CN114891064B - 一种多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽，其氨基酸序列为：DPFRHY，本发明还公开了该多肽在化妆品、胶原多肽口服液、多肽纤维、防晒衣上的应用。本发明多肽具有良好的UVB损伤修复活性，可以提高UVB辐射L929细胞成活率，可降低L929细胞内ROS含量，修复UVB造成的DNA损伤，可抑制caspsae‑3和caspase‑8表达，有效缓解和减少UVB诱导细胞凋亡。

Description

一种多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽。

背景技术

皮肤衰老是自然的进程,每个人都无法避免,导致衰老的原因也是很复杂的。80%的皮肤老化都源于光老化。

现有的对抗光损伤的方法主要有：第一是采用遮挡物，如太阳伞，防晒帽，防洒衣等将皮肤与直接照射的UV隔绝；第二是软防晒，包括涂沫防晒霜、防晒喷雾、防晒化妆品等，现有的一些化妆品中会加入天然的抗氧化剂来达到间接防晒的效果，比如维生素C/E、茶多酚、芦荟等植物提取物，具有对抗和修复光损伤的作用；第三是修复光损伤，光拐伤加重皮肤屏障受损，因此需要帮助身体去修复光损伤。

海洋生物因长期生活在高压、高盐、低温等极端环境中，产生了许多特有的结构新颖、高效低毒的生物活性物质，目前已分离鉴定的海洋生物活性物质主要有多糖类、多肽类、萜类、皂苷类、不饱和脂肪酸类等。我国拥有丰富的海洋蛋白质资源，但利用率不高。如何更高效利用海洋多肽，开发新产品的研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽，具有良好的UVB损伤修复活性，可应用于制备抗UVB辐射的产品中。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了一种多肽，其氨基酸序列为：DPFRHY。

本发明还公开了一种化妆品，包括上述的多肽。

优选的，所述的多肽的浓度为15.5-62.5 μg/mL。

本发明还公开了一种胶原多肽口服液，包括上述的多肽。

本发明还公开了一种多肽纤维，采用以下步骤制备：

S1.将权利要求1所述的多肽与溶剂混合制备成可纺丝溶液，所述的多肽的重量比例为5%～40%，溶剂为六氟异丙醇。

S2.将可纺丝溶液进行纺丝及后处理，得到多肽纤维。

本发明还公开了一种防晒衣，采用上述多肽纤维制备而成。

本发明具有如下有益效果：

本发明多肽从鲟鱼鱼皮中提取得到，具有良好的UVB损伤修复活性，可有效缓解UVB诱导细胞凋亡，可应用于化妆品的原料中，用于制备化妆品，或可应用于制备多肽纤维、防晒衣以对抗UVB光损伤。

附图说明

图1是本发明多肽的HPLC色谱图。

图2是本发明多肽的质谱图。

图3是本发明多肽对UVB暴露L929细胞活性的影响的实验结果。

图4是本发明多肽降低L929细胞内ROS含量的实验结果。

图5是本发明多肽对UVB诱导L929细胞DNA损伤的实验结果。

图6是本发明多肽减少UVB辐射L929细胞凋亡的实验结果。

图7是本发明多肽对UVB诱导L929细胞内caspase蛋白影响。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例一

本发明公开了一种多肽，其由鲟鱼鱼皮中提取得到，提取方法如公开号为CN113527467A的专利中记载，经过测序得到本发明多肽的氨基酸序列为：DPFRHY（如SEQ IDNO:1所示）。

采用Fmoc固相方法合成本发明多肽，使用HPLC和MALDI-TOF-MSMALDI-TOF对合成多肽纯度和分子量进行鉴定。如图1所示，HPLC鉴定DPFRHY的纯度达98.126%。如图2所示，经MALDI-TOF-MSMALDI-TOF确定相对分子质量为833.40。

采用Isoelectric Point Calculator 2.0、ToxinPred、innovagen和SwissADME等网络服务器对DPFRHY的等电点、潜在毒性、溶解性、胃肠道吸收性、血脑屏障穿透性等理化性质进行分析。经预测DPFRHY等电点为7.1，无毒性，易溶于水，胃肠吸收率低，不可透过血脑屏障。

本发明多肽具有抗光损伤的性能，具体实验过程如下详述。

1、DPFRHY对UVB暴露L929细胞活性的影响

（1）实验过程：取生长状态良好的L929细胞按密度为1×105 cfu/mL接种到96孔细胞板中，每孔100 μL完全培养基（RPMI1640含10%FBS和1%双抗）过夜培养。待细胞贴壁完全后，吸弃培养基，加入L929不完全培养基（RPMI1640含3%FBS和1%双抗），培养箱中饥饿培养12 h。吸弃96孔板中培养基，加入PBS清洗残留培养基，随后加入20 μL PBS浸没细胞并在紫外辐照仪进行UVB辐照（40 mJ/cm2）。照射后加入含不同浓度DPFRHY多肽（0-125 μg/mL）的不完全培养基培养24 h。以未照射UVB组为对照组。随后进行细胞活性检测，方法参照CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒（Promega,Madison, WI, USA）说明书。

