饱和碳酸氢钠，15min后灌胃1mL幽门螺旋杆菌菌液(含菌量为1×1012cfu/mL)，每2天1次，共12天，28天后，灌胃2mL 2wt％水杨酸的乙醇水溶液，乙醇含量为60wt％，每天1次，连续9周，光镜下观察胃黏膜固有腺体明显减少，则造模成功。
2、分组和给药方法：选择230只造模处理的大鼠，随机分为实施例1-11组和对比例1-10组，模型组，阳性对照组，每组10只，另取10只正常大鼠作为空白组。实施例1-11组和对比例1-10组每天每只分别灌胃给予实施例1-11和对比例1-10制备的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片，1.2g/kg；阳性对照组每天每只灌胃给予四联药物(奥美拉唑0.0036g/kg、阿莫西林0.18g/kg、克拉霉素0.072g/kg和胶体果胶铋0.036g/kg)；空白组和模型组每天给予5mL生理盐水，连续给药30天。
3、胃酸分泌量和胃蛋白酶活性测定：末次给药后，禁食24小时后，麻醉大鼠，仰位固定，剖腹后于幽门下0.5cm处结扎，5小时候，解开结扎处，收集胃液，计算其体积，并离心，取上清液，测定胃蛋白酶活性。结果见表3。
4、血清TNF-α、IL-8含量测定：取大鼠胃黏膜组织匀浆后，根据ELISA法检测TNF-α、IL-8含量。结果见表4。
5、血清SOD、MDA含量测定：取大鼠胃黏膜组织匀浆后，根据硫代巴比妥酸法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量。结果见表5。
表3对大鼠胃蛋白酶活性及胃液分泌量的影响
注释：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片能明显提高幽门螺旋杆菌阳性大鼠胃酸分泌量，提高胃蛋白酶活性。
表4对大鼠胃黏膜中TNF-α、IL-8含量的影响
注释：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片能明显降低幽门螺旋杆菌阳性大鼠TNF-α、IL-8含量，降低胃黏膜组织中炎症因子水平，减缓胃黏膜炎症。
表5对大鼠胃黏膜中MDA、SOD含量的影响
注释：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片能明显提高幽门螺旋杆菌阳性大鼠SOD含量，降低MDA含量，减轻胃黏膜组织氧化损伤，减少脂质过氧化。
对比例1、2与实施例3相比，S1益生菌制剂的制备中未添加罗伊乳杆菌或乳酸杆菌，其益生菌存活率明显下降，尿素酶的IC50明显提高，胃酸分泌量明显下降，胃蛋白酶活性明显下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低，对比例4与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加发酵益生菌组合物，其益生菌存活率为0，尿素酶的IC50明显提高，胃酸分泌量明显下降，胃蛋白酶活性明显下降，炎症因子水平明显下降，SOD含量明显提高，MDA含量明显降低，罗伊乳杆菌是通过与幽门螺杆菌竞争糖脂类受体，从而达到阻止幽门螺杆菌在胃黏膜上的定植，减少幽门螺杆菌对胃黏膜产生炎症反应而损伤胃黏膜；降低幽门螺杆菌毒力基因vacA和flaA的mRNA相对表达水平，从而实现其对幽门螺杆菌活性的抑制作用，还可以通过特异性的物理性聚合作用与幽门螺杆菌生成共聚物起到根除幽门螺杆菌的作用；乳酸杆菌对胃上皮细胞有高度亲和力，通过阻碍或抑制幽门螺杆菌对胃上皮细胞的黏附作用达到保护胃黏膜作用，分泌的大量乳酸可作为幽门螺杆菌的抑制剂，乳酸不仅可以通过降低幽门螺杆菌值发挥抗菌作用，还能够抑制病原体的脲酶活性实现抗菌作用，乳酸是通过抑制幽门螺杆菌分泌的脲酶的活力从而发挥抗菌作用，分的代谢产物有机酸还可通过三羧酸循环使幽门螺杆菌失去生长繁殖所必需的能量，从而抑制幽门螺杆菌的活性与增殖。益生菌制剂可以降低无症状幽门螺杆菌感染患者血清总抗氧化态，从而减轻幽门螺杆菌感染引起的机体的全身氧化应激反应，另外，益生菌也能够参与由巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞介导的复杂网络免疫反应中，以此实现抗幽门螺杆菌感染的作用。本发明添加的益生菌制剂能够直接黏附在胃上皮，产生黏膜，起到屏障作用，通过竞争作用减少幽门螺杆菌定植；与幽门螺杆菌竞争营养物质，不利于其生长繁殖；直接抑制幽门螺杆菌黏附胃上皮；直接抑制幽门螺杆菌产生的尿素酶活性；产生细菌素(如乙酸、丙酸、丁酸)具有直接抗菌作用；代谢产生大量有机酸(如乳酸)，破坏幽门螺杆菌周围碱性环境，不利于幽门螺杆菌生长繁殖；调节人体免疫功能，提高免疫球蛋白A的分泌、增强巨噬细胞吞噬活性；增强上皮细胞之间紧密连接，从而增强胃上皮的防御功能，两者具有协同增效的作用。
