CN114894924A - 一种通过非衍生化gc-ms同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过非衍生化GC‑MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，在色谱分析的过程中，以DB‑WAX UI作为色谱柱，采用乙腈或甲醇作为提取剂对血浆样本进行提取，无需进行衍生化反应，即可同时测定人血浆中氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸血药浓度，极大的简化了样本前处理步骤，具有灵敏度高、精密度及准确度好、基质无干扰、回收率高、分析时间短等优点，可实现人血浆样本的快速分离分析，可用于临床药代动力学样本监测，实现在临床癫痫患者的治疗药物监测中的应用。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其中，4种抗癫痫药物分别为氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁、丙戊酸。
背景技术
癫痫(epilepsy)是由各种原因引起的脑组织局部神经元异常高频放电，并向周围组织扩散，导致大脑功能短暂失调的综合征，是一种表现为反复癫痫发作的慢性脑部疾病，影响着全球约7000多万人口，每年约有12.5万例癫痫患者死亡。在我国，癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大神经系统疾病，给患者和家属带来极大的痛苦。药物治疗仍然是当前控制癫痫发作的首选。目前，临床上常用的抗癫痫药物(AEDs)约有27种。尽管新一代抗癫痫药已经克服了经典抗癫痫药物的个体差异大、非线性药代动力学、毒性大等缺点，但氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸等第一代或第二代抗癫痫药物仍在我国或其他发展中国家的基层医院广泛使用。
由于癫痫病人常常需要长期用药，在此过程中，病人个体间的差异、不同个体所受外界影响因素的差异、病理生理变化的差异等，均会影响抗癫痫药物的药动学参数、药物的体内暴露量，导致不同个体产生不同的疗效及毒副反应。治疗药物监测(TDM)是临床上癫痫患者治疗过程中实现快速调整给药方案的有效途径之一。目前，AEDs的TDM方法主要有免疫分析法及色谱法。免疫分析法是利用AEDs与其特异性抗体在体外反应的原理测定，因其具有样品量少、操作方便、快捷的特点，在AEDs的TDM中被广为采用。但该方法必须针对投入市场的每一种AEDs研制出抗体，且待监测AEDs的代谢产物、结构类似物、患者同服其他药物或食物，均可能与抗体产生交叉反应，致使测定的结果往往高于真实的血药浓度，干扰用药方案和用药剂量的调整。因此，可以同时进行多种化合物分离和检测的色谱法作为替代方法，在AEDs的TDM中得到了广泛的应用。
丙戊酸是治疗癫痫最常用的一线抗癫痫药物，主要通过增强γ-氨基丁酸(GABA)功能或增加GABA相关合成酶活性，发挥抗癫痫作用。而氨己烯酸、普瑞巴林和加巴喷丁是GABA的结构类似物，主要用于治疗癫痫发作或神经性疼痛。其中，丙戊酸和加吧喷丁的药代动力学是非线性的，TDM必不可少。而氨己烯酸和普瑞巴林的药代动力学虽然呈线性，但其血药浓度监测仍有助于剂量调整并规避潜在的毒副作用。由于上述4种AEDs的均为极性化合物，且均无紫外吸收，通常采用化学衍生化结合气相色谱或高效液相色谱进行血药浓度测定。然而，衍生化试剂选择要求较高，衍生化实验操作繁琐，使得样品前处理过程耗时较长，且衍生化不完全也影响样本测定的准确度及灵敏度。液相色谱-串联质谱虽然可以解决这一问题，但其昂贵的价格限制了其在我国或其他发展中国家大多数基层医院的应用和推广。气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)则因其较为亲民的价格更具推广优势。此外，临床工作者每天需要面对大量使用不同抗癫痫药物的癫痫患者，如每个药物建立一种色谱方法，测定过程中的清洗设备、更换色谱柱或流动相等一系列操作均给治疗药物监测带来较多不便，影响个体化用药和临床医生调整剂量的决策时间，进而影响癫痫病的治疗质量。
因此，建立一种简便易行、无需化学衍生化、适用于不同等级医院，且能够同时测定癫痫患者血浆中氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸浓度的GC-MS方法，以实现临床治疗药物监测中极性强且无紫外吸收的抗癫痫药物的高效快速提取、分离及分析，已成为临床工作者的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，在色谱分析的过程中，无需进行衍生化反应，即可同时测定人血浆中氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸血药浓度，可用于临床药代动力学样本监测，实现在临床癫痫患者的治疗药物监测中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，