（2）实验结果：如图3所示，与UVB照射组相比较，孵育DPFRHY组在用药浓度为31.25和62.5 μg/mL时，细胞活性具有显著性差异，因此DPFRHY表现出良好的UVB损伤修复活性，可以提高UVB辐射L929细胞成活率。

2、L929细胞ROS含量测定

（1）实验过程：将L929细胞接种至96孔细胞板，经培养过夜并饥饿处理12 h后，用37℃预热的PBS洗涤2次，每孔加入100 μL终浓度为20 μmol/L DCFH-DA的无酚红RPMI1640培养基（不含血清），避光孵育30 min。弃去培养基，100 μL PBS重复洗涤3次，加入20 μLPBS并进行UVB紫外辐射（100 mJ/cm2）。弃去PBS，加入含不同浓度DPFRHY多肽（0-62.5 μg/mL）的不完全培养基，将96孔板置于细胞培养箱中孵育1h后，488 nm处激发、525 nm处发射，酶标仪检测荧光值。

（2）实验结果：本实验通过DCFH-DA荧光探针考察其清除细胞内ROS能力。实验结果如下图4所示，UVB可诱导L929细胞内ROS含量，15.525～62.5 μg/mL DPFRHY表现显著的ROS清除活性，并呈现良好的剂量效应关系，可见本发明多肽可降低L929细胞内ROS含量。

3、L929细胞彗星实验

单细胞凝胶电泳又称彗星实验，可用来检测DNA损伤。

（1）实验过程：L929细胞接种至6孔细胞板，经培养过夜并饥饿处理12 h后，加入PBS清洗残留培养基，随后加入20 μL PBS浸没细胞并在紫外辐照仪进行UVB辐照（40 mJ/cm2）。照射后加入含不同浓度DPFRHY多肽（ 0-62.5 μg/mL）的不完全培养基培养24 h。以未照射UVB组为对照组。设置a-e五个组，分别是：a：正常组；b：UVB模型组；c：UVB+DPFRHY（15.625 μg/mL）；d：UVB+DPFRHY（31.25 μg/mL）；e：UVB+DPFRHY（62.5 μg/mL）。

彗星实验参照Comet Assay Kit（Cell Biolabs）说明书。将试剂盒中琼脂糖90-95ºC水浴20 min，直至琼脂糖变为液体状，将其转移至37 ºC水浴锅备用。3孔载玻片中每孔加入75 μL琼脂糖，水平放置玻璃片于4 ºC，冷却15 min至琼脂糖凝固为底层。细胞刮刮下细胞，将细胞悬浮液转移至4mL离心管中，预冷PBS洗涤细胞，配置为1×105cfu/mL细胞悬浮液。以1:10的比例将细胞悬浮液与琼脂糖混合，吸取75 μL细胞混合液于凝固琼脂糖底层上，4 ºC冷却15 min。待凝固后，将载物玻璃片放入预冷的裂解缓冲液中，4ºC浸泡45 min。将载物玻片转移至4 ºC预冷AlkalineSolution，4ºC浸泡30 min。将载物薄片转移至TBE电泳缓冲液中，浸泡5min。取出玻片，置于水平电泳槽中，加入TBE电泳缓冲液淹没玻片，设置电压为35 v，电泳15 min。取出玻片，预冷去离子水浸泡玻片2min，重复2次。将玻片放置70%酒精中，浸泡5min。加入100 μL/孔DNA染料，避光室温反应15 min。荧光显微镜下FITC通道观察结果。

（2）实验结果：在碱性电解质作用下，DNA断裂片段被释放出来，通过凝胶电泳可使被释放的带负电荷DNA片段因分子量小向正极发生迁移，核DNA因分子量大而保持原位，因此在荧光图像中呈现出拖尾现象。DNA发生断裂产生片段越多，拖尾越长。实验结果如图5所示，正常对照组荧光成球形，UVB照射组中出现长而明显的拖尾现象。孵育DPFRHY单肽细胞组与仅UVB辐射组相比较，当用药浓度达到62.5 μg/mL时，细胞拖尾长度明显短于UVB辐射组。实验表明DPFRHY小分子肽可有效修复UVB造成的DNA损伤。

