CN114907427B - 一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物，槲皮素与葡萄糖糖基的6位羟基通过共价结合而被修饰，使得该衍生物具有稳定性好、水溶性好、血脑屏障穿透率高、脑靶向良好和生物活性优异的特点，能够提高神经细胞抗氧化损伤的应激能力，降低神经细胞被氧化损伤的可能性。

Description

一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
槲皮素，又名栎精、槲皮黄素，其化学结构式为：
槲皮素是自然界十分广泛的一种植物源黄酮类化合物，它在谷物、水果、茶叶、赶黄草、红洋葱、芹菜、甘蓝等中具有较高的含量。槲皮素具有丰富的药理作用和生物活性，如抗氧化和清除氧自由基、抗炎、增强免疫力、抗菌、抗病毒及镇痛等作用。槲皮素有很强的抗氧化作用，这主要与其强效清除细胞内活性氧(ROS)的功能有关，这种抗氧化功能的发挥可能与其分子结构中含有抗氧化药效基团酚羟基相关，也与其羟基可提供电子的能力有关。研究表明槲皮素对于氧化应激增加而导致的细胞损伤甚至线粒体功能障碍相关的疾病有潜在治疗作用。
但由于槲皮素分子结构中含有多个极性羟基基团，亲脂性弱，且槲皮素由于其分子结构中的羟基使分子间形成氢键而造成晶格能较高，其亲水性也不强，基本不溶于水(在水中溶解度约为7μg/mL)。槲皮素进入体内被吸收并代谢，存在强烈的首过效应，生物利用度极低，从而限制了槲皮素在临床治疗的广泛应用。以槲皮素为活性先导物进行化学修饰，提高其水溶性和脂溶性，寻找生物利用度得到改善，活性更高的前体药或新化学实体具有重大意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物，该衍生物具有高稳定性、水溶性好、高血脑屏障穿透率、良好的脑靶向和优异的生物活性等特点。
本发明的第二目的在于提供如上所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，该方法工艺简单、操作方便。
本发明的第三目的在于提供如上所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物在制备抗氧化药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物，具有如下结构通式：
式中，R1为R2为/>
进一步地，槲皮素的葡萄糖苷衍生物，具有如下结构式中的至少一种：
本发明还提供了如上所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖与端炔化的槲皮素进行click反应，得到槲皮素的葡萄糖苷衍生物；
其中，所述6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的结构式为：
所述端炔化的槲皮素的结构式为：式中，R3为R4为/>
进一步地，所述click反应的温度为10～50℃，所述click反应的时间为1～24h。
进一步地，所述6-叠氮-6-脱氧葡萄糖和所述端炔化的槲皮素的摩尔比为1：0.1～0.4。
进一步地，所述端炔化的槲皮素包括
进一步地，所述端炔化的槲皮素的制备方法包括：槲皮素与3-溴丙炔进行取代反应，得到所述端炔化的槲皮素。
进一步地，所述取代反应的温度为40～60℃，所述取代反应的时间为2～8h。
进一步地，所述槲皮素与所述3-溴丙炔的摩尔比为1：0.5～2。
本发明还提供了如上所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物在制备抗氧化药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物，槲皮素与葡萄糖基的6位羟基通过共价结合而被修饰，葡萄糖的6位羟基延伸在六元环分子结构外，因此空间位阻最小，十分有利于葡萄糖基与GLUT1识别及结合；同时，相比于槲皮素，本发明的槲皮素的葡萄糖苷衍生物具有更好的水溶性、更高的稳定性、更低的细胞毒性、更宽的神经保护阈值、更高的血脑屏障穿透率以及更佳的对脑细胞抗氧化保护活性，能够提高神经细胞抗氧化损伤的应激能力，降低神经细胞被氧化损伤的可能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que的稳定性。
图2为本发明的实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que对PC12细胞和bEnd.3细胞的活力影响图。
图3为本发明的实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que、对比例1的que、摩尔比为1：1的槲皮素和葡萄糖的混合物和摩尔比为1：2的槲皮素和葡萄糖的混合物对PC12细胞抵抗H2O2氧化的细胞活力影响图。
图4为本发明的实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que的降低H2O2氧化损伤产生的细胞内ROS能力的。
图5为本发明的实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que的对脑缺血大鼠的脑组织神经保护作用。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物及其制备方法和应用进行具体说明。