所述4种抗癫痫药物分别为：氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁、丙戊酸；
上述4种抗癫痫药物所选择的内标为：苯甲酸；
采用非衍生化GC-MS方法检测经过预处理的血浆中的上述抗癫痫药物，具体色谱条件为：
气相色谱条件：色谱柱为DB-WAX UI；载气为氦气；采用分流模式进样，分流比为8～12:1；进样口温度与传输线温度为250～310℃；升温程序如下：初始温度为65～75℃，保持1～3min；以25～35℃/min的速度升至150～170℃；再以15～25℃/min的速度升至220～240℃，保持4～5min；
质谱条件：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV；选择Scan模式对4种抗癫痫药物及内标定性，扫描范围为m/z 35～450；采用SIM模式进行数据采集及定量分析；
其中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆样品中加入内标，混合均匀后先加入HCl酸化，再加入提取剂，涡旋离心后取上清液；将所得上清液挥干，加入等体积乙腈进行复溶，再次离心后，过滤，取续滤液，待进样；其中，提取剂为甲醇或乙腈。
在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取血浆样本200μL，向其中加入20μL内标储备液，混合均匀后先加入10μL 5mmol/L HCl酸化，再加入400μL提取剂，涡旋30s，在4℃下12000rpm离心10min，离心后取400μL上清液，挥干，加入等体积乙腈进行复溶，在4℃下12000rpm离心5min，0.22μm尼龙滤膜过滤，取续滤液，待进样。其中，提取剂为甲醇或乙腈。
对于本发明而言，在血浆样品预处理的过程中，不同的提取剂对氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸的提取率影响较大，因此需要选择特定的提取剂来提高待测物的提取率。例如，血浆样品经乙酸乙酯、乙醚及甲基叔丁醚提取处理后，仅对丙戊酸有较高提取率，而对氨己烯酸、普瑞巴林和加巴喷丁的提取率显著低于甲醇和乙腈。采用甲醇和乙腈作为提取溶剂时，在色谱分析过程中，可以同时获得4种抗癫痫药物良好的色谱峰响应值，以乙腈的效果最佳。
在本发明中，针对上述4种抗癫痫药物所选择的内标为苯甲酸，其中，内标储备液的制备方法如下：精密称取苯甲酸2.04mg，置于2mL棕色容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度为1.02mg/mL的内标储备液。
在气相色谱分析过程中，氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸均为极性化合物，不同色谱柱对于上述4种抗癫痫药物的分离分析具有不同的效果。在本发明中，选择的色谱柱为DB-WAX UI，可以实现对未经衍生化的氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸的分离，各成分具有良好的峰形及分离度。优选地，色谱柱的长度为30m，直径为0.25mm，填料粒径为0.25μm。在相同的色谱条件下，采用其他类似的色谱柱，例如，HP-5MS(60m×0.25mm,0.25μm)，所得的色谱图中色谱峰响应值低，峰形较差存在拖尾、分离度较差等问题，分离效果不佳。
在一种优选方案中，本发明的气相色谱条件包括：色谱柱为DB-WAX UI(30m×0.25mm,0.25μm)；载气为氦气；溶剂延迟时间为6min；采用分流模式进样，分流比为10:1；进样口温度与传输线温度为260℃、280℃或310℃；升温程序如下：初始温度为70℃，保持2min；以30℃/min的速度升至160℃；再以20℃/min的速度升至230℃，保持4.2min。
进一步地，载气为氦气，氦气的纯度99.999％。流速为0.5～1.5为mL/min，优选为1mL/min。进样量为1.0～10.0μL，优选为1.0μL。
为保证待测物不因温度过高而分解的同时气化完全进入色谱柱，再以气体的形式进入质谱，进样口温度及传输线温度均应高于色谱柱温度及大部分待测物沸点，以得到更优色谱峰。对本发明而言，拟定进样口温度与传输线温度为250℃-310℃，可以但不局限于260℃、280℃或300℃，优选地，进样口温度与传输线温度为280℃。
在一种优选方案中，本发明的质谱条件包括：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV；选择Scan模式对4种抗癫痫药物及内标定性，扫描范围为m/z 35～450；采用SIM模式进行数据采集及定量分析，定量离子分别为：氨己烯酸为m/z 56、84、111；普瑞巴林为m/z 56、84、141；加巴喷丁为m/z 81、110、153；丙戊酸为m/z 73、102、115。
