CN114891849A - 阿胶肽及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用 - Google Patents
阿胶肽及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种阿胶低聚肽及其组合物、及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用。该阿胶低聚肽及其组合物，包括具有如SEQ ID NO.1～11所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。以此制得的阿胶肽‑铁螯合物及固体颗粒制剂不能能够改善化学诱导型贫血和辐射诱导贫血，还能够同时增强小鼠免疫机能，为进一步提升和开发与阿胶相关保健功能产品，以应用于补齐、养血、安胎等应用领域提供了广泛的前景。
Description
技术领域
本申请涉及阿胶技术领域，尤其涉及阿胶肽及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用。
背景技术
阿胶(Colla Corii Asini)作为传统中药材，被尊称为补血“圣药”，为马科动物驴的干燥皮或鲜皮去毛通过煎煮后加入适量黄酒、黄豆、冰糖等浓缩至稠膏状而成的固体胶。阿胶的主要成分有蛋白质、氨基酸、微量元素、多糖及硫酸软骨素、透明质酸等。
阿胶具有补血滋阴、润燥、止血之功效，临床多应用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌屡无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽咯血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏。然而，充分挖掘阿胶中具体的具有生理作用和功效的活性成分仍然具有十分现实的意义。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提取一种有别于现有技术的阿胶活性成分，以充分利用阿胶的保健资源。
第一方面，本申请实施例公开了一种阿胶低聚肽及其组合物，包括具有如SEQ IDNO.1～11所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。
第二方面，本申请实施例公开了一种阿胶肽-铁螯合物，由SEQ ID NO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成。
第四方面，本申请实施例公开了一种阿胶肽制剂，其包含由SEQ ID NO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成的阿胶肽-铁螯合物，以及保健学上可接受的辅料。
在本申请实施例中，保健学上可接受的辅料包括果粉、稀释剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂和食用香精。
第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的阿胶低聚肽及其组合物的制备方法，包括：
获得阿胶烊化液；
获得阿胶酶解液，所述酶解液由所述阿胶烊化液经由第一次酶解、脱脂、第二酶解和第三次酶解制得；其中，所述第一次酶解使用了脂肪酶，所述第二次酶解使用了糖基肽酶，所述第三次酶解使用了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；
对所述阿胶酶解液进行凝胶色谱层析和反相制备色谱纯化，得到所述阿胶低聚肽及其组合物。
在本申请实施例中，所述第一次酶解的具体步骤包括：
取阿胶烊化液，加入脂肪酶致使其浓度为5～15U/mL，温度40℃下搅拌处理90min后，于水浴100℃灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩得到浸膏。
在本申请实施例中，所述脱脂的具体步骤包括：
将所述浸膏混入至石油醚中，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为35W/L，搅拌充分混匀后，静置10min后，去除石油醚，得经石油醚处理后的固体物；再次加入乙酸乙酯搅拌充分混合后，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为15W/L范围，去除乙酸乙酯，得到脱脂物。
在本申请实施例中，所述第二次酶解的具体步骤包括：
取所述脱脂物溶于水中，加入糖基肽酶E-EF01、E-EF02和E-EF03，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩得到浸膏。
在本申请实施例中，所述第三次酶解的具体步骤包括：
将所述第三次酶解的浸膏加入至含有800～1200U木瓜蛋白酶和100～300U胰蛋白酶的pH＝7.5的PBS缓冲液中，于40℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，得到最终的酶解液。
