CN117003825A - 阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用 - Google Patents
阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及阿胶技术领域，具体涉及阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用。本发明以阿胶粉为原料，采用环己烷、二氯甲烷进行萃取，萃取后溶液进行胃蛋白酶和胰酶酶解，对酶解后溶液进行超滤和凝胶色谱纯，得到该阿胶特征肽。该阿胶特征肽具有抗氧化能力、铁螯合能力，肠黏膜透过能力，更容易被肠黏膜细胞吸收，进而增强机体对铁的吸收利用率，能够调节模型大鼠KNDy神经元相关基因的表达，提升模型小鼠血清E2、P含量，起到对LPD模型大鼠的内分泌起到调控作用。给予本发明提供的阿胶特征肽，具有孕前的滋补作用，能够用作制备孕前调理膏方的原料，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及阿胶技术领域，具体涉及阿胶特征肽、制备方法、组合物及其在制备孕前调理膏方上的应用。
背景技术
阿胶含明胶、蛋白质、微量元素等多种有效成分，具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫、促进造血功能等多种功效。通常认为在阿胶中起主要功效的化学成分是多肽和蛋白质的混合物。阿胶蛋白需要经蛋白酶降解为小分子肽后才能被吸收，但对于脾胃虚弱、消化能力低下的人群，直接服用阿胶或其制剂不但给胃肠带来较大负担，而且阿胶的功效也得不到充分发挥。因此，通过可控酶解技术将阿胶水解成小分子肽，能够有效增强阿胶的生物利用度。
研究表明，阿胶经酶解产生的生物活性肽，可提升阿胶的药理作用。刘元涛等研究证实，阿胶经酶解后，增强了提高小鼠免疫力的作用。Wu等研究发现，模拟人体消化过程酶解阿胶得到组分A(＜5000Da)和组分B(5000～8000Da)，2种组分均可刺激贫血小鼠造血，且组分A效果优于组分B。虽然关于小分子阿胶提高免疫力、抗氧化、抗疲劳、止血、补血的作用已有报道。然而，长期以来受到技术条件和传统思想的限制，阿胶的很多功效还未得到足够的现代科学理论和实验的证实。
发明内容
对于孕前女性，由于其排卵期紊乱等因素，可能出现黄体发育不良、分泌孕酮（P）、雌二醇（E2）等物质不足或黄体过早退化，使得子宫内膜分泌反应性降低，造成子宫出现异常、不孕和早期流产等严重症状，以此统称为黄体功能不全（LPD）。本发明提供了5种阿胶特征肽，通过试验证实其能够缓解LPD症状，表明这些阿胶特征肽不仅具有补血和转运铁功能，还能作为孕前调理膏方的原料，应用前景广泛。
本发明的目的之一提供一种阿胶特征肽的制备方法，包括：
获得阿胶溶液；
离心取上清液，用环己烷和二氯甲烷依次萃取，分别去除环己烷层和二氯甲烷层，得萃取后溶液；
将所述萃取后溶液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，即得阿胶粗粉；
将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解，收集第一酶解液。
将所述第一酶解液用胰酶酶解，收集第二酶解液。
将所述第二酶解液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，得到阿胶肽粗粉；
将所述阿胶肽粉经凝胶色谱纯化，收集洗脱峰，即可得到所述阿胶特征肽。
在所述的制备方法中，获得阿胶溶液的步骤包括：
将市售的阿胶粉混入用40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80℃水浴30min，得到所述阿胶溶液。
在所述的制备方法中，所述环己烷的用量为所述上清液的1.5倍体积，所述二氯甲烷的用量为去除环己烷层后溶液的2倍体积。
在所述的制备方法中，将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解的步骤包括：
将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万U胃蛋白酶/g阿胶粗粉，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，收集，第一酶解液。
在所述的制备方法中，将所述第一酶解液用胰酶酶解的步骤包括：
将所述第一酶解液用2%的碳酸氢钠调节pH=8，加入2万U胰酶/g阿胶粗粉，42℃水浴3h后，100℃灭酶15min，收集第二酶解液。
