CN114903059A

CN114903059A - 麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用

Info

Publication number: CN114903059A
Application number: CN202210704000.4A
Authority: CN
Inventors: 杨祁云; 蒋尚伯; 张永强; 张景欣; 白豫博; 葛百一; 蒲小明; 沈会芳; 孙大元; 区俊涛; 刘平平
Original assignee: Guangdong Supply And Marketing Green Agricultural Products Production And Supply Base Operation Co Ltd; Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangdong Supply And Marketing Green Agricultural Products Production And Supply Base Operation Co Ltd; Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2022-08-16
Also published as: LU502885B1

Abstract

本发明公开了麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用。本发明先在体外建立了软腐病菌Dickeya zeae生物被膜的筛选模式，然后通过结晶紫法以及扫描电镜研究麝香草油对软腐病菌生物被膜的干预作用，发现麝香草油微乳制剂对软腐病菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，能够有效干预作物软腐病菌生物被膜的形成。因此，可将其用于开发抑制软腐病菌生物被膜形成的农药制剂或培养基，用于防治作物软腐病，具有对环境友好、低毒、低残留的特点。

Description

麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用

技术领域

本发明涉及作物病害防治领域，特别涉及麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用。

背景技术

由Dickeya zeae引起的软腐病是世界上最具破坏性的作物病害之一，最高发病率达到90％(Zhang et al,2014)。而且目前为止尚未找到有效的防治药剂。

生物被膜状态的细菌与浮游态的细菌在组成结构、生理特性、耐药性等方面存在较大差异。本实验室前期研究表明细菌软腐病菌Dickeya zeae能够在不同环境参数(包括碳源，温度，pH水平和矿物元素)下形成生物被膜(Huang et al,2019)。细菌生物被膜这一细菌群体结构可以使细菌对外界环境的抵抗力增强，不易被杀菌剂和抗生素清除，从而大大增加了防治的困难。因此，利用对环境友好的天然产物作为细菌性软腐病菌生物被膜的抑制因子可为绿色植物保护技术的开发提供新思路，对于作物细菌性病害绿色防控也具有重要意义。

麝香草油，来源于麝香草，具有对环境友好，无毒副作用，无残留的特点。但迄今为止，尚无麝香草油对细菌性软腐病菌生长及其生物被膜形成具有抑制或干预作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用。

所述的麝香草油，主要来源于麝香草，其对软腐病菌生物被膜具有显著的抑制作用。

所述的麝香草油制剂包括麝香草油微乳制剂、含有麝香草油的培养基和含有麝香草油微乳制剂的培养基中的至少一种。

所述的麝香草油微乳制剂中麝香草油占麝香草油微乳制剂总体积的10％。

所述的麝香草油微乳制剂为10％麝香草油微乳剂，其含有如下按体积百分数计的组分：麝香草油10％，甲醇10～15％，601#表面活性剂10～12％，NP-10表面活性剂10～18％，乙醇9～10％，1,2-丙二醇1～2％，水补足至100％(pH值5.0～6.5)。

所述的10％麝香草油微乳剂优选为含有如下按体积百分数计的组分：麝香草油10％，甲醇10％，601#表面活性剂10％，NP-10表面活性剂10％，乙醇10％，1,2-丙二醇1％，水补足至100％(pH值5.0～6.5)。

所述的10％麝香草油微乳剂的使用浓度为0.0125mg/mL～3.2mg/mL；优选为0.1～3.2mg/mL；更优选为0.2～3.2mg/mL。

所述的培养基包括LB培养基等。

所述的麝香草油和/或麝香草油制剂通过抑制软腐病菌生物被膜的形成，降低软腐病菌的致病力，以达到防治作物软腐病的目的。

所述的作物包括农作物和花卉；包括马铃薯、香蕉、水稻、芭蕉芋、番薯、玉米和兰花中的至少一种；优选为马铃薯或香蕉。

所述的软腐病包括香蕉细菌性软腐病、水稻基腐病、马铃薯黑胫病、芭蕉芋细菌性软腐病、兰花软腐病(兰花细菌软腐病)和番薯细菌性软腐病中的至少一种；优选为香蕉细菌性软腐病菌；更优选为香蕉细菌性软腐病菌(Dickeya zeae)MS1。