第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的阿胶低聚肽及其组合物、第二方面所述的阿胶肽-铁螯合物或第三方面所述的阿胶制剂在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请实施例通过对阿胶进行二次开发，利用酶解、凝胶色谱和制备色谱技术，得到11种分子量低于3000的阿胶肽，并以此制得了阿胶肽-铁螯合物。该阿胶肽-铁螯合物不仅具有较好的稳定性，适应高湿环境，还通过动物实验证实了以该阿胶肽-铁螯合物制得的固体颗粒制剂不能能够改善化学诱导型贫血和辐射诱导贫血，还能够同时增强小鼠免疫机能，为进一步提升和开发与阿胶相关保健功能产品，以应用于补齐、养血、安胎等应用领域提供了广泛的前景。
附图说明
图1为本申请实施例1～2和对比例1～3凝胶色谱纯化洗脱曲线图。
图2为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F1～F11馏分的SDS-PAGE电泳图。
图3为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F1馏分的制备色谱图。
图4为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F2馏分的制备色谱图。
图5为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F3馏分的制备色谱图。
图6为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F5馏分的制备色谱图。
图7为本申请凝胶色谱纯化过程制得的F6馏分的制备色谱图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
阿胶低聚肽
一、材料与方法
1、相关材料
阿胶，产品编号：B13000154505，东阿阿胶股份有限公司。
脂肪酶，货号L3001，Sigma-Aldrich。
糖基肽酶，品牌Ludger，E-EF01：从多肽和蛋白质上选择性释放高甘露糖和部分混合态型N-多糖，1Unit/60μL；E-EF02：从多肽和蛋白质上选择性释放双线型和高甘露糖N-多糖(还原速率40X)，0.3Unit/60μL；E-EF03：从多肽和蛋白质上选择性释放三线型和岩藻糖基化双线型N-多糖，0.33Unit/60μL。
木瓜蛋白酶，货号P4762，Sigma-Aldrich；胰蛋白酶，货号Y0002311，Sigma-Aldrich。
2、酶解
一个具体的实施例1的实施过程如下：
(1)取阿胶过60目筛，加20倍重量的蒸馏水，于水浴80℃烊化30min，即阿胶烊化液3L；
(2)第一次酶解
取阿胶烊化液，加入脂肪酶致使其终浓度为10U/mL，温度40℃下搅拌处理90min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到253g浸膏；
(3)脱脂
将253g浸膏混入至1.5L石油醚中，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为35W/L，搅拌充分混匀后，静置10min后，去除石油醚，得经石油醚处理后的固体物；再次加入1.5L乙酸乙酯搅拌充分混合后，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为15W/L范围，去除乙酸乙酯，得到脱脂物227g。
(4)第二次酶解
取脱脂物10g，加入30mL水，充分混匀后，加入糖基肽酶E-EF01 2U、E-EF02 1U和E-EF03 1U致使其浓度分别为，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到6.23g浸膏；
(5)第三次酶解
将第二次酶解的6.23g浸膏加入至含有1000U木瓜蛋白酶和200U胰蛋白酶的pH＝7.5的PBS缓冲液(20mL)中，于40℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，得到最终的酶解液。
一个具体的实施例2的实施过程为：
取实施例1制得的脱脂物10g，加入30mL水，充分混匀后，加入糖基肽酶E-EF01 4U，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到6.23g浸膏；后续步骤与实施例1相同。
一个具体的对比例1的实施过程为：
取实施例1制得的脱脂物10g，加入至含有1000U木瓜蛋白酶和200U胰蛋白酶的pH＝7.5的PBS缓冲液(20mL)中，于40℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，得到最终的酶解液。
一个具体的对比例2的实施过程为：
取实施例1制得的脱脂物10g，加入30mL水，充分混匀后，加入糖基肽酶E-EF02 4U，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到6.23g浸膏；后续步骤与实施例1相同。