本发明提供的采用非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，还包括配制不同浓度的对照品标准溶液，不同浓度的对照品标准溶液按照如下方法制备：分别精密称取氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸共4种抗癫痫药物的对照品5.0、5.0、5.0、20.0mg，置于5mL容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度分别为1.0、1.0、1.0、4.0mg/mL的对照品储备液；再用体积比为50％乙腈水溶液将各对照品储备液逐级稀释至浓度分别为0.08-1.0mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.4-4.0mg/mL的对照品标准溶液。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，采用乙腈或甲醇作为提取剂对血浆样本进行提取，可同时获得4种抗癫痫药物更好的色谱峰响应值。
(2)本发明通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，以DB-WAX UI作为色谱柱，可以实现对未经衍生化的强极性、无紫外吸收的氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸进行分离，各成分具有良好的峰形及分离度。
(3)本发明通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，可实现同时测定血浆中4种抗癫痫药物的血药浓度测定，减少临床工作人员的工作量，整个检测方法中无需化学衍生化，极大的简化了样本前处理步骤，缩短实验耗时。
(4)本发明通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，具有灵敏度高、精密度及准确度好、基质无干扰、回收率高、分析时间短等优点，可实现人血浆样本的快速分离分析，适用于临床癫痫患者的治疗药物监测。
(5)本发明选择非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，为癫痫患者治疗药物监测提供了新的测定方法，操作简单、分析快速，且仪器价格较为亲民，易于在各级医院中推广应用。
附图说明
图1是实施例1中混合对照品溶液的GC-SIM-MS色谱图；其中，图1中(A)为混合对照品溶液的色谱图，1：丙戊酸；2：氨己烯酸；3：普瑞巴林；4：加巴喷丁；IS：内标(苯甲酸)；图1中(B)为不同抗癫痫药物和内标的质谱图；
图2是实施例1中不同血浆样本的GC-SIM-MS色谱图；其中，图2中(A)为空白血浆样本；图2中(B)为混合对照品+空白血浆样本；图2中(C)为定量下限血浆样本；图2中(D)为癫痫患者实际血浆样本；在图2中，1：丙戊酸；2：氨己烯酸；3：普瑞巴林；4：加巴喷丁；IS：内标(苯甲酸)；
图3为实施例2中46例癫痫患者血药浓度及浓度计量比分布图，其中，图3中(A)为血药浓度分布图，MEC为最小有效浓度；MTC为最小中毒浓度；图3中(B)为浓度计量比分布图；
图4为对比例1中不同样本提取剂处理后测定4种抗癫痫药物的GC-SIM-MS色谱图，其中，图4中(A)为乙腈；图4中(B)为甲醇；图4中(C)为乙酸乙酯；图4中(D)为乙醚；图4中(E)为甲基叔丁基醚；
图5为对比例2中不同色谱柱分析得到的4种抗癫痫药物GC-SIM-MS色谱图，其中，图5中(A)为HP-5MS(60m×0.25mm,0.25μm)色谱柱；图5中(B)为DB-WAX UI(30m×0.25mm,0.25μm)色谱柱；
图6为对比例3中不同进样口与传输线温度条件下分析得到的4种抗癫痫药物GC-SIM-MS色谱图，其中，图6中(A)为260℃；图6中(B)为280℃；图6中(C)为300℃。
具体实施方式
为了能更清楚地理解本发明的技术方案，通过以下实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。实施例中所使用的设备或原料皆可从市场获得。
实施例1：通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法
1.1仪器
气相(7890A)-质谱(5975C)联用仪(美国安捷伦公司)，AB265-S型梅特勒电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，Sorvall Legend Micro 21R高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)，LNG-T98A移动式真空离心浓缩仪(太仓华利达有限公司)，超纯水机(美国Millipore公司)，SB-5200D型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，XW-80A微型旋转混合仪(上海泸西分析仪器厂)。