在所述的制备方法中，所述第二酶解液经离心后，采用3kDa超滤管进行超滤。
在所述的制备方法中，所述凝胶色谱纯化的条件包括：采用Sephadex G-15作为填料，以去离子水作为洗脱液，上样量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外检测仪波长为220 nm。
本发明的目的之二提供一种采用所述的制备方法制得的阿胶特征肽，所述阿胶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4任一所示。
本发明的目的之三提供采用所述的制备方法制得的阿胶特征肽在制备孕前调理膏方中的应用。
本发明的目的之四提供一种阿胶特征肽组合物，包括如SEQ ID NO.2所示的肽、如SEQ ID NO.3所示的肽和如SEQ ID NO.4所示的肽。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：
本发明以市售阿胶粉为原料，采用环己烷、二氯甲烷进行萃取，萃取后溶液进行胃蛋白酶和胰酶酶解，对酶解后溶液进行超滤和凝胶色谱纯，得到该阿胶特征肽。经体外实验证实这是阿胶特征肽具有抗氧化能力，而仅P1~P5具有较好的铁螯合能力。另外，经外Ussing chamber 吸收实验发现，P2~P4的铁累积转运量高于对照组，表现出了较高的肠黏膜透过能力，更容易被肠黏膜细胞吸收，进而增强机体对铁的吸收利用率，提示本发明提供的阿胶特征肽具有补血功效。
本发明实验例进一步构建LPD模型鼠，采用本发明制得的阿胶特征肽进行干预，结果发现这些阿胶特征肽能够调节模型大鼠KNDy神经元相关基因的表达，提升模型小鼠血清E2、P含量，起到对LPD模型大鼠的内分泌起到调控作用。由此可见，给予本发明提供的阿胶特征肽，具有孕前的滋补作用，能够应用于制备孕前调理膏方，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5的Sephadex G-15层析图谱。
图2为阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7、阿胶特征肽P8的Sephadex G-15层析图谱。
图3为阿胶特征肽P2的二级MS图。
图4为阿胶特征肽P3的二级MS图。
图5为阿胶特征肽P4的二级MS图。
图6为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5、阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7和阿胶特征肽P8的IC50-DPPH结果图，IC50-DPPH代表对DPPH清除率为50%的各阿胶特征肽浓度。
图7为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4、阿胶特征肽P5、阿胶特征肽P6、阿胶特征肽P7和阿胶特征肽P8的IC50-ABTS结果图，IC50-ABTS代表对ABTS清除率为50%的各阿胶特征肽浓度。
图8为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4和阿胶特征肽P5的铁累积转运量结果图，Qn代表铁累积转运量。
图9为阿胶特征肽P1、阿胶特征肽P2、阿胶特征肽P3、阿胶特征肽P4和阿胶特征肽P5的铁转运Papp结果图，Papp表征铁离子透过组织黏膜转运速率。
图10为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠血清中E2含量结果图，E2为雌二醇，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠。
图11为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠血清中P含量结果图，P为孕酮，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠。
图12为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因KISS-1相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，KISS-1为亲吻素基因。
图13为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因GPR54相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，GPR54为亲吻素受体基因。