一个具体的对比例3的实施过程为：
取实施例1制得的脱脂物10g，加入30mL水，充分混匀后，加入糖基肽酶E-EF03 4U，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩，共浓缩3次，得到6.23g浸膏；后续步骤与实施例1相同。
3、凝胶色谱纯化
将上述得到的酶解液，采用滤纸过滤后，取滤液，经过截留分子量为3kD的中空纤维滤膜进行超滤浓缩，具体的，例如使用中空纤维超滤杯(货号C0005552，
XL小型切向流超滤装置，标称分子量3000)对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，进行凝胶色谱分离。
凝胶色谱分离条件：取上述5mL的超滤浓缩液上样至Sephadex G-50(G50150，Sigma-Aldrich)的凝胶色谱柱(1.5cm×80cm)后，静置15min，用pH＝6的PBS作为流动相进行洗脱，以A210吸光处的色谱峰进行分步收集，合并收集管，减压浓缩后，冷冻干燥，即可得到阿胶肽的冻干粗粉。
4、RP-HPLC分离纯化
将上述得到的冻干粗粉，经上述的截留分子量为5000的透析袋透析浓缩后，0.22μm过滤，以HPLC制备色谱纯化，按峰分别收集足量洗脱液，冷冻干燥，溶解于0.15％的甲酸水溶液中，以作为RP-HPLC的供试品，上样下述的C18色谱柱，收集色谱峰洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到阿胶肽冻干粉。
制备色谱的条件为：色谱柱为
Bio100 C18N(5μm,30mm ID)，安捷伦HPLC1200系列系统(安捷伦，沃尔德布朗，德国)，二极管阵列探测器(DAD)。
流动相为：A相0.1％三氟乙酸，B相乙腈；梯度程序为：0→5min，线性梯度5→15％B相；5→15min，线性梯度15→40％B；15→25min，40％B；25→30min，线性梯度30→50％B；每次运行之间采用20min的预平衡周期。流速为0.6ml/min，柱温为25℃，注入量为10μL，DAD波长设置为214nm。
5、阿胶肽序列鉴定
取适量样品溶于0.1％甲酸水溶液，进行HPLC-MS分析。
样品预处理：
(1)取lmg的阿胶肽样品放入离心管中，加入1mL 6M的pH8.0的Guanidine(配制在100mMNH4HC03中)溶液，得到1mg/mL的样品溶液；向样品溶液中加入20μL 1M的DTT，于37℃条件下反应1h，以还原阿胶肽中的双硫键；
(2)反应完成后，继续向上述反应液平均分为两份分别中加入25μL含1M碘乙酸和1M的氢氧化钠水溶液，在避光、室温条件下放置30min；
(3)再次用具有分离3kDa以下蛋白的Centricon超滤管中，以12000rpm离心50min。然后在以上离心管中分别加入200μL 0.1M的碳酸氢铵，再次离心30min；多次重复此操作，以降低样品中的Guanidine含量；
(4)将以上两个离心管滤层上的阿胶肽样品，分别多次加入总量约500μL 0.1M的碳酸氢铵溶液以完全溶解，并将这些含有阿胶肽样品的溶液转移到装有20μL的Trypsin试管中，再加入500μL 0.1M的碳酸氢铵溶液，使试管中液体的总量为1mL，37℃水浴中反应16h，各取500μL反应液分别用Centricon超滤管于15000rpm离心50min。
(5)收集滤液，35℃下真空干燥浓缩，此过程有助于碳酸氢铵的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。继续干燥浓缩至样品量到100μL左右。
(6)用0.15％的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。若样品溶液有浑浊状，需在12000-14000rmp转速下离心10min，取上清液进样分析。
色谱条件：
HPLC检测模式：紫外；扫描范围50～2000m/z；毛细管出口电压：166.0V，Skimmer联用系统电压：40.0V，Oct 1DC 12.00V，Oct 2DC 2.70V，Ampl分离宽度:4.0m/z，碎裂器电压：1.00Vt；离子极性：正离子；离子源类型：ESI(电喷雾离子化)；干燥温度：325℃，雾化器压力：15.00psi，干燥器流速：5.00L/min。多肽和多肽的碎片的质量电荷比每次全扫描后采集10个碎片图谱。原始文件用Mascot 2.3软件中的de navy算法分析。相关参数为:Enzyme＝none,Variable modifi-canon：Oxidation(M)，Peptides tolerance:20ppm，MS/MStolerance：0.1u，Mascot结果过滤参数为FDR≦0.01。
6、琼脂糖凝胶色谱
收集上述RP-HPLC的主要色谱峰洗脱分，进行SDS-PAGE电泳检测。
二、结果
实施例1～2和对比例1～3的凝胶色谱纯化洗脱曲线如图1所示。实施例1制得的馏分为F1～F3，实施例2制得的馏分为F4～F6，对比例1制得的馏分为F7，对比例2制得的馏分为F8～F9，对比例3制得的馏分为F10～F11。