在本发明的一些实施方式中提供了一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物，具有如下结构通式：
式中，R1为R2为/>
本发明提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物，槲皮素与葡萄糖基的6位羟基通过共价结合而被修饰，葡萄糖的6位羟基延伸在六元环分子结构外，因此空间位阻最小，十分有利于葡萄糖基与GLUT1识别及结合；同时，相比于槲皮素，本发明的槲皮素的葡萄糖苷衍生物具有更好的水溶性、更高的稳定性、更低的细胞毒性、更宽的神经保护阈值、更高的血脑屏障穿透率以及更佳的对脑细胞抗氧化保护活性，能够提高神经细胞抗氧化损伤的应激能力，降低神经细胞被氧化损伤的可能性。
本发明提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物中，含氮的五元环可以作为连接链偶联葡萄糖和槲皮素分子，同时可作为酰胺键或酯键的电子等排体保护酚羟基以提高槲皮素的稳定性。
在本发明的一些实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物，具有如下结构式中的至少一种：
该槲皮素的葡萄糖苷衍生物被命名为7-(1,2,3,三唑-6-脱氧葡萄糖)槲皮素，缩写为glu-que；
该槲皮素的葡萄糖苷衍生物被命名为7,3’-(1,2,3,三唑-6-脱氧葡萄糖)槲皮素，缩写为glu2-que。
本发明的槲皮素经与葡萄糖糖基的6位羟基共价结合修饰，能够提高槲皮素对血脑屏障的穿透率和对脑细胞抗氧化的保护活性以及对脑缺血大鼠模型的神经保护，修饰后的槲皮素具有比原槲皮素更低的细胞毒性和更宽的神经保护阈值，能够提高神经细胞抗氧化损伤的应激能力，降低神经细胞被氧化损伤的可能性。
在本发明的一些实施方式中还提供了槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖与端炔化的槲皮素进行click反应，得到槲皮素的葡萄糖苷衍生物；
其中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的结构式为：
端炔化的槲皮素的结构式为：式中，R3为R4为/>
在本发明的一些实施方式中，click反应的温度为10～50℃，所述click反应的时间为1～24h；典型但非限制性的，例如，click反应的温度为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或者50℃等等；典型但非限制性的，例如，click反应的时间为1h、2h、4h、5h、10h、15h或者24h等等。
采用上述条件进行click反应，能够取得较佳的反应效果，较高的产物产率和纯度。
在本发明的一些实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖和端炔化的槲皮素的摩尔比为1：0.1～0.4；典型但非限制性的，例如，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖和端炔化的槲皮素的摩尔比为1：0.1、1：0.2、1：0.3或者1：0.4等等。
在本发明的一些实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖和端炔化的槲皮素的摩尔比为1：0.2～0.4或者1：0.1～0.2。
在本发明的一些具体的实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖、端炔化的槲皮素、抗坏血酸钠和铜盐于溶剂中反应得到槲皮素的葡萄糖苷衍生物。
在本发明的一些具体的实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖、抗坏血酸钠和铜盐的摩尔比为1：0.05～0.2：0.01～0.1。
在本发明的一些具体的实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，铜盐包括五水硫酸铜和/或硫酸铜。
在本发明的一些具体的实施方式中，槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法中，溶剂包括叔丁醇和水；优选地，叔丁醇和水的体积比为1：1。
在本发明的一些实施方式中，端炔化的槲皮素包括
在本发明的一些实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法包括：槲皮素与3-溴丙炔进行取代反应，得到端炔化的槲皮素。
在本发明的一些实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，取代反应的温度为40～60℃，取代反应的时间为2～8h；典型但非限制性的，例如，取代反应的温度为40℃、45℃、50℃、55℃或者60℃等等；典型但非限制性的，例如，取代反应的时间为2h、3h、4h、5h、6h、7h或者8h。