4、Hoechst染色

（1）实验过程：取生长状态良好的L929细胞接种于6孔板中，细胞处理方法同第3点。设置实验组别a-e如下：

a：正常组；b：UVB模型组；c：UVB+DPFRHY（15.625 μg/mL）；d：UVB+DPFRHY（31.25 μg/mL）；e：UVB+DPFRHY（62.5 μg/mL）。

弃去培养基加入1 mL终浓度为10 μg/mL Hoechst染色液进行染色，避光孵育5min。弃去染色液，使用PBS清洗残余染色液，重复3次。加入1mL PBS，荧光显微镜下观察实验结果。

（2）实验结果：Hoechst是一种可穿透细胞膜，对细胞毒性较低的蓝色荧光染料。正常细胞染色后呈现蓝色圆形状，凋亡细胞由于核浓缩，染色后呈现中间亮蓝色点状。UVB是诱导细胞凋亡主要外源性因素，如图6所示正常培养组呈现淡蓝色圆形，UVB照射组呈现密集的亮点，实验表明UVB可诱导细胞启动凋亡。加入DPFRHY单肽孵育细胞后，高浓度加药组和中浓度组亮点明显低于UVB组，低浓度加药组与UVB相比较无明显差异，表明高浓度DPFRHY单肽可有效缓解UVB诱导细胞凋亡。

5、 Western blot检测

（1）实验过程：取生长状态良好的L929细胞接种于6孔板中，细胞处理方法同1.4。收集样品细胞中每管加入300 μL高效RIPA裂解液（含终浓度1mM PMSF），置于冰上裂解30min，每10 min涡旋振荡一次。4 ºC离心20 min，收集上清液，BCA法测定细胞裂解液中蛋白浓度。以SDHA为内参，对目标蛋白Caspase 3（1:1000稀释，ab179517，Abcam）和Caspase 8（1:1000稀释，ab32397，Abcam）进行免疫印迹，二抗为羊抗兔（1:10000，北京全式金生物）使用Tanon全自动化学发光分析系统进行图像采集。

（2）实验结果：caspase-3和caspase-8作为caspase家族中主要成员，是促细胞凋亡重要调控因子。在受到外界胁迫时，细胞中capase-8二聚体可剪切其他促凋亡蛋白前体，caspase-3可随意剪切结构蛋白和功能蛋白，两者共同作用放大细胞死亡信号促进细胞凋亡，故caspase-3和caspase-8活性是细胞凋亡重要标志。

本实验结果如图7所示，当L929细胞暴露于40 mJ/cm2时，与正常对照组相比较UVB促进了caspase-3和caspase-8蛋白表达。当DPFRHY作用于UVB暴露L929细胞后，结果显示L929细胞内caspase蛋白表达量显著降低，表明DPFRHY可有效抑制caspsae-3和caspase-8表达，减少细胞凋亡。

综上，本发明多肽具有良好的UVB损伤修复活性，可以提高UVB辐射L929细胞成活率，可降低L929细胞内ROS含量，修复UVB造成的DNA损伤，可抑制caspsae-3和caspase-8表达，有效缓解和减少UVB诱导细胞凋亡。

实施例二

本实施例公开了一种化妆品，包括实施例一中的多肽。多肽的浓度为15.5-62.5 μg/mL。

实施例三

本实施例公开了一种胶原多肽口服液，包括实施例一中的多肽。本发明多肽由鲟鱼鱼皮中提取得到，稳定性和安全性好。本发明的多肽由6个氨基酸组成，为小分子多肽，更快更容易被吸收。

实施例四

本实施例公开了一种多肽纤维，采用以下步骤制备：

S1.将实施例一的多肽与溶剂混合制备成可纺丝溶液，多肽的重量比例为5%～40%，溶剂为六氟异丙醇。

S2.将可纺丝溶液进行纺丝及后处理，得到多肽纤维。

采用溶液纺丝法进行纺丝，其工序主要为：

（1）将可纺丝溶液进行过滤，脱泡等工序以除去杂质和气泡。

（2）将可纺丝溶液用纺丝泵（或称计量泵）连续、定量而均匀地从喷丝头或喷丝板的毛细孔中挤出而成液态细流。

（3）原液细流在空气、水或凝固浴中凝固成初生纤维。

（4）初生纤维卷装或直接进行后处理。后加工是指对成形后的初生纤维进行一系列后处理加工，使其适应纺织加工和使用的要求，后处理工序有卷绕、拉伸、热松弛、热定形、卷绕、加拈、水洗、脱硫、漂白、干燥等。

实施例五

本实施例公开了一种防晒衣，采用实施例三的多肽纤维制备而成。采用实施例三的多肽纤维，多肽纤维内具有本发明的多肽，制成的防晒衣穿在人身上，从而起到抗紫外线辐射的作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）

<120> 一种多肽及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Pro Phe Arg His Tyr

1 5

Claims (1)

1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：DPFRHY。