将F1～F11经SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，F1、F2、F3、F5和F6存在有小于5Ku大小的肽段。进一步将F1、F2、F3、F5和F6进行RP-HPLC色谱制备，制备结果如图3～7所示。F1经过RP-HPLC的纯化得到7.04min、8.23min、11.46min和14.94min的四个主要的馏分。F2经过RP-HPLC的纯化得到15.14min、15.87min两个主要的馏分。F3经过RP-HPLC的纯化得到18.26min、19.36min和20.14min三个主要的馏分。F5经过RP-HPLC的纯化得到15.11min、15.69min两个主要的馏分。F6经过RP-HPLC的纯化得到18.31min、19.27min和20.07min三个主要的馏分。
对这些馏分均进行LS-MS检测，通过SEQUEST和Mascot两种搜索引擎进行搜索分析，并参考NCBI数据库对比确定了这馏分一级结构，结果如表1所示。
表1
由表1可知，F2(15.14min)和F2(15.87min)对应与F5(15.11min)和F5(15.69min)的一级结构较为接近，而F3的三个馏分与F6的三个馏分均相同。并且经过计算，SEQ IDNO.1～11所示的肽分子量均在1000～3000之间。
阿胶肽-铁螯合物的制备
经过对上述从阿胶中提取和酶解得到的11种阿胶肽，进一步利用其制备阿胶肽-铁螯合物，为此，本申请实施例公开了一种阿胶肽-铁螯合物，包括由SEQ ID NO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成。
一个具体的阿胶肽-铁螯合物的制备实施过程为：
取200mg的阿胶肽(F1(7.04min))，溶于1L含有0.1wt％的抗坏血酸，用10wt％的NaOH或HCl水溶液调节适当的pH＝5，然后加入FeCL2·4H2O致使其终浓度为10mg/L，于25℃下，置于磁力搅拌器上螯合20min，4500r/min离心5min，去除沉淀，减压浓缩(60～65℃，-0.07～0.08MPa)，冷冻干燥(-50℃，-0.01MPa)24h，即得阿胶肽-铁螯合物。
同样将上述得到的11种阿胶肽参照上述方法分别制得阿胶肽-铁螯合物，并对螯合过程的螯合率，并对阿胶肽-铁螯合物的初步稳定性进行评价。
螯合率评价方法为：
采用原子吸收光度法测定阿胶肽-铁螯合物中的铁元素含量。
(1)供试品的制备：精密称量阿胶肽-铁螯合物200mg，置于石墨消解仪中，加入硝酸-高氯酸(4:1)液合溶液8mL，轻轻地摇晃混匀，置于石墨消解仪中加热。采用程序升温的方法，保持微沸状态，在220℃时保持微沸20min，至溶液澄明后升高温度，继续在280℃下保持微沸30min，至样品溶液冒出浓烟，白烟散尽后，使消解液呈无色透明或略带黄色状态，放置室温，转移至50mL量瓶中，并用2％硝酸溶液洗涤容器，洗液合并于量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即样品消解液。
(3)配制0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/L的氯化亚铁溶液，上述方法分别制备不同浓度的标准消解液；分别于原子吸收光谱仪(美国热电仪器公司ICE3500)检测其吸光值，根据吸光值绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中铁元素含量。检测条件为：238nm，空气流量为6.5L/min，光谱通为0.2nm，灯电流为8nm，乙炔流量为2.0L/min，
(4)螯合率的计算：螯合率＝阿胶肽-铁螯合物中铁重量/阿胶肽-铁螯合物重量。
稳定性评价方法：
(1)供试品：将上述制得的11种阿胶肽-铁螯合物，分别命名为T1～T11，采用铝箔复合膜进行包装，以作为稳定性考察的供试品。
(2)高温试验：精密称定供试品20mg，平铺于洁净称量瓶中，60℃恒温放置10天取样，测定总铁含量，计算螯合率，并观察其外观性状。
(3)高湿试验：精密称定供试品20mg，平铺于洁净称量瓶中，分别于相对湿度90％±5％的干燥器中，将干燥器置于设定温度在25℃的培养箱中，于第10天取样，测定总铁含量，计算螯合率，并观察其外观性状。
(4)强光照射试验：精密称定供试品20mg，平铺于洁净称量瓶中，放在装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，于照度为45001x±500lx的条件下放置10天，测定总铁含量，计算螯合率，并观察其外观性状。
表2
由表2可知，经过上述步骤制得的阿胶肽-铁螯合物对铁的初始螯合率均达到了7‰以上，而且其中T7～T11的螯合率较高。但是这些阿胶铁-铁螯合物在高温试验中，均出现了不同程度的铁螯合率下降，代表本申请实施例对60℃的稳定性较差，可能存在高温对铁元素螯合作为的破坏作用。而高湿试验和强光照射试验中，虽然T1～T11对铁的螯合率均出现了下降，但相对高温试验，其螯合率下降不明显。在高湿环境中，T1～T11对铁的螯合率均与各自的初始铁螯合率相差无几，说明本申请实施例提供的阿胶肽-铁螯合物能够对抗高湿环境，稳定性较佳。