在本发明的一些实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，槲皮素与3-溴丙炔的摩尔比为1：0.5～2；典型但非限制性的，例如，槲皮素与3-溴丙炔的摩尔比为1：0.5、1：0.7、1：0.9、1：1.1、1：1.3、1：1.5、1：1.7或者1：2等等。
在本发明的一些具体实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，槲皮素与3-溴丙炔的摩尔比为1：0.5～1或者1：1～2。
在本发明的一些具体的实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，槲皮素与3-溴丙炔在碱性条件下进行取代反应。
在本发明的一些具体的实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，槲皮素、碳酸氢钠、十水四硼酸钠和3-溴丙炔于溶剂中反应得到端炔化的槲皮素。
在本发明的一些具体的实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，槲皮素、碳酸氢钠和十水四硼酸钠的摩尔比为1：1.5～2.5：0.4～0.8。
在本发明的一些具体的实施方式中，端炔化的槲皮素的制备方法中，溶剂包括丙酮和水。
在本发明中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖可以为市售产品，也可由如下6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的制备方法制得。
在本发明的一些实施方式中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖与NaN3进行取代反应，得到6-叠氮-6-脱氧葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中，6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的结构式为：Ts为对甲苯磺酰基。
在本发明的一些实施方式中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的制备方法中，6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖和NaN3的摩尔比为1：4～8。
在本发明的一些实施方式中，6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的制备方法中，反应的温度为40～60℃，反应的时间为12～48h。
在本发明的一些实施方式中，6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
葡萄糖和对甲苯磺酰氯于有机溶剂中反应得到6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖。
在本发明的一些具体的实施方式中，6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的制备方法中，葡萄糖和对甲苯磺酰氯的摩尔比为0.5～1：0.8～1.5。
在本发明的一些具体的实施方式中，6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的制备方法中，反应的温度为20～30℃，反应的时间为10～30h。
在本发明的一些实施方式中还提供了上述槲皮素的葡萄糖苷衍生物在制备抗氧化药物中的应用。
本发明中的抗氧化药物可以包括可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和其他介质，可以按需求不同制备成粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。本发明对此不作限定。
在本发明的一些实施方式中，抗氧化药物包括治疗脑细胞损伤的抗氧化药物或治疗脑缺血的抗氧化药物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物(glu-que)的结构式为：
本实施例的glu-que的制备方法，包括如下步骤：
将6-叠氮-6-脱氧葡萄糖(30mg，0.146mmol)和7-丙炔槲皮素(10.25mg，0.03mmol)加入到5mL叔丁醇和水(体积为1：1)的混合溶液中，然后在搅拌下加入抗坏血酸钠(3.5mg，0.02mmol)和五水硫酸铜(2.0mg，0.008mmol)，在50℃下搅拌反应5h；TLC监测反应完成后，减压浓缩除去溶剂，用硅胶柱层析进行初步纯化，后用制备型高效液相色谱仪对其进行再次纯化，得到7.3mg的glu-que，收率为44.72％。
对制备得到的glu-que的结构进行表征，具体如下：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4):δ7.87(d,J＝19.3Hz,1H),7.44(dd,J＝7.3,2.0Hz,1H),7.38(ddd,J＝7.7,5.5,2.1Hz,1H),6.85-6.81(m,1H),6.35(d,J＝1.9Hz,1H),6.18(d,J＝2.0Hz,1H),5.10(d,J＝7.3Hz,2H),5.03(d,J＝3.6Hz,1H),4.69(ddd,J＝31.4,14.3,2.2Hz,1H),4.40(tt,J＝14.3,7.6Hz,1H),4.04(ddd,J＝9.7,7.4,2.2Hz,1H),3.68-3.50(m,2H),3.12-2.98(m,2H)。