麝香草油及其制剂在制备防治作物软腐病和/或抑制软腐病菌生物被膜形成的农药制剂中的应用。

所述的农药制剂还可以含有其他农药制剂可接受的辅料或载体。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明先在体外建立了软腐病菌Dickeya zeae生物被膜的筛选模式，然后通过结晶紫法以及扫描电镜研究了麝香草油对软腐病菌生物被膜的干预作用，发现麝香草油微乳制剂对软腐病菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，能有效干预软腐病菌生物被膜的形成，进而达到防治软腐病的目的，其具有对环境友好、低毒、低残留的特点。

2、本发明基于麝香草油具有抑制软腐病菌生物被膜形成的活性，可将其用于开发抑制软腐病菌生物被膜形成的农药制剂或培养基(如在液体培养基中添加有效浓度的麝香草油)等，为开发新型高效、低毒、环保防治软腐病菌的技术提供了新的思路和途径。

附图说明

图1是亚MIC浓度麝香草油微乳制剂对软腐病菌生物被膜的形成的影响图；其中；a和b为分别表示结晶紫染色前后在24孔板中的生物被膜；c为麝香草油微乳制剂对软腐病菌生物被膜的抑制效果统计图。

图2是麝香草油微乳制剂对软腐病菌生物被膜干预作用的扫描电子显微镜观察结果图；其中；A为1/2MIC麝香草油组；B为对照组。

图3是在麝香草油微乳制剂作用下的软腐病菌对马铃薯块茎的致病力影响图(图中，空白对照(Control)、1/4MIC、1/2MIC、MIC分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL麝香草油浓度处理组，柱上的不同小写字母代表差异达显著水平(P<0.05))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。本发明中涉及的实验材料、试剂和仪器如下：

1.实验材料

1.1实验菌株

香蕉细菌性软腐病菌(Dickeya zeae MS1)为本领域常规的细菌性软腐病菌，本实验所用的软腐病菌Dickeya zeae MS1由广东省农业科学院植物保护研究所实验室提供。

1.2麝香草油微乳制剂

10％麝香草油微乳剂的配方如下：麝香草油(江西康盛堂药业有限公司)10％(v/v)、甲醇10～15％(v/v)、601#表面活性剂(购自宜兴市嘉腾化工有限公司)10～12％(v/v)、NP-10表面活性剂(山东润广能源科技有限公司)10～18％(v/v)、乙醇9～10％(v/v)、1,2-丙二醇1～2％(v/v)，纯净水补足至100％。

本发明实施例中使用的10％麝香草油微乳剂的配方具体如下：麝香草油(江西康盛堂药业有限公司)10％(v/v)、甲醇10％(v/v)、601#表面活性剂(购自宜兴市嘉腾化工有限公司)10％(v/v)、NP-10表面活性剂(山东润广能源科技有限公司)10％(v/v)、乙醇10％(v/v)、1,2-丙二醇1％(v/v)，纯净水补足至100％。

所制得的10％麝香草油微乳剂的外观为均相透明的液体，透明温度区域满足0～54℃的标准要求，pH值范围为5.0～6.5，乳液稳定性、低温稳定性(0℃贮存7天实验)、热贮稳定性(54℃贮存14天实验)均合格。自然状态下贮存2年，分解率≤5％，外观呈均相透明状。

1.3PBS缓冲液购于上海生工有限公司，甲醇购于广州菲博生物科技有限公司。

2.主要试剂的配制

①LB液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母，10g氯化钠，加1升蒸馏水，高压蒸汽灭菌。

②99％甲醇溶液：1ml水加入99ml 100％的甲醇，混匀。

③0.1％结晶紫溶液：称取结晶紫0.1g，加入100ml蒸馏水，混匀。

④33％冰醋酸溶液：量取33ml的冰醋酸，加入67ml的蒸馏水，混匀。

3.实验仪器

全自动高压灭菌器(厦门致微仪器有限公司)；生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；恒温培养振荡器(江苏新康医疗器械有限公司)；96孔板、24孔板、6孔板(上海生工公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司TD2002A)；多功能酶标仪(Varioskan Flash)；扫描电镜(日本，S-3400N)。

实施例1：麝香草油微乳制剂对细菌性软腐病菌最小抑菌浓度(MIC)和最小致死浓度(MBC)值测定

用LB液体培养基将麝香草油微乳制剂(即10％麝香草油微乳剂)配成浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的混合液，混合均匀后各浓度按每孔200uL加入96孔板中，按3％(v/v)的接种量加入软腐病菌Dickeya zeae MS1的菌悬液(1×10⁸cfu/mL)，32℃培养24h，以LB液体培养基不加菌液为阴性对照，以LB液体培养基不加10％麝香草油微乳剂、加入菌悬液为阳性对照。24h后观察细菌生长情况。能抑制细菌生长的最小麝香草油微乳制剂的浓度为MIC值，吸取100uL梯度稀释后进行平板计数，无菌落出现的最小浓度为MBC值。三次重复。