动物实验
一、材料与方法
1、实验动物
昆明小鼠，货号hnslkjd002，斯莱克景达，正常饮食。
2、供试品
为此进行相关实验，本申请实施例还提供了一种阿胶肽制剂，其包含由SEQ IDNO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成的阿胶肽-铁螯合物，以及保健学上可接受的辅料。
其中，保健学上可接受的辅料包括果粉、稀释剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂和食用香精。其中，果粉选自橘粉、苹果粉、葡萄粉、梨粉、草毒粉、蓝毒粉和蔓越酶粉中至少的一种；稀释剂包括魔芋粉、玉米粉、大豆粉、淀粉、糊精、微晶纤维素和食用无机盐类中的至少一种；粘合剂包括淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素中的至少一种；润滑剂包括硬脂酸镁、滑石粉和聚乙二醇中的至少一种；甜味剂包括白砂糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、甘露醇、赤鲜糖醇、安赛蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜中至少一种。
具体实施例提供的阿胶肽制剂为固体颗粒制剂，其配方如表3所示，固体颗粒制剂的制备采用常规药剂制备方法得到。表3中，对比例1使用的市售阿胶粉即为本申请实施例初始使用的阿胶原料。表3中，术语“份”仅用于区分各组分之间的重量配比关系，不用于具体限定各组分的实际重量，可以是任意重量，比如0.001mg、0.01mg、1mg、10mg、1g、10g、1kg、1000kg或1000t等。
表3
3、安全性实验
取昆明小鼠随机分为2组，一组口服上述实施例1～14和对比例1～6制得的固体颗粒制剂配制成的50mg/mL的水溶液口服灌胃，口服剂量为5g/kg体重；一组腹腔注射供试品0.5mL，2次每日，观察喂养7d，并再次于第14日和第21日由颈静脉注射进行。实验期间观察小鼠体重，饮食、活动、有无竖毛、呼吸困难、抽搐等过敏反应症状。
结果口服组小鼠灌胃一周后，小鼠食量无显著差异，活动正常，未表现出中毒这症状；腹腔注组小鼠，饮食和活动正常，未出现兴奋不安、呼吸困难等正常，表明供试品对小鼠不存在过敏反应。
4、各类贫血模型及实验
(1)第一贫血模型小鼠建立及分组实验
昆明小鼠均用按30mg/kg剂量脊背皮下注射2％盐酸苯肼溶液(CAS:59-88-1，默克Sigma-Aldrich)，每5d一次，连续注射3次，尾尖采血，测定外周血象，将血红蛋白值低于10.0g/L作为标准判断造模成功。造模成功后随机分为第一模型组和第一给药组。第一给药组按照20g/kg体重的剂量灌胃上述实施例1～14和对比例1～6制得的固体颗粒制剂配制成的50mg/mL的水溶液，连续灌胃7天；第一模型组不做处理；小鼠尾尖采血，进行抗凝检测(归蓉补血片对血虚证动物模型作用的实验研究[J].白求恩医科大学学报，2001,27(3):334-335.)RBC(×1012/L)，HGB(g/100mL)，WBC(×109/L)。
(2)第二贫血模型小鼠建立及分组实验
取昆明小鼠按照3.5Gy137Cs一次性辐射(剂量率1.27Gy/min)后作为模型小鼠，尾尖采血，测定外周血象，将血红蛋白值低于10.0g/L作为标准判断造模成功。分为第二模型组和第二给药组。第一给药组按照20g/kg体重的剂量灌胃上述实施例1～14和对比例1～6制得的固体颗粒制剂配制成的50mg/mL的水溶液，连续灌胃7天；第一模型组不做处理；小鼠尾尖采血，进行抗凝检测RBC(×1012/L)，HGB(g/100mL)，WBC(×109/L)。
5、免疫增强实验
(1)造模
取昆明小鼠，腹腔注射氢化可的松(HC,614157,Sigma-Aldrich)25mg/kg，每日1次，连续7日。
(2)分组实验
设置健康昆明小鼠作为空白组。参照上述的第一贫血模型小鼠建立及分组实验过程中，按照20g/kg体重的剂量灌胃上述实施例1～14和对比例1～6制得的固体颗粒制剂配制成的50mg/mL的水溶液，连续给药10日，以作为第三给药组。
实验完成后，各组小鼠测定脾重，计算脾重指数，脾重指数＝脾重/体重×100％。
各组动物连续灌胃给药10d，于给药第3天各鼠腹腔注射2％的鸡红细胞悬液0.2mL每只，末次给药后1h摘眼球取血20μL每只，加于1mL生理盐水中摇匀，再加5％鸡红细胞悬液0.5mL，冰浴中加进下小鼠补体(CH50，制备方法参照“广州医药1999，01.22公开，小鼠不提C3抗血清的制备”)0.5mL，置37℃水浴中温育30min冰箱中终止反应，取上清液1mL，加进3mL都氏试剂中，静置10min，在540nm波长下比色，读取吸光度(OD)。