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ177.90,156.47(d,J＝16.4Hz),148.91,145.27,142.41(d,J＝11.1Hz),135.94(d,J＝2.4Hz),125.78(d,J＝8.1Hz),121.19,120.79,115.66,115.43,98.92,96.96,93.82,92.48,76.24,74.70,74.26,72.78,72.18,71.94,71.55,70.04,64.74,51.22。
质谱为:MS(ESI):m/z calculated for C24H23N3O12[M-H]-544.12,found 544.3。
其中，7-丙炔槲皮素的制备方法，包括如下步骤：
槲皮素(10g，33.11mmol)、碳酸氢钠(5.56g，66.18mmol)、十水四硼酸钠(7.08g，18.56mmol)、60mL丙酮和40mL去离子水的混合溶液在70℃下搅拌30min，然后加入19.30g的3-溴丙炔(3.54g，29.76mmol)的丙酮溶液，在50℃下搅拌反应6h。TLC监测反应，反应结束后，反应液减压浓缩去除溶剂，浓缩溶液用10wt％的HCl酸化，乙酸乙酯萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂；采用硅柱层析纯化，得到4.81g的7-丙炔槲皮素，收率为42.5％。
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
将6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖(1.50g，4.50mol)溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液，将NaN3(1.46g，22.5mmol)加入到上述混合溶液中，在50℃反应48h；TLC监测反应，反应完全后，反应液硅藻土过滤除去未反应完全的NaN3，减压浓缩得到粗产品，硅胶柱色谱纯化，得到376.33mg的6-叠氮-6-脱氧葡萄糖，收率为40.76％。
6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：
将葡萄糖(2.00g，11.10mmol)溶解于40mL干燥吡啶中，氮气保护，置于0℃下搅拌后得到葡萄糖的吡啶溶液；再将对甲苯磺酰氯(2.54g，13.32mmol)溶解于10mL干燥吡啶中得到对甲苯磺酰氯的吡啶溶液，于0℃下将对甲苯磺酰氯的吡啶溶液逐滴加入到葡萄糖的吡啶溶液中，滴加完毕后，在25℃下反应18h；TLC监测反应，反应完全后，反应液减压浓缩得到粗产品，硅胶柱色谱纯化，得到1.62g的6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖，收率为43.65％。
实施例2
本实施例提供的槲皮素的葡萄糖苷衍生物(glu2-que)的结构式为：
本实施例的glu2-que的制备方法，包括如下步骤：
将6-叠氮-6-脱氧葡萄糖(30mg，0.146mmol)和7,3’-二丙炔槲皮素(16.41mg，0.0434mmol)加入到5mL叔丁醇和水(体积为1：1)的混合溶液中，然后在搅拌下加入抗坏血酸钠(3.5mg，0.02mmol)和五水硫酸铜(2.0mg，0.008mmol)，在50℃下搅拌反应5h；TLC监测反应完成后，减压浓缩除去溶剂，用硅胶柱层析进行初步纯化，后用制备型高效液相色谱仪对其进行再次纯化，得到9.46mg的glu2-que，收率为27.6％。
对制备得到的glu2-que的结构进行表征，具体如下：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.12(d,J＝16.0Hz,1H),7.88(d,J＝22.1Hz,1H),7.48(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.46-7.39(m,1H),6.84(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),6.66(t,J＝1.9Hz,1H),6.37(t,J＝1.7Hz,1H),5.16-5.10(m,2H),5.05(dd,J＝25.6,3.7Hz,1H),4.56(ddd,J＝13.8,7.7,5.5Hz,1H),4.49-4.36(m,2H),4.28(t,J＝6.5Hz,1H),4.21-4.09(m,1H),4.05(ddd,J＝10.1,7.2,2.6Hz,1H),3.78(d,J＝15.0Hz,1H),3.74-3.63(m,2H),3.61-3.49(m,1H),3.18-2.97(m,3H)。