麝香草油微乳制剂对细菌性软腐菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小致死浓度(MBC)值测定试验结果如表1所示：通过微量稀释法测定了麝香草油微乳制剂对细菌性软腐菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小致死浓度(MBC)，MIC值为0.1mg/mL，MBC值为0.2mg/mL。麝香草油微乳制剂具有有效杀死和抑制细菌性软腐病菌生长的作用。

表1不同浓度麝香草油微乳制剂对软腐病菌活性

注：“++”细菌可以生长且肉眼可见，“+”细菌被抑制生长肉眼不可见，“-”细菌不可生长肉眼不可见。

实施例2：亚MIC浓度的麝香草油微乳制剂抑制细菌性软腐病菌生物被膜形成的测定

(1)用LB液体培养基将10％麝香草油微乳剂配成浓度为1/2MIC(即1/2×0.1mg/mL＝0.05mg/mL，其它以此类推)、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC的混合液，混合均匀后各浓度按每孔1mL加入24孔板中，按1％(v/v)的接种量加入软腐病菌Dickeya zeae MS1的菌悬液(1×10⁸cfu/mL)，37℃静置24h，然后进行结晶紫定量。以不加10％麝香草油微乳剂的菌悬液为对照(Control)。培养结束后，轻轻去除浮游菌，加PBS缓冲液洗3次去除游离细菌和杂质，各孔中加入1mL无水甲醇15min以固定生物被膜，结束后吸出甲醇，各孔中加2％结晶紫染色液1mL染色，15min后用蒸馏水洗去多余染液，再加入33％(v/v)冰乙酸1mL，测定570nm波长处的光密度值。3次重复。

(2)生物被膜定量试验：用亚MIC浓度(1/2MIC，1/4MIC，1/8MIC，1/16MIC)的麝香草油微乳制剂和细菌性软腐病菌菌液共同培养24h后染色，酶标仪测定OD570值。3次重复。

结果如表2和图1所示：图1a和图1b分别表示结晶紫染色前后在24孔板中的生物被膜，图1c为3次重复取平均值；其中1/2MIC麝香草油组、1/4MIC麝香草油组以及1/8MIC麝香草油组OD₅₇₀值明显低于Control对照组OD₅₇₀值，差异极显著(**P＜0.01)。表明在1/2MIC、1/4MIC以及1/8MIC时，麝香草油微乳制剂对细菌性软腐病菌生物被膜形成具有明显的抑制作用。1/16MIC麝香草油组OD₅₇₀值与对照组OD₅₇₀值差异不显著(P＞0.05)。表明在1/16MIC时，麝香草油微乳制剂对细菌性软腐病菌生物被膜形成的抑制作用不明显。在1/2MIC、1/4MIC以及1/8MIC时，麝香草油微乳制剂对细菌性软腐病菌生物被膜形成的抑制作用，呈现剂量依赖性。

表2

实施例3：生物被膜结构观察

(1)将无菌的盖玻片(8mm×8mm)放入6孔板中，每孔中加2mL用LB液体培养基稀释好的软腐病菌Dickeya zeae MS1的菌液(1×10⁸cfu/mL)和10％麝香草油微乳剂(0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL)混合液，以不加10％麝香草油微乳剂的作为对照，37℃静置培养24h。培养结束后，弃去培养液，PBS缓冲液缓慢冲洗3次，加戊二醛固定液(2.5％)置于4℃过夜进行固定，再用PBS缓冲液冲洗3次，然后依次用质量浓度为50％、70％、85％、90％、95％和100％的乙醇溶液进行脱水，然后冷冻干燥、喷金，通过扫描电镜观察。3次重复。

(2)观察生物被膜结构：通过扫描电子显微镜观察软腐病菌在10％麝香草油微乳剂干预后生物被膜的形态，研究10％麝香草油微乳剂是否存在抑制软腐病菌生物被膜形成的作用。

部分实验结果如图2所示：对照组的软腐病菌能够形成致密的生物被膜，生物被膜由多层细菌簇集，细菌被周围分泌的生物被膜基质包裹(图2B)；而1/2MIC(半致死浓度)麝香草油组的软腐病菌数明显减少且分散，几乎不能聚集团块，且未形成明显的生物被膜基质(图2A)，表明10％麝香草油微乳剂具有明显的抑制软腐病菌生物被膜形成的作用。