1.2药品与试剂
甲醇、乙腈为色谱纯(SEPSRV公司)，乙酸乙酯为分析纯、普瑞巴林对照品(麦克林科技有限公司)，盐酸、乙醚为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，苯甲酸内标、加巴喷丁对照品(上海阿拉丁科技有限公司)，氨己烯酸对照品(美国MCE生物有限公司)，甲基叔丁基醚(成都西亚试剂有限公司)，丙戊酸对照品(上海安耐吉有限公司)，丙戊酸片(山东仁和堂药业有限公司)。
1.3对照品溶液及血浆样本的处理
1.3.1不同浓度的对照品标准溶液的制备
分别精密称取氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸共4种抗癫痫药物的对照品5.0、5.0、5.0、20.0mg，置于5mL容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度分别为1.0、1.0、1.0、4.0mg/mL的对照品储备液，4℃保存。精密量取上述各对照品标准贮备液，用50％乙腈水溶液逐级稀释，得到不同浓度的对照品标准溶液(氨己烯酸：0.08、0.1、0.2、0.5、0.75、1.0mg/mL；普瑞巴林：0.05、0.1、0.2、0.5、0.74、1.0mg/mL、加巴喷丁：0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1.0mg/mL；丙戊酸：0.4、1.0、1.6、2.0、3.0、4.0mg/mL)。
1.3.2内标溶液的制备：
精密称取苯甲酸2.04mg，置于2mL棕色容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度为1.02mg/mL的内标储备液，4℃保存。
1.3.3混合对照品溶液的制备：
分别精密移取浓度为1mg/mL的4种抗癫痫药物对照品及内标储备液20μL，混合制备成氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁、丙戊酸和苯甲酸的浓度分别为200μg/mL的混合对照溶液，经0.22μm滤膜过滤，待进样分析。
1.3.4标准血浆样本及质控样本的制备：
分别精密移取4种抗癫痫药物的不同浓度的对照品标准溶液10μL，加入190μL人空白血浆，充分混匀，制备成含不同浓度抗癫痫药物的标准血浆样本(氨己烯酸：4.0、6.0、10.0、25.0、37.5、50.0μg/mL；普瑞巴林：2.5、5.0、10.0、25.0、37.0、49.5μg/mL、加巴喷丁：2.5、5.0、10.0、25.0、37.5、50.0μg/mL；丙戊酸：20.0、50.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg/mL)。按照上述方法制备高、中、低浓度质控样本。
1.3.5血浆样本的处理
精密移取血浆样本200μL，向其中加入20μL内标储备液，混合均匀后，先加入10μL5mmol/L HCl酸化，再加入400μL乙腈，涡旋30s，在4℃下12000rpm离心10min；离心后取上清液400μL，挥干，加入等体积乙腈复溶，在4℃下12000rpm离心5min，经0.22μm尼龙滤膜过滤，取续滤液，待进样分析。
1.4色谱及质谱条件
1.4.1气相色谱条件
色谱柱为DB-WAX UI(30m×0.25mm,0.25μm)，载气为氦气(纯度≥99.999％)，流速为1mL/min，采用分流模式进样，分流比为10:1，进样量为1.0μL；溶剂延迟时间为6min；升温程序如下：起始温度70℃，保持2min；以30℃/min升至160℃；以20℃/min升至230℃，保持4.2min。进样口温度与传输线温度为280℃。
1.4.2质谱条件
离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV。选择Scan模式对4种抗癫痫药物及内标定性，扫描范围为m/z 35～450。采用SIM模式进行数据采集及定量分析。
1.5 4种抗癫痫药物的GC-MS测定
将混合对照品溶液按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，得到色谱图及质谱图(如图1所示)，定量离子分别为：丙戊酸为m/z 73、102、115；氨己烯酸为m/z 56、84、111；普瑞巴林为m/z 56、84、141；加巴喷丁为m/z 81、110、153。
1.6方法学考察
1.6.1专属性考察