各组动物于给药第1天，于小鼠颈部脱毛皮肤滴0.5mL二硝基氯苯(DNCB)-丙酮溶液2μL每只致敏，连续给药10d，于末次给药前1天在小鼠腹部脱毛区皮肤上滴0.025g/mL二硝基氯苯-丙酮溶液20μL每只进行攻击，24h后每鼠尾静脉注射质量分数1％的伊文思蓝10mL/kg，30min后处死小鼠，取腹部蓝染皮肤于试管中剪碎，用1:l丙酮生理欲水混合液浸泡24h，2000rpm离心10min，取上清液于610nm处测定吸光度。
各组动物连续灌胃10d，于末次给药后1h每鼠尾静脉注射印度墨汁0.2mL，于注射后30s及5min分别以微量吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血20μL每只，并立刻吹入2mL体积分数0.1％的碳酸钠溶液中，另取等量正常小鼠血液校零，在分光光度仪675nm处读取吸光度，并按K＝(lgC1－lgC2)公式求出吞噬指数(K)。
6、统计学分析
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
表4
表5
表4列出了采用盐酸苯肼进行贫血造模实验的相关结果。表5列出了采用辐射进行贫血造模实验的相关结果。表4和表5中，进行对每一列数据进行多重比较，以统计其间的显著性差异。
表4可知，相对于正常组，第一模型组的RBC、HGB和WBC指标均显著低于正常组，说明造模成功。而相对于模型组，实施例1～14提供的供试品给药后，小鼠RBC、HGB和WBC指标均由显著提升，尤其是实施例12～14提供的供试品，说明对小鼠给药本申请实施例提供的阿胶肽-铁螯合物为基础制得的固体颗粒制剂，能够改善小鼠化学诱导贫血症状。
另外，表4中，对比例1给药小鼠的供试品为市售阿胶粉制得的固体颗粒制剂，其对模型小鼠的贫血改善功能有限，而对比例2～4给药小鼠的供试品均为本申请实施例在制备过程得到的阿胶肽混合物，虽然对模型小鼠的贫血具有改善作用，但效果均劣于实施例1～14。
表5可知，相对于正常组，第二模型组的RBC、HGB和WBC指标均显著低于正常组，说明辐射贫血模型小鼠造模成功。而相对于模型组，实施例1～14提供的供试品给药后，小鼠RBC、HGB和WBC指标均由显著提升，尤其是实施例12～14提供的供试品，说明对小鼠给药本申请实施例提供的阿胶肽-铁螯合物为基础制得的固体颗粒制剂，能够改善小鼠辐射诱导贫血症状。另外，对比例1～5表现了与表4中相同的趋势，对模型小鼠的贫血具有改善作用有限。
表6
表6列出了各组小鼠的脾重指数、溶血素水平，DNCB诱导OD值和吞噬指数，每列数据均每一列数据进行多重比较，以统计其间的显著性差异。
由表6可知，相对正常组，第一模型组小鼠的脾重指数、溶血素水平，DNCB诱导OD值和吞噬指数均显著低于正常组。而相对于模型组，第三给药组中，实施例1～14提供的供试品给药后，小鼠RBC、HGB和WBC指标均由显著提升，尤其是实施例12～14提供的供试品，说明对小鼠给药本申请实施例提供的阿胶肽-铁螯合物为基础制得的固体颗粒制剂，能够限制提升小鼠的脾重指数、溶血素水平，DNCB诱导OD值和吞噬指数，提示这些固体颗粒制剂具有免疫增强功能。
而对比例1给药小鼠的供试品为市售阿胶粉制得的固体颗粒制剂，其对模型小鼠的免疫增强改善功能有限，而对比例2～4给药小鼠的供试品均为本申请实施例在制备过程得到的阿胶肽混合物，虽然对模型小鼠具有免疫增强作用，但效果均劣于实施例1～14。
综上所述，本申请实施例通过对阿胶进行二次开发，利用酶解、凝胶色谱和制备色谱技术，得到11种分子量低于3000的阿胶肽，并以此制得了阿胶肽-铁螯合物。该阿胶肽-铁螯合物不仅具有较好的稳定性，适应高湿环境，还通过动物实验证实了以该阿胶肽-铁螯合物制得的固体颗粒制剂不能能够改善化学诱导型贫血和辐射诱导贫血，还能够同时增强小鼠免疫机能，为进一步提升和开发与阿胶相关保健功能产品，以应用于补齐、养血、安胎等应用领域提供了广泛的前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 清枫链食苏打饮品（吉林）有限公司
<120> 阿胶肽及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用
<141> 2022-05-17
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Lys Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Arg
20 25
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Pro Cys Gly Ser Cys Trp
1 5 10 15
Ala Phe Ser Ala Thr Gly Ala
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Asn Asp Thr Gly Phe Leu Asp Ile Gln Gln Gln Glu Lys Phe Leu Met
1 5 10 15
Glu Ala Val Ala
20
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ser Cys Trp