图14为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因NKB相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，NKB为神经激肽B基因。
图15为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因NK3R相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，NK3R为神经激肽-3受体基因。
图16为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因DYN相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，DYN为强啡肽基因。
图17为阿胶特征肽作用LPD模型大鼠KNDy神经元相关基因KOR相对表达量结果图，LPD模型大鼠为黄体功能不全（luteal phase defect，LPD）的大鼠，KNDy神经元为雌激素敏感神经元，KOR为强啡肽受体基因。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
1、阿胶特征肽的制备
实施例1：实验所用阿胶粉购自山东中膏生命科学集团有限公司。加40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80℃水浴30min，得到阿胶溶液。
8000rpm离心20min，取上清液移入分液漏斗，加入环己烷（用量为上清液的1.5倍体积）震摇5min后弃环己烷层，加入二氯甲（为去除环己烷层后溶液的2倍体积）震摇萃取5min，弃去二氯甲烷层，将萃取后的水层用0.45微孔滤膜过滤后即得萃取后溶液。
将萃取后溶液经过90℃水浴30min，8000rpm离心20min，取上清液加入10kDa超滤管中，以3000rpm离心40min，收集滤液，减压浓缩后，冻干，得到阿胶粗粉。
将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万/g阿胶粗粉的胃蛋白酶，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，收集第一酶解液。
将第一酶解液用2%的碳酸氢钠调节pH=8，加入2万/g阿胶粗粉的胰酶，42℃水浴3h后，100℃灭酶15min，收集第二酶解液。
将第二酶解液8000rpm离心20min，取上清液加入3kDa超滤管中，以3000rpm离心40min，收集滤液，减压浓缩后，冻干，得到阿胶肽粗粉。
将阿胶肽粗粉用去离子水配制成质量浓度为100 mg/mL，经0.45 μm水相过滤后，用凝胶层析柱再次进行分离纯化。预处理的Sephadex G-15（G15120，Sigma-Aldrich）装满2.6 cm×60 cm的玻璃层析柱，以去离子水作为洗脱液，上样量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外检测仪波长为220 nm。如图1所示，通过谱图分别收集各个洗脱峰，命名为P1、P2、P3、P4、P5，冷冻干燥成粉末，即为阿胶特征肽。
对比例1：
实验所用阿胶粉购自山东中膏生命科学集团有限公司。加40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80℃水浴30min，得到阿胶溶液。
8000rpm离心20min，取上清液移入分液漏斗，加入环己烧20mL震摇5min后弃环己烷层，加入二氯甲烷20mL震摇萃取5min，弃去二氯甲烷层，将萃取后的水层用0.45微孔滤膜过滤后即得萃取后溶液。
将萃取后溶液减压浓缩后，冻干，得到阿胶粗粉。
将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万/g阿胶粗粉的胃蛋白酶，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，收集，第一酶解液。
将第一酶解液用2%的碳酸氢钠调节pH=8，加入2万/g阿胶粗粉的胰酶，42℃水浴3h后，100℃灭酶15min，收集，第二酶解液。
将第二酶解液8000rpm离心20min，取上清液加入3kDa超滤管中，以3000rpm离心40min，收集滤液，减压浓缩后，冻干，得到阿胶肽粗粉。