实施例4、5与实施例3相比，S2中药提取物的制备中未添加头花蓼或黄连，尿素酶的IC50明显提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低，对比例3与实施例3相比，S3发酵培养基的制备中未添加中药提取物，尿素酶的IC50明显提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低，头花蓼提取物能降低幽门螺旋杆菌对胃上皮细胞的黏附力发挥抗菌作用，其含有的槲皮素能通过降低p38MAPK和Bax的表达，升高Bcl-2的表达，减少胃上皮细胞凋亡，保护胃黏膜，从而降低由幽门螺旋杆菌感染引起的炎症和胃细胞损伤。黄连中富含的黄连素对耐药的幽门螺旋杆菌菌株的抑制效果更佳，可显著降低幽门螺旋杆菌诱导的胃黏膜中NOX2、NOX4、INOS、ERK1/2蛋白含量，增加SOD的活性，增强抗氧化效果，两者具有协同增效的作用。
实施例6、7与实施例3相比，S5抗氧化维生素的制备中未添加维生素C或维生素E，尿素酶的IC50提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低，对比例5与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加抗氧化维生素，尿素酶的IC50提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低。抗氧化维生素中维生素C也具有很好的抗氧化、抗衰老的作用，维生素E也具有很好的清除自由基、抗氧化的作用，复合协同可以减少氧化反应，消除活性氧并减少胃液中的N-亚硝胺并发挥抗氧化作用，这可能是胃癌发生中的保护作用，两者具有协同增效的作用。
实施例8、9与实施例3相比，S6铋剂的制备中未添加胶体次枸橼酸铋或碱式果胶酸铋钾，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低，对比例6与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加铋剂，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子水平下降，SOD含量提高，MDA含量降低。铋剂包括胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾，两者复合协同处理降低了幽门螺杆菌的细菌-宿主细胞粘附，氧化应激防御能力和pH缓冲能力。铋剂的作用机制是在胃酸环境中较快地形成稳定的凝胶体覆盖在胃黏膜表面，将胃酸与胃蛋白酶隔离，从而使损伤的黏膜受到保护，两者具有协同增效的作用。
实施例10、11与实施例3相比，S8短链脂肪酸的制备中未添加α-硫辛酸或丁酸盐，尿素酶的IC50提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，SOD含量明显提高，MDA含量明显降低，对比例7与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加短链脂肪酸，尿素酶的IC50提高，胃酸分泌量下降，胃蛋白酶活性下降，炎症因子明显下降，SOD含量明显提高，MDA含量明显降低。丁酸盐能够抑制因抗生素滥用所产生的超级细菌的生长繁殖。添加的短链脂肪酸α-硫辛酸提高抗氧化能力，促进细胞清除自由基，增加谷胱甘肽的合成，起到很好的抗氧化调节的效果，两者具有协同增效的作用。