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ178.25,157.00,149.38,146.84,142.68(t,J＝9.2Hz),136.68,126.21(d,J＝10.3Hz),123.22,121.11,115.69,113.66,97.32,92.84,76.61,75.04,74.65(d,J＝9.8Hz),73.12,72.50(d,J＝8.4Hz),71.90(d,J＝12.1Hz),70.46(d,J＝17.4Hz),62.18,51.82,51.54,49.07。
质谱为：MS(ESI):m/z calculated for C33H36N6O17[M+H]-789.21,found 789.40。
其中，7,3’-二丙炔槲皮素的制备方法，包括如下步骤：
槲皮素(10g，33.11mmol)、碳酸氢钠(5.56g，66.18mmol)、十水四硼酸钠(7.08g，18.56mmol)、60mL丙酮和40mL去离子水的混合溶液在70℃下搅拌30min，然后加入29.3g的3-溴丙炔(7.0g，59.52mmol)的丙酮溶液，在50℃下搅拌反应6h。TLC监测反应，反应结束后，反应液减压浓缩去除溶剂，浓缩溶液用10wt％的HCl酸化，乙酸乙酯萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂；采用硅柱层析纯化，得到4.00g的7,3’-二丙炔槲皮素，收率为32％。
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖与6-O-对甲基苯磺酰-葡萄糖的制备方法与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供的化合物为槲皮素(que)，其结构式为：
试验例1
(1)水溶性：
对实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que的油水分布系数logP值进行测试，其结果如表1所示。
表1
glu-que glu2-que que
logP -0.23±0.065 -1.12±0.059 1.38±0.0067
由于槲皮素在水中的溶解度只有0.166～7.7μg/mL，这导致槲皮素应用功效价值低。本发明经过葡萄糖修饰的槲皮素的logP值明显减小，表明在一定程度增加了其水溶性，有利提升槲皮素的葡萄糖苷衍生物的功效。
(2)稳定性：
分别采用实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que与PBS共孵育来测试稳定性，其结果如图1所示。
从图1可知，槲皮素由于结构中含有多个极性羟基，稳定性较差；而实施例1和实施例2的槲皮素的葡萄糖苷衍生物在各个时间点物质浓度变化均较小，其稳定性得到了较大提升，保证了其应用的有效性。
(3)细胞毒性：
以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)作为神经细胞模型，以bEnd.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞)作为血脑屏障模型，测试实施例1的glu-que、实施例2的glu2-que和对比例1的que对PC12细胞和bEnd.3细胞上的细胞毒性，其结果如图2所示。
从图2可以看出，在2.5μM～10μM浓度范围内的槲皮素的水溶液对PC12细胞和bEnd.3细胞的细胞活力无明显减弱(表明无明显毒性)，而在2.5μM～80μM更宽泛的浓度范围内的实施例1和实施例2的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的水溶液对细胞活力无明显减弱，细胞活力都高于80％。对于PC12细胞，当槲皮素的葡萄糖苷衍生物的水溶液中，衍生物的浓度达到40μM时，实施例1和实施例2的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的细胞毒性与槲皮素即有显著性差异；对于bEnd.3细胞，当槲皮素的葡萄糖苷衍生物的水溶液中，衍生物的浓度达到20μM，实施例1和实施例2的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的细胞毒性与槲皮素即有显著性差异。结果表明本发明实施例1和实施例2的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的细胞毒性都比对比例1的槲皮素低。
(4)抵抗神经细胞氧化损伤能力：
以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)作为神经细胞模型，测试实验组1～5，即对比例1的槲皮素(实验组1)，摩尔比1：1的槲皮素和葡萄糖的混合物(实验组2)、摩尔比1：2的槲皮素和葡萄糖的混合物(实验组3)、实施例1的glu-que(实验组4)和实施例2的glu2-que(实验组5)对PC12细胞的抵抗H2O2氧化损伤能力，其结果如图3所示。