将阿胶肽粗粉用去离子水配制成质量浓度为100 mg/mL，经0.45 μm水相过滤后，用凝胶层析柱再次进行分离纯化。预处理的Sephadex G-15（G15120，Sigma-Aldrich）装满2.6 cm×60 cm的玻璃层析柱，以去离子水作为洗脱液，上样量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外检测仪波长为220 nm。如图2所示，通过谱图分别收集各个洗脱峰，命名为P6、P7、P8，冷冻干燥成粉末，即为阿胶特征肽。
2、阿胶特征肽的LC-MS/MS分析
（1）LC条件
流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液。进样量2 μL，上样流速500nL/min，分离流速300 nL / min 。梯度洗脱条件：0~ 105 min ，95 % ~ 70 % A、 5 %~ 30% B ； 105~110 min ，70%~10% A、30%~90% B；110~112 min，10% A、90% B；112~113 min，10%~95% A、90%~5% B；95% A、5% B保持7 min。
（2）MS条件
离子源喷雾电压 2.2 kV，加热毛细管温度320℃，在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS：扫描范围 m/z 400~1600，扫描分辨率 120000（m/z 200处），离子最大引入时间50ms，自动增益控制（automatic gain control，AGC）设定为1.0×106。MS/MS：扫描分辨率15000，扫描范围m/z 110~2000，最低离子强度50000，离子最大引入时间100 ms，AGC设定为1.0×105，母离子选择设定为1.6 Da。
（3）Proteome Discoverer软件搜库定性分析
通过Proteome Discoverer（version 2.4.0.305）软件应用Sequest HT搜索引擎对质谱原始文件（raw文件）进行搜索。检索参数：无固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸氧化、蛋白N端乙酰化；一级质谱精度1.0×10－5 ，二级质谱精度0.02 Da；Uniprot数据库Equusasinus（Mnemonic: EQUAS）种属；肽段及蛋白假阳性率≤1%；肽段最少包含6个氨基酸。
（4）阿胶特征肽的氨基酸序列结果
对上述得到的P1~P8的阿胶特征肽进行质谱分析和搜库定性分析。MS分析结果显示，检测到的肽段氨基酸数目在4~15个之间，分子质量分布在661.4~2 851.4 Da之间，共来源于6种蛋白。
其中，P2的氨基酸序列为DVWKPVPCQICVCDNGNVLCD，参考序列[Ovis aries]GenBank: KAG5203341.1。P3的氨基酸序列为DDANVVRDRDLEVDTTLK，SEQ ID NO.3所示，参考序列[Ovis aries] GenBank: KAG5203341.1。P4的氨基酸序列为DRGDAGPKGADGAPGKDGVR，SEQ ID NO.4所示，参考序列[Ovis aries] GenBank: KAG5203341.1。
P6的氨基酸序列为GPPGAPGPQGFQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPP，SEQ ID NO.6所示，参考序列为>XP_044795026.1 collagen alpha-1(I) chain isoform X2 [Bubalusbubalis]。P7的氨基酸序列为GASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEA， pH 4.17，参考序列为>XP_052514368.1 collagen alpha-1(I) chain [Budorcas taxicolor]。P8的氨基酸序列为GPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGANGAPGIA，SEQ ID NO.8所示，参考序列为>sp|C0HLG9.1|CO1A1_BRAVA RecName: Full=Collagen alpha-1(I) chain; AltName: Full=Alpha-1 type Icollagen。
3、阿胶特征肽的抗氧化能力
（1）DPPH 自由基清除率测定