对比例8、9与实施例3相比，S9活性组合物的制备中未添加乳香胶或泽兰黄酮，尿素酶的IC50明显提高，胃酸分泌量明显下降，胃蛋白酶活性明显下降，炎症因子明显下降，SOD含量明显提高，MDA含量明显降低。乳香胶提取物中包含多种单体成分，包括芳樟醇、γ-萜品烯和反式茴香烯等，具有很好的体内外抗幽门螺旋杆菌的活性，反式茴香烯可以使得幽门螺旋杆菌菌株细胞形态不规则，细胞肿胀坏死，细胞壁破损，胞膜破裂或缺失，胞质外溢，进而导致菌株死亡，其杀菌机理可能是通过改变幽门螺旋杆菌细胞膜通透性，破坏细胞结构发挥杀菌作用。泽兰黄酮对幽门螺旋杆菌敏感或耐药菌株均有很好的抑制效果，两者具有协同增效的作用。
对比例10与实施例3相比，未进行步骤S10，未进行包衣，其益生菌存活率明显下降，累计释放率1小时内达到90％以上。经过羧甲基纤维素和胃溶聚丙烯酸树脂对活性组合物片进行包衣，从而制得胃溶缓释片，制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶片进入人体后，可以在胃酸特定环境下缓慢释放活性组合物，从而起到长效调节，延长反应效果的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将罗伊乳杆菌、布拉酵母菌混合均匀，制得益生菌制剂；
所述罗伊乳杆菌、布拉酵母菌的质量比为8.5:2；
S2.中药提取物的制备：将头花蓼、甘草、黄连分别洗净，混合，粉碎，加入水中，加热至沸腾提取，过滤，重复1-2次，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药提取物；
所述头花蓼、甘草、黄连的质量比为(5-10)：(2-5)：(3-7)；
S3.发酵培养基的制备：将步骤S2中的中药提取物、可溶性碳源、氨基酸加入水中，混匀后调节pH值，灭菌，得到发酵培养基；
所述中药提取物、可溶性碳源、氨基酸、水的质量比为(7-12)：(5-10)：(2-4)：100；用PBS缓冲溶液调节pH值至6.7-7.0；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将步骤S1制得的益生菌制剂加入步骤S3制得的发酵培养基中，发酵，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
所述益生菌制剂和所述发酵培养基的质量比为(4-7)：(20-30)；所述发酵条件为36-39℃，转速为300-500r/min，发酵48-72h；
S5.抗氧化维生素的制备：将维生素C、维生素E和维生素A混合均匀后粉碎，过筛，制得抗氧化维生素；
所述维生素C、维生素E和维生素A的质量比为(5-10)：(2-4)：(1-3)；
S6.铋剂的制备：将胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过筛，制得铋剂；
所述胶体次枸橼酸铋和碱式果胶酸铋钾的质量比为(3-7)：(2-5)；
S7.益生元的制备：将异麦芽低聚糖、木寡糖和果寡糖混合均匀后粉碎，过筛，制得益生元；
所述异麦芽低聚糖、木寡糖和果寡糖的质量比为(3-5)：(2-4)：(5-7)；
S8.短链脂肪酸的制备：将α-硫辛酸、丁酸盐和异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过筛，制得短链脂肪酸；
所述α-硫辛酸、丁酸盐和异丁酸乙酯的质量比为(1-3)：(5-7)：(3-5)；
S9.活性组合物的制备：将乳香胶、泽兰黄酮、步骤S4制得的发酵益生菌组合物、步骤S5制得的抗氧化维生素、步骤S6制得的铋剂、步骤S7制得的益生元、步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过筛，压片，得到活性组合物片；
所述乳香胶、泽兰黄酮、发酵益生菌组合物、抗氧化维生素、铋剂、益生元、短链脂肪酸的质量比为(0.3-0.6)：(0.2-0.5)：(10-15)：(3-5)：(2-5)：(5-7)：(1-3)；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入乙醇溶液中浸泡溶解后，加入羧甲基纤维素、聚乙二醇-600、吐温-80和滑石粉，搅拌均匀，过筛，得到包衣液；将步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热均匀，然后将所述包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片；