实施例4：麝香草油对病菌致病力的影响及对软腐病的防治作用

1、在麝香草油微乳制剂的作用下的软腐病菌对马铃薯块茎的致病力

用不同浓度(浓度为1/4MIC、1/2MIC和MIC)的10％麝香草油微乳剂处理软腐病菌Dickeya zeae MS1的菌液(1×10⁸cfu/mL)，即在马铃薯切片(厚度为5mm，面积为2cm²)的表面先喷施10％麝香草油微乳剂，晾干后再将软腐病菌Dickeya zeae MS1的菌液接种到马铃薯切片上(接种量为1ml)，培养24h，以不经过10％麝香草油微乳剂处理的马铃薯切片为对照，观察马铃薯切片上的病斑面积。3次重复。

结果如图3所示：可以看到，用1/4MIC、1/2MIC和MIC浓度的10％麝香草油微乳剂处理后，染病的马铃薯切片上的病斑面积，与对照组比较分别减少了62.8％、87.5％和97.2％。结果表明，在10％麝香草油微乳剂的作用下，软腐病菌对马铃薯致病力下降。

2、麝香草油微乳制剂对感染软腐病的香蕉幼苗盆栽的防治效果

挑选株高20cm、生长健壮的香蕉幼苗(盆栽)。将10mL新鲜培养的软腐病菌Dickeyazeae MS1的菌液(1×10⁸cfu/mL)浇灌每个幼苗的根际。12h后，将10mL 10％麝香草油微乳剂(0.4mg/mL)也浇灌到根际，浇灌等量无菌水作为对照，每个处理做20株香蕉苗。在灌根处理后第3、7和14天调查香蕉软腐病的发生率。3次重复。

以0～4的等级评估病害严重程度：0级：表示健康植物；1级：表示香蕉幼苗植株低于25％的部位出现软腐症状；2级：表示香蕉幼苗植株25～50％(不含50％)的部位出现软腐症状；3级：表示香蕉幼苗植株50～75％(不含75％)的部位出现软腐症状；4级：表示植株75～100％的部位出现软腐症状。

疾病指数和防治效率计算如下：

病情指数＝[∑(发病植株数量×对应的发病等级)/(植株总数×4)]×100；

防治效率(％)＝[(对照病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数]×100。

结果如表3所示：10％麝香草油微乳剂(0.4mg/mL)对软腐病的香蕉幼苗盆栽防治效果发现，在施药后第3、7和14d的防效分别为14.3％、22.7％和32.0％。接种后14d，对照植物的病情指数为58.8，而10％麝香草油微乳剂处理组的病情指数为40.0，表明10％麝香草油微乳剂可以减弱软腐病菌对香蕉的致病力，对防治软腐病有一定的防治效果。

表3麝香草油对香蕉软腐病的防治效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.麝香草油及其制剂在防治作物软腐病中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的麝香草油和/或麝香草油制剂通过抑制软腐病菌生物被膜的形成，降低软腐病菌的致病力，以达到防治作物软腐病的目的。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的麝香草油制剂为麝香草油微乳制剂、含有麝香草油的培养基和含有麝香草油微乳制剂的培养基中的至少一种；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述的麝香草油微乳制剂为10％麝香草油微乳剂，其含有如下按体积百分数计的组分：麝香草油10％，甲醇10～15％，601#表面活性剂10～12％，NP-10表面活性剂10～18％，乙醇9～10％，1,2-丙二醇1～2％，水补足至100％。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的10％麝香草油微乳剂含有如下按体积百分数计的组分：麝香草油10％，甲醇10％，601#表面活性剂10％，NP-10表面活性剂10％，乙醇10％，1,2-丙二醇1％，水补足至100％。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述的培养基为LB培养基；

所述的10％麝香草油微乳剂的使用浓度为0.0125mg/mL～3.2mg/mL。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述的10％麝香草油微乳剂的使用浓度为0.1～3.2mg/mL。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的作物为农作物或花卉；

所述的软腐病为香蕉细菌性软腐病、水稻基腐病、马铃薯黑胫病、芭蕉芋细菌性软腐病、兰花软腐病和番薯细菌性软腐病中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的作物为马铃薯、香蕉、水稻、芭蕉芋、番薯、玉米和兰花中的至少一种。

10.麝香草油及其制剂在制备防治作物软腐病和/或抑制软腐病菌生物被膜形成的农药制剂中的应用。