取混合对照品溶液及经“1.3.5项下”方法进行处理的空白血浆样本、混合对照品+空白血浆样本、定量下限血浆样本、癫痫患者实际血浆样本，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录色谱图。如图2所示，人血浆中的内源性物质对待测物及内标的定量测定无干扰，本发明所建立的GC-MS分析方法特异性强。
1.6.2线性及定量下限
将“1.3.4”项下系列血浆样本经“1.3.5项下”方法进行处理，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录色谱图和色谱峰面积，以4种抗癫痫药物的峰面积与内标峰面积比值(y)对其相应的浓度(x)进行回归，得回归方程及相关系数，结果见下表1。
表1 4种抗癫痫药物的标准曲线、相关系数、线性范围及定量下限(浓度单位:μg/mL)
1.6.3提取回收率
取低、中、高3种浓度的质控血浆样本，每个浓度5份，经“1.3.5项下”方法进行处理，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录4种抗癫痫药物与内标物的色谱图和色谱峰面积，计算待测物与内标峰面积比值(R1)。
另取同样低、中、高浓度的标准对照品溶液，每个浓度5份，经“1.3.5项下”方法进行处理，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录4种抗癫痫药物与内标物的色谱图和色谱峰面积，计算待测物与内标峰面积比值(R2)，以R1/R2×100％表示提取回收率，结果如表2所示。由表中结果可见，各化合物的低、中、高浓度的提取回收率均>87.97％，RSD值均<12.5％，说明本方法提取回收率稳定可重现。
表2 4种抗癫痫药物的提取回收率(Mean±SD,n＝5,浓度单位:μg/mL)
1.6.4精密度与准确度
取定量下限、低、中、高4种浓度的质控血浆样本，每个浓度5份，经“1.3.5项下”方法进行处理，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录4种抗癫痫药物与内标物的色谱图和色谱峰面积，计算精密度与准确度，结果见表3。由表可见，4种抗癫痫药物的定量下限处精密度的RSD值均<14.5％，准确度在102.20％～116.92％范围内。低、中、高浓度的QC血浆样本精密度的RSD值均<10.2％，准确度在90.75％～110.87％范围内，均符合生物样本分析要求。
表3 4种AEDs化合物批内、批间精密度测定结果(Mean±SD,浓度单位:μg/mL)
实施例2：临床癫痫患者治疗药物监测应用
临床收取46例癫痫患者口服丙戊酸后24h的血浆样本，经实施例1中“1.3.5项下”方法进行处理，按照“1.4项下”气相及质谱条件分析测定，记录色谱图及峰面积，根据当日校正曲线计算血药浓度，并根据对应实际服用剂量，计算浓度计量比，结果见图3。如图3A所示，7例患者血浆浓度高于丙戊酸的最小毒性浓度，18例患者血浆浓度低于丙戊酸的最小有效浓度。图3B的结果显示，5例患者的浓度计量比高于mean±SD，且与其他患者明显偏离。结果表明，本检测方法适用于真实血浆样品中丙戊酸的测定，同时表明接受丙戊酸治疗的癫痫患者存在显著的个体差异，提示对丙戊酸进行治疗药物监测十分必要，在癫痫的临床治疗中具有重要作用。
对比例1：血浆样本处理条件优化
参照实施例1中“1.35项下”血浆样本的处理方法，将乙腈作为提取剂替换成甲醇、乙酸乙酯、乙醚及甲基叔丁基醚。采用实施例1中的色谱条件及质谱条件进样分析，记录色谱图(见图4)。如图4可知：血浆样品经乙酸乙酯、乙醚及甲基叔丁醚处理后，仅对丙戊酸有较高提取率，而对氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁的提取率显著低于甲醇和乙腈，且上述三种提取剂的毒性相对较大，安全性差。又因甲醇提取后色谱峰的丰度低于乙腈，因此，选择乙腈作为提取剂处理血浆样本效果最佳。
对比例2：色谱条件优化
2.1色谱柱优化
参照实施例1中“1.4.1项下”的色谱条件，将DB-WAX UI(30m×0.25mm,0.25μm)色谱柱替换成HP-5MS(60m×0.25mm,0.25μm)色谱柱，对样本进行分析，具体色谱图见图5。如图5可知，在相同的色谱条件下，采用HP-5MS(60m×0.25mm,0.25μm)色谱柱时，所得的色谱图中色谱峰响应值低，峰形较差存在拖尾、分离度较差等问题，分离效果不佳。
2.2进样口与传输线温度优化
参照实施例1中“1.4.1项下”的色谱条件，将进样口与传输线温度280℃替换成260℃、300℃，对样本进行分析，具体色谱图见图6。如图6可知，采用260℃和300℃作为进样口与传输线温度时，所得色谱峰峰型及分离度均较好，但色谱峰响应值低于280℃条件，因此，采用280℃作为进样口与传输线温度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，
所述4种抗癫痫药物分别为：氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁、丙戊酸；