取 0.5 mL 待测溶液（分别用去离子水配制的1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL的P1~P8），加入 0.5 mL 的 DPPH 乙醇溶液，充分混匀后，将反应体系置于室温，避光反应 20 min。反应结束后，依次取反应液 200 μL 加入 96 孔板，于 517 nm 下读取吸光度 OD 值，按照下式计算样品对 DPPH 自由基的清除率。每个样品重复三次，取平均值。
DPPH自由基清除率(%)=［(C1－C2)－(T1－T2)］/(C1－C2)×100%
式中：C1:空白有DPPH体系吸光度值；C2:空白无DPPH体系吸光度值；T1:样品组有DPPH体系吸光度值；T2:样品组无DPPH体系吸光度值。
并根据不同浓度待测溶液对应的DPPH自由基清除率绘制清除曲线，根据该清除曲线估算DPPH自由基清除率达到50%时所需的待测溶液浓度（IC50-DPPH）。结果如图6所示，P1~P8均具有DPPH自由基清除效果，P4的清除效果略优。
（2）ABTS 自由基清除率测定
取 10 μL 待测溶液（分别用去离子水配制的1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL的P1~P8），加入 0.2 mL ABTS 溶液，摇匀后，室温孵育2~6 min后，于 734 nm 下读取吸光度 OD 值，按照下式计算样品对 ABTS 自由基的清除率。每个样品重复三次，取平均值。
ABTS 自由基清除率( % ) =[(C1 －C2 )－( T1 －T2) ]/( C1 －C2 ) × 100%
式中: C1 : 空白有 ABTS 体系吸光度值； C2 : 空白无 ABTS 体系吸光度值；T1 : 样品组有 ABTS 体系吸光度值； T2 : 样品组无 ABTS 体系吸光度值。
并根据不同浓度待测溶液对应的ABTS自由基清除率绘制清除曲线，根据该清除曲线估算ABTS自由基清除率达到50%时所需的待测溶液浓度（IC50-ABTS）。结果如图7所示，P1~P8均具有ABTS自由基清除效果，P4的清除效果略优。
4、阿胶特征肽的铁螯合能力测定
利用邻菲罗啉比色法测定阿胶特征肽的铁螯合能力。10μg/mL的Fe2+作为标准液，设定梯度浓度为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00μg/mL。向Fe2+溶液中依次加入1mL0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0），20mg/mL的抗坏血酸200μL，充分混匀后加入5mg/mL的邻菲罗啉溶液400μL制得工作显色液。静置反应15min。超纯水作为空白对照，用96孔板和酶标仪测定反应液在510nm处的吸光值，根据Fe2+浓度和吸光值绘制标准曲线，y=0.1079x+0.0022，R2=0.997。
将分离得到的阿胶特征肽（P1~P8）分别用超纯水配制成质量分数为4%的多肽溶液，调节pH 至5.5，肽与Fe2+的质量比为 4:1，为防止氧化，向 Fe2+溶液中加入1%的抗坏血酸溶液，充分混合后在 37 ℃下振荡螯合 30 min，在6000r/min下离心15min，取1mL上清液按照标准液的操作步骤依次加入工作显色液，并测定其510nm处的吸光值，代入标准曲线计算出上清液中溶解的铁含量，其中肽的螯合铁含量=（添加铁含量－上清液铁含量）/肽质量。结果可知，P1肽的螯合铁含量在35.42µg/mg，P2肽的螯合铁含量在38.19µg/mg，P3肽的螯合铁含量在40.25µg/mg，P4肽的螯合铁含量在41.09µg/mg，P5肽的螯合铁含量在37.73µg/mg。P6肽、P7肽和P8肽未检出的铁螯合物。由此说明，P1~P5肽具有螯合铁的能力。
3、阿胶特征肽的体外 Ussing chamber 吸收实验
（1）溶液制备
SDF 电解质储备液：含37.3g/L的KCl、68.0g/L的KH2PO4、84.0g/L的NaHCO3、30.5g/L的MgCl2、48.0g/L的（NH4)2CO3。
膳食铁溶液：根据中国居民膳食微量元素铁的参考摄入量（12 mg/d），将FeSO4 溶解在 SDF 电解质储备液中，配制成1.50 mg/mL的膳食铁溶液。
阿胶铁混合液：称取5.00 g阿胶特征肽（P1~P5）与 4.00 mL 膳食铁溶液混合，加入 25 μLCaCl2溶液和 975 μL 超纯水，37 ℃下恒温振荡 2 min，得阿胶铁混合液。
吸收样品液：将阿胶铁混合液用无水乙醇洗涤多次，以去除游离铁，并参照上述方法测螯合铁含量，然后用Krebs-Ringer缓冲液将阿胶铁混合液稀释至螯合铁浓度为100.0μg/mL，以FeSO4 溶液作为对照组（浓度为100.0 μg/mL）。