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gln Val Met Asn Gly Leu His Asn Gln Thr His Lys Lys Gly Arg
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Leu Cys Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln Asn Gln Lys His Lys Lys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Pro Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Arg Lys Thr Gly Lys Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp
1 5 10 15
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Arg Gln Val Met Asn Gly Leu His Asn Gln Thr His Lys Lys Gly Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Leu Cys
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种阿胶低聚肽及其组合物，包括具有如SEQ ID NO.1～11所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。
2.一种阿胶肽-铁螯合物，其特征在于，由SEQ ID NO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成。
3.一种阿胶肽制剂，其包含由SEQ ID NO.1～11所示的至少一种的阿胶肽与铁原子或铁离子通过螯合作用形成的阿胶肽-铁螯合物，以及保健学上可接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的阿胶肽制剂，其特征在于，保健学上可接受的辅料包括果粉、稀释剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂和食用香精。
5.一种如权利要求1所述的阿胶低聚肽及其组合物的制备方法，其特征在于，包括：
获得阿胶烊化液；
获得阿胶酶解液，所述酶解液由所述阿胶烊化液经由第一次酶解、脱脂、第二酶解和第三次酶解制得；其中，所述第一次酶解使用了脂肪酶，所述第二次酶解使用了糖基肽酶，所述第三次酶解使用了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；
对所述阿胶酶解液进行凝胶色谱层析和反相制备色谱纯化，得到所述阿胶低聚肽及其组合物。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一次酶解的具体步骤包括：
取阿胶烊化液，加入脂肪酶致使其浓度为5～15U/mL，温度40℃下搅拌处理90min后，于水浴100℃灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩得到浸膏。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂的具体步骤包括：
将所述浸膏混入至石油醚中，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为35W/L，搅拌充分混匀后，静置10min后，去除石油醚，得经石油醚处理后的固体物；再次加入乙酸乙酯搅拌充分混合后，超声处理10min，超声处理条件为25℃，超声功率密度为15W/L范围，去除乙酸乙酯，得到脱脂物。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二次酶解的具体步骤包括：
取所述脱脂物溶于水中，加入糖基肽酶E-EF01、E-EF02和E-EF03，温度42℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃灭酶，8000rpm离心30min后取上清，以95％乙醇水溶液浸提48h并浓缩得到浸膏。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第三次酶解的具体步骤包括：
将所述第三次酶解的浸膏加入至含有800～1200U木瓜蛋白酶和100～300U胰蛋白酶的pH＝7.5的PBS缓冲液中，于40℃下搅拌处理180min后，于水浴100℃处理15min进行灭酶，8000rpm离心30min后取上清，得到最终的酶解液。
10.权利要求1所述的阿胶低聚肽及其组合物、权利要求2所述的阿胶肽-铁螯合物或权利要求3所述的阿胶制剂在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用。
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