上述4种抗癫痫药物所选择的内标为：苯甲酸；
采用非衍生化GC-MS方法检测经过预处理的血浆中的上述抗癫痫药物，具体色谱条件为：
气相色谱条件：色谱柱为DB-WAX UI；载气为氦气；采用分流模式进样，分流比为8～12:1；进样口温度与传输线温度为250～310℃；升温程序如下：初始温度为65～75℃，保持1～3min；以25～35℃/min的速度升至150～170℃；再以15～25℃/min的速度升至220～240℃，保持4～5min；
质谱条件：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV；选择Scan模式对4种抗癫痫药物及内标定性，扫描范围为m/z 35～450；采用SIM模式进行数据采集及定量分析；
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆样品中加入内标，混合均匀后先加入HCl酸化，再加入提取剂，涡旋离心后取上清液；将所得上清液挥干，加入等体积乙腈进行复溶，再次离心后，过滤，取续滤液，待进样；其中，所述提取剂为甲醇或乙腈。
2.根据权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取血浆样本200μL，向其中加入20μL内标储备液，混合均匀后先加入10μL 5mmol/L HCl酸化，再加入400μL提取剂，涡旋30s，在4℃下12000rpm离心10min，离心后取400μL上清液，挥干，加入等体积乙腈进行复溶，在4℃下12000rpm离心5min，0.22μm尼龙滤膜过滤，取续滤液，待进样。
3.根据权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述内标储备液的制备方法如下：精密称取苯甲酸2.04mg，置于2mL棕色容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度为1.02mg/mL的内标储备液。
4.根据权利要求3所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述提取剂为乙腈。
5.根据权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述气相色谱条件包括：色谱柱为DB-WAX UI；载气为氦气；溶剂延迟时间为6min；采用分流模式进样，分流比为10:1；进样口温度与传输线温度为260℃、280℃或310℃；升温程序如下：初始温度为70℃，保持2min；以30℃/min的速度升至160℃；再以20℃/min的速度升至230℃，保持4.2min。
6.根据权利要求5所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为30mm，直径为0.25mm，填料粒径为0.25μm；所述氦气的纯度99.999％；流速为0.5～1.5为mL/min，优选为1mL/min；进样量为1.0～10.0μL，优选为1.0μL。
7.根据权利要求6所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，进样口温度与传输线温度为280℃。
8.根据权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述质谱条件包括：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70eV；选择Scan模式对4种抗癫痫药物及内标定性，扫描范围为m/z 35～450；采用SIM模式进行数据采集及定量分析，定量离子分别为：氨己烯酸为m/z 56、84、111；普瑞巴林为m/z 56、84、141；加巴喷丁为m/z 81、110、153；丙戊酸为m/z 73、102、115。
9.根据权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，不同浓度的对照品标准溶液按照如下方法制备：分别精密称取氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁和丙戊酸共4种抗癫痫药物的对照品5.0、5.0、5.0、20.0mg，置于5mL容量瓶中，用体积比为50％乙腈水溶液溶解并定容至刻度，得到浓度分别为1.0、1.0、1.0、4.0mg/mL的对照品储备液；再用体积比为50％乙腈水溶液将各对照品储备液逐级稀释至浓度分别为0.08-1.0mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.4-4.0mg/mL的对照品标准溶液。
10.权利要求1所述的通过非衍生化GC-MS同时测定人血浆中4种抗癫痫药物的方法，其特征在于，该方法可用于临床癫痫患者抗癫痫药物的血药浓度监测。
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