（2）Ussing chamber 吸收实验
将健康的 SD 大鼠（货号HR0009，华阜康）禁食 12 h 后乙醚麻醉，立即剥离出十二指肠5~10 cm，为保持其活性，用生理盐水冲洗残留物后置于预冷的Krebs-Ringer 缓冲液中，并将其剪成 2 cm 的小段，用镊子除去浆膜和部分肌肉层。然后将制备好的肠黏膜固定在组织夹板上并安装在灌流小室中，暴露的有效透过面积为 0.50 cm2 。向尤斯室的两侧各加入 5.00 mL 37℃预热的缓冲液，37 ℃下持续通入 95% O2 和 5% CO2 的循环气体，平衡 30 min，使肠黏膜达到稳定状态。平衡结束后，分别在黏膜侧和浆膜侧各加入 5.00mL 37℃的待测样品溶液和新鲜的 Krebs-Ringer 溶液。吸收实验开始后，分别在 0、15、30、60、90、120 min 收集 1.00 mL 浆膜样品以测定铁累积转运量，同时在每个取样点的浆膜侧补加等体积的缓冲液，以维持两侧平衡。120 min 吸收实验结束后，收集黏膜侧的溶液，以测定铁累积吸收量和吸收率。
对收集的溶液进行微波消解（1600W、120℃升温时间12min、恒温时间5min；1600W、160℃升温时间6min、恒温时间10min;1600W、180℃升温时间6min、恒温时间15min），并使用ICP-MS 测定溶液中的铁含量。其中，铁累积转运量Qn和表观渗透系数（Papp）的计算方法分别如下：
，/>
其中：Qn 表示铁累积转运量，单位（μg）；1 和 5 分别代表从浆膜侧收集的 1.00mL溶液和两侧的加样溶液 5.00 mL；Cn 是各时间点浆膜侧溶液的Fe2+浓度。
其中：Papp表示表观渗透系数，单位（cm/s）；dQ/dt表示累积转运量 Q对时间 t 的斜率；A为组织有效透过面积（0.50 cm2）；C0 为黏膜层加入溶液的初始 Fe2+浓度（μg/mL）。
（3）结果
Ussingchamber模型可以在体外模拟药物透过肠壁被机体吸收的情况，已被广泛用于金属肽复合物和矿物质的模拟吸收研究中。本实验例利用Ussingchamber模型评价阿胶消化产物被肠上皮细胞吸收的能力。结果如图8所示，P2、P3、P4的铁累积转运量高于对照组，P1和P5的铁累积转运量与对照组相当。
Papp是表征化合物透过组织黏膜能力的重要指标。图9示出了对照组、P1、P2、P3、P4、P5的Papp结果，P2、P3、P4的Papp高于对照组，P1和P5的Papp与对照组相当。Papp的差异说明，不同形式的铁离子均具备透过肠黏膜被吸收的能力，但铁存在形式和铁含量的不同会对铁的转运行为产生影响。在本实验例中，P2~P4阿胶特征肽螯合铁离子表现出了较高的肠黏膜透过能力，更容易被肠黏膜细胞吸收，进而增强机体对铁的吸收利用率，提示本发明提供的阿胶特征肽具有补血功效。
4、阿胶特征肽作为孕前调理膏方的应用前景研究
（1）供试品
P1、P2、P3、P4、P5分别用去离子水配制成2g/mL的溶液，4℃保存。另外配制一供试品溶液（注为P2+P3+P4），含0.2g/mL的P2、0.8g/mL的P3和1.0g/mL的P4，亦作为供试品溶液。
米非司酮片（上海新华联制药有限公司，国药准字H10950202，25 mg/片）。地屈孕酮片（荷兰 Abbott Biologicals B. V. ，国药准字H20130110，10 mg/片）。
（2）动物分组、造模及给药
将雌性SD大鼠（货号HR0009，华阜康）适应性喂养1周后，用随机数字表法将动物分为空白、模型、给药组，每组6只。于每日上午8：00对各组大鼠行阴道脱落细胞图片（阴道涂片）观察，记录各组大鼠动情周期变化。
LPD模型大鼠的构建与给药，采用米非司酮诱导LPD，持续造模。上午8：00阴道涂片确认大鼠进入动情期，当日上午10：00，空白组给予生理盐水（1mL/100g）灌服，其他组给予米非司酮（1mg/100g）灌服；下午15：00，空白、模型组给予生理盐水（1mL/100g）灌服，给药组分别给予P1、P2、P3、P4、P5的溶液1.2g/100g体重灌服，阳性组给予地屈孕酮0.21mg/100g体重灌服；第2日上午10：00再次灌服各组相应药物或生理盐水，此为第1动情周期全部造模与给药。第2动情周期造模方法同第1动情周期。第3动情周期，上午10：00各组均不给予米非司酮，以生理盐水（1mL/100g）替代；下午15：00各组灌服各组相应药物或生理盐水。次日处死大鼠，留取腹主动脉血清、下丘脑组织标本备用。
（3）大鼠血清E2、P水平检测