所述Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂、羧甲基纤维素、聚乙二醇-600、吐温-80和滑石粉的质量比为5：(5-7)：(0.5-1.5)：(0.01-0.1)：(0.1-0.2)；
所述活性组合物片和所述包衣液的质量比为10：(0.5-1)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述沸腾提取时间为2-4h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述可溶性碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、棉子糖和水溶性淀粉中的至少一种；所述氨基酸选自苯丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S8中所述丁酸盐选自丁酸钠、丁酸钾、丁酸钙。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S10中所述乙醇溶液为95％乙醇，所述浸泡时间为20-30h；所述筛网目数为100-200目；所述预热温度为40-50℃，所述吹冷风时间为40-60min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.益生菌制剂的制备：将8.5重量份罗伊乳杆菌、2重量份布拉酵母菌混合均匀，制得益生菌制剂；
S2.中药提取物的制备：将5-10重量份头花蓼、2-5重量份甘草、3-7重量份黄连分别洗净，混合，粉碎，加入水中，加热至沸腾提取2-4h，过滤，重复1-2次，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药提取物；
S3.发酵培养基的制备：将7-12重量份步骤S2中的中药提取物、5-10重量份可溶性碳源、2-4重量份氨基酸加入100重量份水中，用PBS缓冲溶液调节pH值至6.7-7.0，灭菌，得到发酵培养基；
S4.发酵益生菌组合物的制备：将4-7重量份步骤S1制得的益生菌制剂加入20-30重量份步骤S3制得的发酵培养基中，在36-39℃温度下，转速为300-500r/min，发酵48-72h，冷冻干燥，得到发酵益生菌组合物；
S5.抗氧化维生素的制备：将5-10重量份维生素C、2-4重量份维生素E和1-3重量份维生素A混合均匀后粉碎，过筛，制得抗氧化维生素；
S6.铋剂的制备：将3-7重量份胶体次枸橼酸铋和2-5重量份碱式果胶酸铋钾混合均匀后粉碎，过筛，制得铋剂；
S7.益生元的制备：将3-5重量份异麦芽低聚糖、2-4重量份木寡糖和5-7重量份果寡糖混合均匀后粉碎，过筛，制得益生元；
S8.短链脂肪酸的制备：将1-3重量份α-硫辛酸、5-7重量份丁酸盐和3-5重量份异丁酸乙酯混合均匀后粉碎，过筛，制得短链脂肪酸；
S9.活性组合物的制备：将0.3-0.6重量份乳香胶、0.2-0.5重量份泽兰黄酮、10-15重量份步骤S4制得的发酵益生菌组合物、3-5重量份步骤S5制得的抗氧化维生素、2-5重量份步骤S6制得的铋剂、5-7重量份步骤S7制得的益生元、1-3重量份步骤S8制得的短链脂肪酸混合均匀，研细，过筛，压片，得到活性组合物片；
S10.预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片的制备：将5重量份Ⅳ号胃溶聚丙烯酸树脂加入100重量份95％乙醇中浸泡20-30h后，加入5-7重量份羧甲基纤维素、0.5-1.5重量份聚乙二醇-600、0.01-0.1重量份吐温-80和0.1-0.2重量份滑石粉，搅拌均匀，过100-200目筛，得到包衣液；将10重量份步骤S9制得的活性组合物片加入包衣锅中，预热至40-50℃，每隔1min启动包衣锅一次，然后将0.5-1重量份包衣液均匀喷雾于转动的活性组合物片上，喷雾完毕后，吹冷风40-60min，干燥，得到预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的预防和治疗幽门螺杆菌感染的胃溶缓释片。
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