从图3可以看出，培养基中，实验组1～5的浓度升至5μM时，都有开始促使细胞有抗H2O2作用，且随浓度升高，抗氧化应激能力增强；将葡萄糖与槲皮素物理混合对槲皮素抗氧化能力改善没有显著性差异；实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que的抗氧化能力明显强于槲皮素，且glu2-que抗氧化应激能力强于glu-que；在培养基中，glu-que和glu2-que的浓度达到5μM的时候即与槲皮素的抗氧化能力有显著性差异，5～100μM是显著差异有效浓度范围。
(5)神经细胞抵抗氧化损伤的ROS指标：
将PC12细胞以3×105个/孔的密度接种于12孔板中，在37℃下孵育24h。PC12细胞分别给予空白培养基、槲皮素、实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que；每孔给药800μL，给药浓度分别为20μM、60μM和100μM。作用2h后弃去培养基，H2O2作用2h后对空白对照组、H2O2、槲皮素、实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que的神经细胞抵抗氧化损伤的ROS指标进行测试，其结果如图4所示。
从图4可以看出，槲皮素、实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que随浓度升高，抗氧化应激能力增强，降低H2O2氧化损伤产生的细胞内活性氧(ROS)能力变强；同时，glu-que和glu2-que有明显优于槲皮素的降低H2O2氧化损伤产生的细胞内ROS能力，且glu2-que降低H2O2氧化损伤产生的细胞内ROS能力强于glu-que。
(6)脑缺血模型大鼠的神经保护作用：
实验动物随机分为假手术组、生理盐水组和3个给药组(n＝5)，生理盐水组腹腔注射生理盐水，3个给药组腹腔分别注射槲皮素、实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que。生理盐水组使用0.9wt％的NaCl水溶液，给药组使用0.04wt％羟甲基纤维素钠水溶液配制浓度为2.5mg/mL的给药溶液，注射体积根据动物体重，以每1kg给药10mg计。30min后采用大脑中动脉闭塞(MCAO)建立脑缺血再灌注模型。缺血再灌注24h后通过动物行为学筛选合适大鼠处死并取脑，并对脑组织进行TTC染色、定量分析，其结果如图5中A、B所示，同时进行H&E染色，其结果如图5中C所示。
从图5可以看出，槲皮素、实施例1的glu-que和实施例2的glu2-que均对脑缺血的大鼠模型有神经保护作用。生理盐水组海马区梗死与假手术组相比白色区域达到38.45％，而que、glu-que和glu2-que的白色区域分别为21.56％、15.20％和5.06％。因此三种化合物改善氧化损伤的能力为glu2-que＞glu-que＞que，与细胞氧化损伤实验一致。
综上所述，相比于槲皮素，本发明的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的稳定性、水溶性、血脑屏障穿透率、脑靶向以及生物活性均明显提高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种槲皮素的葡萄糖苷衍生物，其特征在于，具有如下结构通式：
式中，R1为R2为/>
2.根据权利要求1所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物，其特征在于，具有如下结构式中的至少一种：
3.如权利要求1或2所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6-叠氮-6-脱氧葡萄糖与端炔化的槲皮素进行click反应，得到槲皮素的葡萄糖苷衍生物；
其中，所述6-叠氮-6-脱氧葡萄糖的结构式为：
所述端炔化的槲皮素的结构式为：式中，R3为R4为/>
4.根据权利要求3所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述click反应的温度为10～50℃，所述click反应的时间为1～24h。
5.根据权利要求3所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述6-叠氮-6-脱氧葡萄糖和所述端炔化的槲皮素的摩尔比为1：0.1～0.4。
6.根据权利要求3所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述端炔化的槲皮素为
7.根据权利要求3所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述端炔化的槲皮素的制备方法包括：槲皮素与3-溴丙炔进行取代反应，得到所述端炔化的槲皮素。
8.根据权利要求7所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述取代反应的温度为40～60℃，所述取代反应的时间为2～8h。
9.根据权利要求7所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述槲皮素与所述3-溴丙炔的摩尔比为1：0.5～2。
10.权利要求1或2所述的槲皮素的葡萄糖苷衍生物在制备抗氧化药物中的应用。
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