采用ELISA法（雌二醇（E2)ELISA试剂盒， 武汉赛培生物科技有限公司；孕酮（PROG)ELISA检测试剂盒，抚生生物）进行检测，取大鼠血清，按照说明书稀释后备用，配置标本稀释液、标准品及洗涤液，依次进行布孔、加样、洗板、孵育一抗、洗板、加入酶标抗体工作液、洗板、加入底物工作液、终止反应，最后用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度（A）值。
图10示出了各组大鼠血清的E2含量，图11示出了各组大鼠血清孕酮含量。结果可知，与空白组比较，模型组血清E2、P水平均降低，说明造模成功。与模型组相比，给药组（P1、P2、P3、P4、P5、P2+P3+P4）组大鼠血清E2、P水平均升高。米非司酮造模后的 LPD 大鼠血清E2、P 均有下降趋势，与临床 LPD 患者的E2、P 分泌不足特点相符。给予供试品后，LPD模型大鼠的血清 E2、P亦得到不同程度升高，表明本发明提供的阿胶特征肽对LPD模型大鼠的内分泌起到调控作用，具有作为孕前调理产品的应用前景。
（4）大鼠下丘脑KNDy神经元相关基因的表达检测
采用实时荧光定量PCR进行检测。TRIZOL试剂提取大鼠下丘脑组织的总RNA，测量RNA浓度并计算体系，采用5X All-In-One RT Maste rMix对RNA进行逆转录后，用EvaGeen2X qPCR MasterMix在Quant Studio7 flex system中进行定量PCR（20μL体系含cDNA2μL）。反应条件：95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环。KNDy神经元相关引物由上海生工生物公司设计提供，内参选用GAPDH，以2-△△Ct法计算相关基因相对表达量。
大鼠KNDy神经元相关前后引物序列分别如下：
KISS-1-F：gctgctgcttctcctctgtgtg，SEQ ID NO.9所示；KISS-1-R：ccacctgcctcctgccgtag，SEQ ID NO.10所示；
GPR54-F：cgtcaactacatccagcaggtctc，SEQ ID NO.11所示；GPR54-R：agcagcggcagcaggtatagg，SEQ ID NO.12所示；
NKB-F：cagggtgggaggctcagtaagg，SEQ ID NO.13所示；NKB-R：gtgtctggttggctgttcctcttg，SEQ ID NO.14所示；
NK3R-F：gcatttcgctggtgtcctttcatc，SEQ ID NO.15所示；NK3R-R：atgtggtggaggcagatttggaac，SEQ ID NO.16所示；
KOR-F：ggtgggcttagtgggcaattcc，SEQ ID NO.17所示；KOR-R：cagggtggcacacggcaatg，SEQ ID NO.18所示；
DYN-F：cagactgcctgtccttgtgttcc，SEQ ID NO.19所示；DYN-R：cttggtcagttccgtgtagccttc，SEQ ID NO.20所示；
GAPDH-F：ggcaccgtcaaggctgagaac，SEQ ID NO.21所示；GAPDH-R：ggtggcagtgatggcatggac，SEQ ID NO.22所示。
本实验例进一步对各组大鼠KNDy神经元相关基因表达量进行RT-PCR检测，图9~12依次示出了大鼠KNDy神经元相关基因KISS-1、GPR54、NKB、NK3R、DYN和KOR的相对表达量。由图12~17可知，模型组大鼠大鼠KNDy神经元相关基因KISS-1、GPR54、NKB、NK3R、DYN和KOR的相对表达量均显著低于空白组，说明造模成功。与模型组相比，给药LPD模型大鼠不同的供试品和阳性药物地屈孕酮后，各组大鼠KNDy神经元相关基因KISS-1、GPR54、NKB、NK3R、DYN和KOR的相对表达量均有不同程度的上升。并且，给药组中，P2、P3、P4和P2+P3+P4分别给予LPD模型大鼠后，其KNDy神经元相关基因KISS-1、GPR54、NKB、NK3R、DYN和KOR的相对表达量上升量较高，并且P2+P3+P4组别的KNDy神经元相关基因相对表达量最高。由此说明，将本发明提供的阿胶特征肽及其组合物给予LPD模型大鼠，能够调节模型大鼠KNDy神经元相关基因的表达。
具体而言，GnRH脉冲是由少数KNDy神经元上的NKB触发的，NKB分泌增多会引起Kisspeptin释放，Kisspeptin可以刺激下游GnRH神经元分泌；NKB在刺激Kisspeptin分泌的同时也激活DYN释放，当DYN分泌量达到一定水平后，开始抑制Kisspeptin，也可以直接抑制GnRH，直到完全中止GnRH的分泌活动；而DYN对KNDy神经元与GnRH神经元的抑制也将抑制DYN本身，这将会引起少量神经元上NKB的释放，从而触发下一个GnRH脉冲。而本发明提供的阿胶特征肽及其组合物能够作用于下丘脑KNDy神经元，对LPD的内分泌起到调控作用。
可见，给予本发明提供的阿胶特征肽及其组合物，具有孕前的滋补作用，能够应用于制备孕前调理膏方，具有广泛的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阿胶特征肽的制备方法，其特征在于，包括：
获得阿胶溶液；
离心取上清液，用环己烷和二氯甲烷依次萃取，分别去除环己烷层和二氯甲烷层，得萃取后溶液；
将所述萃取后溶液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，即得阿胶粗粉；
将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解，收集第一酶解液；
将所述第一酶解液用胰酶酶解，收集第二酶解液；
将所述第二酶解液经离心、超滤、离心、浓缩和冻干，得到阿胶肽粗粉；
将所述阿胶肽粉经凝胶色谱纯化，收集洗脱峰，即可得到所述阿胶特征肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，获得阿胶溶液的步骤包括：
将市售的阿胶粉混入用40倍量（40mL:1g）的含1%碳酸氢铵溶液，超声30min后，80℃水浴30min，得到所述阿胶溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环己烷的用量为所述上清液的1.5倍体积，所述二氯甲烷的用量为去除环己烷层后溶液的2倍体积。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述阿胶粗粉用胃蛋白酶酶解的步骤包括：
将阿胶粗粉用1%的磷酸溶液配制成pH=2的样品液，加入10万U的胃蛋白酶/g阿胶粗粉，42℃水浴2h后，100℃灭酶15min，收集，第一酶解液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述第一酶解液用胰酶酶解的步骤包括：
将所述第一酶解液用2%的碳酸氢钠调节pH=8，加入2万U胰酶/g阿胶粗粉，42℃水浴3h后，100℃灭酶15min，收集第二酶解液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二酶解液经离心后，采用3kDa超滤管进行超滤。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱纯化的条件包括：采用Sephadex G-15作为填料，以去离子水作为洗脱液，上样量5 mL，流速1.0 mL/min，紫外检测仪波长为220 nm。
8.一种采用权利要求1~7任一所述的制备方法制得的阿胶特征肽，其特征在于，所述阿胶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4任一所示。
9.采用权利要求1~7任一所述的制备方法制得的阿胶特征肽在制备孕前调理膏方中的应用。
10.一种阿胶特征肽组合物，包括如SEQ ID NO.2所示的肽、如SEQ ID NO.3所示的肽和如SEQ ID NO.4所示的肽。
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| CN111073944A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-28 | 江南大学 | 一种基于Caco-2细胞模型的活性肽定向制备方法 |
| CN114891849A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-12 | 清枫链食苏打饮品(吉林)有限公司 | 阿胶肽及其在制备补气、养血或安胎相关保健制品中的应用 |
-
2023
- 2023-09-04 CN CN202311131900.5A patent/CN117003825B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117003825B (zh) | 2024-01-12 |
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